李 靜，朱婉萍，王昱霽

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.椒江綠康老年康復(fù)護(hù)理院，浙江 臺州 318000；3.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310007)

覆盆子為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物華東覆盆子的聚合果[1]。作為中藥材，覆盆子具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目等功效，臨床用于治療遺精滑精、遺尿尿頻、陽痿早泄、目暗昏花等癥狀[2]?，F(xiàn)代研究證明，覆盆子含有多糖、萜類、糖蛋白、黃酮、甾醇、生物堿、香豆素和酚酸等化合物[3-8]，已明確有活性的成分包括鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、β-谷甾醇、齊墩果酸、覆盆子素、槲皮素等。目前未見到有學(xué)者對其活性三萜類成分科羅索酸和齊墩果酸進(jìn)行UPLC的含量測定，作者對覆盆子中的科羅索酸和齊墩果酸成分進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并對不同產(chǎn)地的覆盆子進(jìn)行相關(guān)含量測定，為覆盆子的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超高壓液相色譜儀：Waters UPLC H-Class；分析天平：Sartorius，BT 25 S；分析天平：Mettler Toledo，MS204S；超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司，SB-52000。

1.2 試藥

科羅索酸(98%，CX0060，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司)；齊墩果酸(91.6%，200167-190302，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司)；乙醇(分析級：成都市科隆化學(xué)品有限公司，2019050902)；甲醇(色譜級：Merck，I837107623)；磷酸：(分析級：成都市科隆化學(xué)品有限公司，2019010201)；覆盆子樣品(浙江臺州的采摘自浙江臺州華宇農(nóng)場掌葉覆盆子基地)，其他的覆盆子樣品采購自多個(gè)藥材市場，經(jīng)浙江中醫(yī)藥研究院鑒定為薔薇科植物華東覆盆子(RubuschingiiHu)的果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

使用UPLC測定，色譜柱 Waters UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流動相甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫，梯度洗脫變化見表1；檢測波長為210 nm；進(jìn)樣量2 μL；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃。科羅索酸、齊墩果酸與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3 000，色譜見圖1。

表1 科羅索酸、齊墩果酸梯度洗脫程序

注：科羅索酸出峰時(shí)間：3.446；齊墩果酸出峰時(shí)間：4.806。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取科羅索酸標(biāo)準(zhǔn)品1.66 mg、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品2.37 mg，于10 mL量瓶甲醇定容，制成含科羅索酸0.166 mg/mL、齊墩果酸0.237 mg/mL的對照品溶液。

2.3 樣品溶液制備

取過四號篩的覆盆子干燥樣品粉末2 g，精密稱定，加甲醇60 mL，稱重，超聲1 h，至室溫后用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過。濾液減壓蒸干，稱取適量提取物用甲醇溶解并于10 mL量瓶定容，配制成濃度約為4 mg/mL的供試品液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取科羅索酸、齊墩果酸對照品溶液0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、2.5 mL、5 mL置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容，用0.22 μm微孔濾膜過濾后即得混標(biāo)供試品。按“2.1”項(xiàng)下項(xiàng)色譜條件，UPLC進(jìn)樣量2 μL，檢測并記錄譜圖及峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)(x)峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行回歸。得科羅索酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=907 961.402 8x+336.881 3，R2=0.999 4，見表2、圖2；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1 191 439.354 7x-1 105.288 0，R2=0.999 7，見表3、圖3。分別在0.001 627～0.081 34 mg/mL、0.002 171～0.108 6 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 科羅索酸對照品濃度與峰面積數(shù)據(jù)

圖2 科羅索酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 齊墩果酸對照品濃度與峰面積數(shù)據(jù)

圖3 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取科羅索酸、齊墩果酸對照品溶液0.4 mL，置于2 mL量瓶中用甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾后按“2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，得科羅索酸峰面積的RSD為0.79%，齊墩果酸峰面積的RSD為1.5%，表明儀器精密度良好，見表4。

表4 科羅索酸、齊墩果酸精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定同一過四號篩的覆盆子樣品粉末6份，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，得科羅索酸提取物含量的RSD為1.710%，齊墩果酸提取物含量的RSD為1.609%，表明該方法重復(fù)性良好，見表5。

表5 科羅索酸、齊墩果酸重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定同一過四號篩的覆盆子樣品粉末6份，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，得科羅索酸提取物含量的RSD為1.710%，齊墩果酸提取物含量的RSD為1.609%，表明該方法重復(fù)性良好，見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的覆盆子粉末6份，每份約1 g精密稱定，分別加入科羅索酸、齊墩果酸適量，加甲醇30 mL，其他按“2.3”項(xiàng)下操作，制備供試品液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，得科羅索酸含量的RSD為1.924%，齊墩果酸含量的RSD為1.722%。所得結(jié)果見表7。

表7 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 樣品含量測定 精密稱定不同產(chǎn)地的覆盆子樣品，打粉，過四號篩，按“2.3”項(xiàng)下制備不同產(chǎn)地的覆盆子供試液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測定科羅索酸、齊墩果酸含量，結(jié)果見表8。

表8 不同產(chǎn)地覆盆子中的科羅索酸、齊墩果酸含量 (μg/g)

3 討論

3.1 檢查對象的選擇

覆盆子中的三萜類物質(zhì)具有多種藥理活性，作者希望能建立覆盆子藥材中科羅索酸和齊墩果酸的UPLC含量測定方法，控制其質(zhì)量，為種植研究及工藝研究提供依據(jù)。

3.2 色譜條件的選擇

在參考文獻(xiàn)[9-11]的基礎(chǔ)上先進(jìn)行HPLC的試驗(yàn)，因保留時(shí)間長，改用UPLC進(jìn)行，希望改進(jìn)試驗(yàn)速度。流動相的選擇，分別進(jìn)行了甲醇、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水作為流動相進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，甲醇-0.2%磷酸溶液的分離度最好，效果最佳。柱溫選擇，因柱溫對科羅索酸和齊墩果酸的分離度影響不大，最終選擇了35 ℃作為色譜柱的柱溫。檢測波長的選擇，根據(jù)文獻(xiàn)結(jié)果，對波長進(jìn)行復(fù)查，最終選取響應(yīng)值最大的210 nm作為測定波長。流速的選擇，分別進(jìn)行了1、0.8、0.6、0.4 mL/min的流速試驗(yàn)，結(jié)果顯示，0.4 mL/min的流速分離度適中，用時(shí)最短。流動相梯段時(shí)間的選擇，對流動相梯度進(jìn)行多個(gè)時(shí)間設(shè)定的對比，選擇能有效去除雜質(zhì)，并且保持合適目標(biāo)分離度的梯度時(shí)間，結(jié)果顯示使用正文中的流動相，分離效果最佳。

3.3 提取條件的選擇

在提取方法上，分別對覆盆子進(jìn)行了超聲提取和加熱回流提取的比較，以含量為考察指標(biāo)，結(jié)果表明，超聲提取得到的科羅索酸、齊墩果酸含量更高。在提取溶劑的選擇上，參考曹富等[11]的研究，選擇了提取效率較高的甲醇作為提取溶劑。提取工藝的選擇考慮取溶劑濃度、醇提次數(shù)、提取時(shí)間、加醇量等因素的影響，參考制劑提取工藝的L16(45)正交試驗(yàn)結(jié)果，以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量限范圍，確定“2.3”項(xiàng)下的樣品溶液制備方法。

4 結(jié)語

試驗(yàn)采用UPLC法同時(shí)測定覆盆子萜類成分中科羅索酸和齊墩果酸的含量，為建立覆盆子的質(zhì)量控制提供依據(jù)。該檢測方法可以有效測定不同產(chǎn)地覆盆子中科羅索酸和齊墩果酸的含量，檢測結(jié)果分別在0.001 627～0.081 34 mg/mL、0.002 171～0.108 6 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。該方法靈敏、便捷、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于覆盆子藥材的質(zhì)量評價(jià)。