尹海辰，許冬，武懷恒，叢勝波，楊甜甜，萬鵬

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)試驗(yàn)室/ 農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點(diǎn)試驗(yàn)室/ 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，武漢 430064）

紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella），屬鱗翅目（Lepidoptera）麥蛾科（Gelechiidae），是世界上十分重要的棉花害蟲之一[1]。21 世紀(jì)以前，紅鈴蟲在我國長江流域棉區(qū)為害十分嚴(yán)重，導(dǎo)致棉花產(chǎn)量損失10%～30%，嚴(yán)重影響了我國棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。 2000 年后，我國長江流域開始種植轉(zhuǎn)cry1Ac基因棉花，使紅鈴蟲的發(fā)生與危害得到了有效抑制[3]。然而，在印度、巴基斯坦等國家，因?yàn)闆]有很好地執(zhí)行庇護(hù)所策略，目前已有紅鈴蟲對(duì)抗蟲棉產(chǎn)生抗性的相關(guān)報(bào)道，例如在印度，紅鈴蟲對(duì)轉(zhuǎn)cry1Ac＋cry2Ab棉的抗性已被證實(shí)普遍存在[4]。因此，開展紅鈴蟲綜合防控技術(shù)研究對(duì)于延緩其抗性發(fā)展具有十分重要的意義。

寄主植物產(chǎn)生的次生代謝物能夠影響昆蟲對(duì)寄主植物的發(fā)現(xiàn)、識(shí)別、定位、取食、產(chǎn)卵等行為[5-8]。 利用這一特性開發(fā)的各種引誘和驅(qū)避技術(shù)，已成為害蟲監(jiān)測(cè)與防治中極具應(yīng)用前景的新技術(shù)[9-10]。充分利用各類植物資源是研發(fā)此類技術(shù)的基礎(chǔ)。 在我國，中草藥是一類重要的植物資源，能產(chǎn)生極其豐富的次生代謝物，是開發(fā)各類昆蟲引誘或驅(qū)避劑的良好原材料。 目前雖未見紅鈴蟲危害中藥材植物的報(bào)道，但已有研究證實(shí)一些中藥材提取物可以引起棉田害蟲如綠盲蝽（Apolygus lucorum）和中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis）的嗅覺反應(yīng)[11]。 本研究以香氣濃郁的4 種中藥材植物花 椒 （Zanthoxylum bungeanum）、 黃 柏（Cortex phellodendri）、云木香（Saussurea costus）、五倍子（Rhus chinensis）的主要藥用部位提取物為對(duì)象，研究了紅鈴蟲對(duì)這些提取物的電生理和嗅覺反應(yīng)， 并選擇鱗翅目害蟲常見引誘劑芳樟醇與這4種中草藥提取物進(jìn)行復(fù)配， 進(jìn)一步提升嗅覺反應(yīng)，以期為紅鈴蟲監(jiān)測(cè)與防治新技術(shù)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種供試中草藥原材料為風(fēng)干的云木香（根）、花椒（果實(shí)）、五倍子（蟲癭）、黃柏（樹皮），均采購自湖北省武漢市中藥材市場(chǎng)。 無水乙醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，芳樟醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）采購自羅恩化學(xué)品試劑公司。

本研究所用的紅鈴蟲采集自湖北省武漢市、鄂州市等地棉田，在室內(nèi)（26±1）℃、光周期（光/暗時(shí)間）16 h/ 8h、相對(duì)濕度60%條件下用人工飼料[12]飼養(yǎng)多代。 觸角電位與嗅覺反應(yīng)試驗(yàn)選用1～3 日齡健康紅鈴蟲成蟲，試驗(yàn)開始前將供試棉鈴蟲（試蟲）饑餓處理4 h。

1.2 儀器

所用觸角電位儀采購自Syntech 公司（德國）， 信號(hào)控制器為IDAC-2， 氣味源控制器為CS-55。

1.3 方法

1.3.1供試中草藥提取物的制備。 中草藥提取物制備方法參考李秀梅等[13]的報(bào)道，并有所改進(jìn)。將風(fēng)干的中藥材用粉碎機(jī)磨制成干粉， 稱取100 g粉末置于250 mL 無水乙醇中室溫密封浸泡15 d后用布氏漏斗過濾，濾去藥渣后獲得上清液。 將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃、20～30 r·min-1條件下水浴加熱蒸干溶劑，獲得提取物，并保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2紅鈴蟲觸角電位圖（electroantennogram,EAG）試驗(yàn)。 試驗(yàn)方法參考董文霞等[14]的報(bào)道，并有所改進(jìn)。 測(cè)定時(shí)用無水乙醇將提取物稀釋為15 g·L-1和1.5 g·L-1，對(duì)照組為無水乙醇。 取15 μL 溶液滴于30 mm×10 mm 的濾紙上，將濾紙塞入1 000 μL 移液槍槍頭中，連接刺激氣體控制裝置。 保持送氣管管口與觸角縱向垂直，并與觸角相距10 mm 左右。用解剖刀從基部切下雌性和雄性成蟲的整個(gè)觸角， 并切除少量觸角尖端。將直徑約0.2 mm 的銀絲電極插入到玻璃毛細(xì)管中， 電極內(nèi)徑注入適量濃度為0.9 mol·L-1的電生理鹽水。 將切下的觸角連接于2 個(gè)電極上，每次刺激時(shí)間為0.5 s，2 次刺激之間間隔30 s，以保證觸角感覺器感覺功能的完全恢復(fù)。 每種提取物與對(duì)照溶液交替刺激觸角，取前后對(duì)照的平均值作為該提取物每次刺激值的對(duì)照值。 雌性和雄性紅鈴蟲各測(cè)試8 根觸角，每根觸角用每種提取物刺激3 次。 采用成蟲對(duì)提取物的觸角電位反應(yīng)幅度除以前后對(duì)照的平均值來計(jì)算EAG 反應(yīng)的相對(duì)值。

1.3.3紅鈴蟲嗅覺反應(yīng)試驗(yàn)。 將2 個(gè)直徑4 cm、高3 cm 的圓形養(yǎng)蟲盒（開口向上）放入長、寬、高分別為20 cm、15 cm、5 cm 的長方形塑料養(yǎng)蟲盒兩端，并在圓形養(yǎng)蟲盒內(nèi)放入1 張濾紙。 將花椒或云木香提取物用30 μL 無水乙醇溶解成糊狀，再用無菌水將其稀釋為15 g·L-1， 將1 mL 提取物溶液加入其中1 個(gè)圓形養(yǎng)蟲盒內(nèi)作為處理組，對(duì)照組為30 μL 無水乙醇用無菌水稀釋為1 mL，加入另一端的圓形養(yǎng)蟲盒內(nèi)。 每日17：00 將20頭雌性或雄性紅鈴蟲成蟲冷昏迷后放入長方形養(yǎng)蟲盒正中間處，為防止養(yǎng)蟲盒兩側(cè)氣味聚集在盒底部相互混合產(chǎn)生干擾，盒頂部用透氣紗布覆蓋，使提取物氣味可以自由揮發(fā)至盒外。 試驗(yàn)在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，次日08：00 觀察記錄成蟲選擇情況，成蟲進(jìn)入裝有某一氣味源的圓形養(yǎng)蟲盒內(nèi)或位于反應(yīng)區(qū)則記為對(duì)該氣味源產(chǎn)生選擇反應(yīng)（圖1）。 為防止氣味源方向或試蟲個(gè)體差異造成的影響，本試驗(yàn)重復(fù)6 次，共計(jì)測(cè)試雌蟲和雄蟲各120 頭，每次重復(fù)均更換一批新試蟲，并更換處理組氣味源與對(duì)照組氣味源方向，每次試驗(yàn)結(jié)束后將養(yǎng)蟲盒用無水乙醇擦洗。

圖1 嗅覺反應(yīng)試驗(yàn)裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of olfactory response experiment device

1.3.4棉花植株對(duì)提取物引誘作用的影響。 選擇1.3.3 試驗(yàn)中篩選出的具有引誘作用的提取物，測(cè)試其在存在寄主植物棉花葉片氣味條件下對(duì)紅鈴蟲的引誘作用。 將2 個(gè)金字塔形養(yǎng)蟲籠（底面25 cm×25 cm，高度40 cm，外部覆蓋透氣紗布）用玻璃管（長20 cm，直徑10 cm）連接（圖2）。 其中1 個(gè)養(yǎng)蟲籠內(nèi)放入1 盆棉花苗期植株，另一籠中放入1 張白色黏蟲板（20 cm×15 cm）。 處理組為提取物按照1.3.3 試驗(yàn)中方法溶解后， 取100 μL于1.5 mL 離心管（EP 管）內(nèi)，對(duì)照組為100 μL 清水， 將裝有提取物或清水的EP 管放置于黏蟲板中心處。 每次試驗(yàn)將10 頭冷昏迷的紅鈴蟲雌蟲或雄蟲放于玻璃管中央處，每個(gè)提取物或?qū)φ战M均重復(fù)試驗(yàn)8 次，共測(cè)試雌蟲和雄蟲各80 頭。 試驗(yàn)在黑暗環(huán)境中進(jìn)行， 每日17：00 開始試驗(yàn)，次日08：00 結(jié)束。 記錄在有寄主植物氣味條件下，帶有提取物的黏蟲板和清水對(duì)照黏蟲板分別誘捕到的紅鈴蟲數(shù)量。

圖2 寄主植物對(duì)提取物引誘效果影響試驗(yàn)裝置示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the device for the influence of host plants on the attractive effect of extracts

1.3.5提取物與芳樟醇不同比例復(fù)配的增效作用。 為了進(jìn)一步提升引誘效果，選擇鱗翅目害蟲常見引誘劑芳樟醇與花椒提取物進(jìn)行復(fù)配。 將花椒提取物配制成15 g·L-1的溶液，與芳樟醇原液按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9（體積比，下同）復(fù)配得到復(fù)配劑，以蜂蜜水為對(duì)照組，進(jìn)行氣味選擇試驗(yàn)，試驗(yàn)方法同1.3.3。

1.3.6紅鈴蟲對(duì)復(fù)配劑、提取物和芳樟醇的嗅覺反應(yīng)試驗(yàn)。 為驗(yàn)證復(fù)配劑增效作用，檢驗(yàn)復(fù)配劑對(duì)紅鈴蟲的引誘作用是否高于2 種單劑， 選擇1.3.5 篩選出的復(fù)配劑分別與花椒提取物和芳樟醇原液2 種單劑進(jìn)行氣味選擇試驗(yàn)，分為復(fù)配劑與花椒提取物、 復(fù)配劑與芳樟醇原液2 類處理。其余方法同1.3.3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

參照周麗梅等[15]方法計(jì)算選擇反應(yīng)率（RSR），公式：RSR（%）＝N1/（N1＋N0）×100%。 式中，N1為處理組氣味源蟲數(shù)，N0為對(duì)照組氣味源蟲數(shù)。

紅鈴蟲對(duì)4 種中藥材提取物的EAG 反應(yīng)相對(duì)值，以及花椒提取物與芳樟醇不同比例復(fù)配劑的RSR采用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法進(jìn)行多重比較。 紅鈴蟲雌雄蟲對(duì)花椒和云木香提取物的嗅覺反應(yīng)， 以及復(fù)配劑增效作用的驗(yàn)證，均采用卡方檢驗(yàn)對(duì)處理組與對(duì)照組蟲數(shù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)處理利用SPSS 17.0 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅鈴蟲觸角EAG 反應(yīng)

由圖3 可知， 當(dāng)氣味源質(zhì)量濃度為15 g·L-1時(shí)， 由花椒提取物引起的雌雄蟲觸角EAG 反應(yīng)相對(duì)值均最高，分別為1.89 和1.56，顯著高于其他提取物引起的雌蟲和雄蟲觸角EAG 反應(yīng)；云木香提取物引起的雄蟲觸角EAG 反應(yīng)相對(duì)值極顯著高于五倍子提取物。

圖3 紅鈴蟲對(duì)4 種中草藥提取物的觸角電位圖（EAG）反應(yīng)相對(duì)值Fig. 3 Relative electroantennogram (EAG) values of P. gossypiella antennas to extracts from four Chinese herbal medicines

經(jīng)方差分析， 當(dāng)氣味源質(zhì)量濃度降低到1.5 g·L-1時(shí)，4 種提取物引起的雌蟲 [F（3, 28）＝1.69＜F0.05（3, 28）＝2.95]和雄蟲觸角[F（3, 28）＝0.97＜F0.05（3, 28）＝2.95）] EAG 反應(yīng)相對(duì)值間均無顯著差異。

2.2 紅鈴蟲嗅覺反應(yīng)

根據(jù)2.1 結(jié)果，選擇EAG 反應(yīng)相對(duì)值較高的花椒和云木香提取物進(jìn)行嗅覺反應(yīng)試驗(yàn)。 經(jīng)卡方檢驗(yàn)，相對(duì)于對(duì)照組，花椒提取物對(duì)紅鈴蟲雌雄蟲均有極顯著的引誘作用（χ2雌蟲＝26.92＞χ20.01＝6.64，χ2雄蟲＝66.28＞χ20.01＝6.64），120 頭供試紅鈴蟲中分別有76 頭雌蟲和89 頭雄蟲選擇了花椒提取物，選擇反應(yīng)率分別為67.26%和76.72%。云木香提取物對(duì)于紅鈴蟲雄蟲具有極顯著的引誘作用（χ2＝44.37＞χ20.01＝6.64），供試雄蟲有84頭選擇了云木香提取物， 選擇反應(yīng)率為71.19%，但雌蟲則對(duì)云木香提取物的嗅覺反應(yīng)不明顯（χ2＝0.442＜χ20.05＝3.84）。

2.3 棉花植株對(duì)提取物引誘作用的影響

根據(jù)2.2 試驗(yàn)結(jié)果， 由于云木香對(duì)紅鈴蟲雌蟲引誘作用不明顯，因此本試驗(yàn)設(shè)置花椒引誘雌蟲、雄蟲以及云木香引誘雄蟲3 個(gè)處理。 在棉花植株氣味干擾下，共有38 頭雌蟲被花椒誘捕，10頭雌蟲被清水對(duì)照誘捕；對(duì)于雄蟲，有42 頭被花椒誘捕，9 頭被清水對(duì)照誘捕。 經(jīng)卡方檢驗(yàn)，相比于清水對(duì)照，花椒提取物具有極顯著的引誘作用（χ2雌蟲＝32.67 ＞χ20.01＝6.64，χ2雄蟲＝42.71 ＞χ20.01＝6.64）。 云木香提取物對(duì)雄蟲也具有顯著的引誘作用（χ2＝25.04＞χ20.01＝6.64），共誘捕了40頭， 而清水對(duì)照僅誘捕到14 頭。 從誘捕數(shù)量來看，2 種提取物與棉花葉片引誘效果相當(dāng)， 因此須篩選具有增效作用的復(fù)配劑， 進(jìn)一步提升提取物引誘效果。

2.4 提取物與芳樟醇不同比例復(fù)配的增效作用

經(jīng)方差分析，花椒提取物與芳樟醇不同配比對(duì)雄性[F（8, 45）＝6.783＞F0.05（8, 45）＝2.15]和雌性紅鈴蟲[F（8, 45）＝5.999＞F0.05（8, 45）＝2.15]的選擇反應(yīng)率有顯著影響。 如圖4 所示，當(dāng)花椒提取物與芳樟醇體積比為7∶3、6∶4、5∶5 時(shí)，雄性紅鈴蟲的選擇反應(yīng)率分別為68.89%、72.22%和70.00%，均顯著高于其他復(fù)配比例。 對(duì)于雌性紅鈴蟲而言， 當(dāng)花椒提取物與芳樟醇體積比為3∶7 和2∶8 時(shí)， 雌性紅鈴蟲的選擇反應(yīng)率高于其他配比， 其中當(dāng)體積比為3∶7 時(shí)最高，為68.55% 。

圖4 花椒提取物與芳樟醇按不同比例復(fù)配后的引誘作用比較Fig. 4 Attractive effect of Z. bungeanum extract mixed with linalool in different proportions

2.5 紅鈴蟲對(duì)復(fù)配劑、提取物和芳樟醇的嗅覺選擇試驗(yàn)

根據(jù)復(fù)配增效試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇對(duì)雌蟲引誘效果最好的和對(duì)雄蟲引誘效果最好的復(fù)配比例，檢驗(yàn)其增效作用。 經(jīng)卡方檢驗(yàn)可知，花椒提取物與芳樟醇復(fù)配劑（3∶7）對(duì)雌蟲的引誘效果均顯著高于單一的花椒提取物（χ2＝6.353＞χ20.05＝3.84）和芳樟醇（χ2＝4.29＞χ20.05＝3.84）；而花椒提取物與芳樟醇復(fù)配劑（6∶4）對(duì)雄蟲的引誘效果則極顯著高于花椒提取物單劑（χ2＝8.96＞χ20.01＝6.64）， 并且顯著高于芳樟醇 （χ2＝4.74＞χ20.05＝3.84）。 表明相比于單劑，2 種復(fù)配比例均具有顯著的增效作用。

3 討論與結(jié)論

篩選對(duì)昆蟲具有嗅覺反應(yīng)活性的植物資源是昆蟲驅(qū)避劑和引誘劑開發(fā)的基礎(chǔ)[16-18]，其中對(duì)一些具有強(qiáng)烈特殊香氣的中藥材植物的研究已取得一些成果。 目前主要研究了此類植物的驅(qū)避活性，例如茆國鋒等[19]研究表明白木香（Aquilaria sinensis） 精油在一定質(zhì)量濃度范圍可對(duì)褐飛虱（Nilaparvata lugens）雌成蟲表現(xiàn)出明顯的驅(qū)避作用；而花椒精油也被證實(shí)對(duì)B 型煙粉虱（Bemisia tabaci）具有驅(qū)避作用[20]。然而本研究結(jié)果表明，云木香和花椒這2 種非寄主中草藥提取物對(duì)紅鈴蟲具有引誘作用。 前人研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲有時(shí)也會(huì)被非寄主植物所吸引，如張獻(xiàn)英等[21]報(bào)道了洋蔥（Allium cepa） 鱗莖揮發(fā)物對(duì)褐飛虱的引誘作用。 Zhang 等[22]則發(fā)現(xiàn)暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）在田間會(huì)被非寄主植物蓖麻（Ricinus communis）所吸引，且蓖麻氣味可提高雌雄成蟲的抱對(duì)率和飛行活動(dòng)能力。 因此，在篩選引誘劑時(shí)，也不應(yīng)忽視一些非寄主植物資源。

根據(jù)前人研究，我們推測(cè)花椒和云木香提取物中的揮發(fā)物與紅鈴蟲寄主植物揮發(fā)物可能存在一定的相似性。 研究表明花椒果實(shí)揮發(fā)物中含有大量的檸檬烯和月桂烯[23]，而這些化合物在許多亞洲棉 （Gossypium arboreum） 和陸地棉（G.hirsutum）中均存在，如石遠(yuǎn)321、SGK321、遼陽多毛棉等，這類化合物還可以引起一些棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、 綠盲蝽等害蟲的電生理反應(yīng)，具有較強(qiáng)的引誘作用[24]。云木香揮發(fā)物中也含有對(duì)棉花害蟲具有吸引作用的鄰苯二甲酸二乙酯[25-26]。 然而，目前有關(guān)中草藥植物揮發(fā)物對(duì)紅鈴蟲引誘作用的研究仍相對(duì)較少，因此未來應(yīng)進(jìn)一步明確云木香和花椒提取物中對(duì)紅鈴蟲有引誘作用的具體有效成分，這對(duì)于這2 種中草藥的開發(fā)與利用具有重要意義。

芳樟醇是一種廣泛存在于植物揮發(fā)物中的化合物，在花椒和棉花揮發(fā)物中也存在，并已發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種害蟲有引誘活性[24-25,27]。例如劉永梅等[28]研究表明10 μL 的50 g·L-1芳樟醇處理可以引起4 齡飛蝗（Locusta migratoria）強(qiáng)烈的電生理反應(yīng)，10 μL 的100 g·L-1芳樟醇處理對(duì)飛蝗雌雄蟲均有顯著的引誘作用；此外，李曉峰等[29]則發(fā)現(xiàn)將芳樟醇與鄰苯二甲酸二丁酯和順-3- 己烯基乙酸酯制成復(fù)配劑對(duì)華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblita）雄成蟲有較好的引誘效果。 將多種引誘劑組合成復(fù)配劑是提高引誘劑引誘效果的重要手段[16]，復(fù)配劑的引誘效果與復(fù)配比例有很大關(guān)系[28,30]。 因此，本研究將花椒提取物與芳樟醇進(jìn)行復(fù)配，并篩選出了最佳復(fù)配比例，在該配比下的嗅覺選擇試驗(yàn)中紅鈴蟲對(duì)復(fù)配劑的選擇性均高于花椒提取物和芳樟醇單劑，這表明添加芳樟醇有助于提升花椒提取物的引誘效果。 此外，這種增效作用、最佳復(fù)配比例與紅鈴蟲性別有關(guān)：復(fù)配劑中芳樟醇比例適當(dāng)升高對(duì)雌蟲引誘效果增強(qiáng)， 配比為3∶7 時(shí)對(duì)雌蟲的引誘效果最強(qiáng)；而復(fù)配劑中花椒提取物比例較高時(shí)則對(duì)雄蟲引誘作用較高， 配比為6∶4 時(shí)對(duì)雄蟲引誘作用最強(qiáng)。 這表明紅鈴蟲雌雄蟲之間存在嗅覺反應(yīng)差異，在寄主選擇過程中對(duì)寄主揮發(fā)物中不同氣味的反應(yīng)各有側(cè)重。 然而目前對(duì)于紅鈴蟲嗅覺機(jī)理的研究較少，對(duì)于該蟲寄主定位過程中究竟哪些化合物發(fā)揮了作用仍不明確，因此這種復(fù)配劑的增效作用原理仍有待研究。

綜上所述，本研究通過一系列室內(nèi)試驗(yàn)初步篩選出了2 種對(duì)紅鈴蟲有較高活性的引誘劑配方，對(duì)紅鈴蟲的防治具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 近年來中草藥植物在農(nóng)業(yè)病蟲害防治領(lǐng)域的作用日益受到關(guān)注[19,31]，本研究的發(fā)現(xiàn)也可為中藥材資源利用開發(fā)提供依據(jù)。 但由于田間環(huán)境的復(fù)雜性，本研究篩選的引誘劑仍需田間試驗(yàn)進(jìn)一步檢驗(yàn)引誘效果。