安苗青，徐雅囡，卓倩婷，謝斯威，陳宏著，杜冰，黎攀

（1.華南農業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642；2.華南農業(yè)大學數學與信息學院，廣東廣州 510642）

衰老是一種自然的、普遍的、不可逆轉的自發(fā)性生理過程，同時伴有器官退行性障礙[1-2]，主要由環(huán)境因素和遺傳共同介導?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，隨著年齡的增長，機體代謝速度緩慢，體內會產生過量的活性氧自由基（ROS）。當ROS水平超出正常水平時會導致機體應激損傷，破壞免疫系統(tǒng)，最終導致壽命縮短[3-4]。ROS也是導致高血壓、心血管疾病和阿爾茲海默癥的重要原因[5]。臨床上為延長壽命通常使用人工合成的抗氧化劑來增強抗氧化酶的活性以清除體內自由基，但這些抗氧化劑長期服用會對人體產生危害。因此，開發(fā)具有抗衰老作用的天然活性藥物具有重要的意義。

中醫(yī)學認為，腎精不足、氣血虧虛是導致衰老的主要病因[6]。龜鹿二仙膠為延緩衰老的效驗方，最早見于明代王三才的《醫(yī)便》，其方劑組成為鹿角10斤、龜板5斤、人參15兩、枸杞子30兩，四藥合用，多用于虛損精極、遺泄、瘦削少氣及目視不明等癥[7]。既往學者們對龜鹿二仙膠抗衰老作用進行了大量的藥理學實驗。王樹鵬等[8]觀察龜鹿二仙膠顆粒對自然衰老小鼠學習記憶能力的影響，連續(xù)給藥3個月后，發(fā)現(xiàn)小鼠錯誤反應期延長，逃避反應期顯著縮短且錯誤反應次數減少。WANG等[9]研究結果表明，龜鹿二仙膠通過降低p16INK4a、p53和p21Cip1/Waf1蛋白的表達，可緩解化療藥物誘導造血干細胞的衰老。梁征洋等[10]將龜鹿二仙膠作用于D-半乳糖致衰老小鼠，發(fā)現(xiàn)藥物組中丙二醛（MDA）含量較模型組下降、超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著較模型組升高。以上研究均表明龜鹿二仙膠具有抗氧化的功效，但其在抗衰老方面的研究甚少且具體作用機制尚不清楚。

秀麗隱桿線蟲作為一種新型抗衰老評價模型，具有易于飼養(yǎng)、結構簡單、生命周期短、與人類基因保守性較高的特點，是國際上公認的抗氧化和延緩衰老研究的優(yōu)勢模型[11-12]，廣泛應用于先天免疫、氧化脅迫效應和環(huán)境暴露與損傷等的機制研究中[13]。因此，本研究以秀麗隱桿線蟲為研究對象，通過對線蟲壽命、行動力、產卵量、脂褐質水平、氧化應激及抗氧化酶活性等相關指標進行分析，進一步探討龜鹿二仙膠的抗衰老機制，為擴大其在市場上的廣泛應用提供研究基礎，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 動物與細菌N2野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，the Bristol strain N2）購于美國Caenorhabditis elegansGenetics Center；大腸埃希氏菌OP50（E.coliOP50），由華南農業(yè)大學食品學院曹康課題組贈送。

1.2 藥物、試劑與儀器鹿角、龜板、枸杞子、肉桂、西洋參，購自亳州中藥材市場，由華南農業(yè)大學食品學院肖南實驗員鑒定。蝦青素標品，索萊寶生物試劑有限公司生產，批號：SA8730。胡桃醌、瓊脂、胰蛋白胨、鏈霉素硫酸鹽、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸緩沖溶液、2’，7’-二乙酸二氯熒光素（2’，7’-dichlorofluorescin diacetate，H2DCF-DA），購自廣州齊湘生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等檢測試劑盒，購自南京城建生物工程研究所。FA2204萬分之一天平（上海舍巖儀器有限公司）；SN-HWS 250B恒溫生化培養(yǎng)箱[甘易儀器設備（上海）有限公司]；LD-SY96S多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；MF53-N熒光顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）；LC-LX-HR185C冷凍離心機（日本久保田公司）。

1.3 藥物及制備龜鹿二仙膠的制備：利用超聲波將400~600份鹿角和200~300份龜甲清洗干凈，鹿角完全浸泡20~40 d，經過3次熬煮后進行酶解，然后在酶解液中加入10~20份肉桂、40~50份西洋參和80~100份枸杞子恒溫熬煮1~6 h，最后濃縮罐裝。

2 實驗方法

2.1 分組實驗分5組：空白組（不處理）、龜鹿二仙膠低劑量組（0.5 mg/mL）、龜鹿二仙膠中劑量組（2.5 mg/mL）、龜鹿二仙膠高劑量組（5 mg/mL）、陽性對照組（蝦青素0.64μmol/mL）。

2.2 線蟲的培養(yǎng)及傳代用涂有大腸桿菌OP50的標準培養(yǎng)基，在20℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)線蟲。成年的秀麗隱桿線蟲分為雌雄同體和雄性兩種性別，傳代時挑取處于產卵期的單個雌雄同體的線蟲于新的涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基，20℃恒溫培養(yǎng)。

2.3 線蟲同期化培養(yǎng)為保證實驗過程中所有線蟲處于同一生長時期，要將其進行同期化處理。本實驗采用高氯酸鈉漂白法進行同期化培養(yǎng)：由于年輕成蟲體內有較多蟲卵，故采用1 mL M9緩沖溶液將年輕成蟲沖洗至無菌EP管中，加入1 mL裂解液裂解線蟲，震蕩3.5 min，在低速離心機上以3 000 r/min（離心半徑5 cm）離心1 min，除去上清液。再用M9沖洗2~3次，離心棄上清后用移液槍吸取EP管底部線蟲滴于NGM無菌區(qū)，約48 h后蟲卵基本發(fā)育成L4期幼蟲，完成同期化操作。

2.4 線蟲壽命的測定挑取同期化的L4期幼蟲到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個平板，每個平板20條）繼續(xù)培養(yǎng)。從轉移時刻開始計算存活時間，到生殖后期（通常為第4天）每2 d就將線蟲轉移到新的各組培養(yǎng)板上以保證藥物濃度。隔天探視線蟲，記錄死亡線蟲數，記錄線蟲生存、死亡及剔除實驗的條數，直至所有組線蟲全部死亡[14]，實驗結束。實驗重復3次。計算線蟲平均壽命和最高壽命，其平均壽命為線蟲全部死亡時間的平均值，最高壽命為線蟲最后存活數量的10%時的平均壽命[15]。

線蟲死亡的評判標準：無移動或吞咽動作，輕觸后仍無反應。剔除標準：①逃離至培養(yǎng)皿壁或蓋上而干死；②蟲卵在體內孵化成袋樣蟲；③鉆入瓊脂中。剔除意外死亡、逃逸和袋樣蟲。

2.5 線蟲運動能力的測定與壽命試驗同時進行，線蟲的運動能力測定參考YANG等[16]的研究方法。用鉑絲輕觸線蟲身體，30 s內若線蟲表現(xiàn)出連續(xù)協(xié)調的正弦運動，則記為快速運動；反之則記為緩慢運動。記錄標準：①線蟲自發(fā)運動，不需要觸碰刺激，記為“A”；②線蟲必須受到觸碰刺激才運動，記為“B”；③線蟲受到觸碰刺激后只擺頭或尾，記為“C”。

2.6 線蟲產卵量的測定將線蟲同期化培養(yǎng)后，每組挑取10條處于L4期的線蟲到各組培養(yǎng)基中，每份線蟲培養(yǎng)基上放置1條線蟲。每隔24 h將線蟲轉移至新的平板中，轉移4~5次后，線蟲基本不再產卵。然后將所有平板繼續(xù)放在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待子代線蟲孵化長大后，在其進入產卵之前（20℃孵育24 h）對平板上的線蟲進行計數，即可得到每個線蟲的產卵量。

2.7 吞咽頻率的測定挑取同期化的L4期幼蟲到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個平板，每個平板20條）繼續(xù)干預5 d后，每組隨機挑取10~15條線蟲，測定其在1 min內吞咽的次數。測定方法：在顯微鏡下用鉑絲輕輕觸碰線蟲身體觀測其咽部肌肉1 min內抽動的次數。獨立重復進行3次。

2.8 線蟲應激壽命實驗

2.8.1 線蟲熱應激壽命 挑取同期化的L4期幼蟲到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個平板，每個平板20條）繼續(xù)干預5 d，再轉移到37℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每小時在倒置熒光顯微鏡下計算線蟲的生存和死亡個數，并繪制生存曲線，直至所有線蟲全部死亡。實驗重復3次。

2.8.2 線蟲紫外應激壽命 挑取同期化的L4期幼蟲到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個平板，每個平板20條）繼續(xù)干預5 d，轉移到紫外照射環(huán)境中培養(yǎng)12 h后，在倒置顯微鏡下跟蹤計算線蟲的生存和死亡個數，繪制生長曲線，直至所有組線蟲死亡。實驗重復3次。

2.8.3 線蟲胡桃醌氧化應激壽命 挑取同期化的L4期幼蟲到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個平板，每個平板20條）繼續(xù)干預5 d，然后轉移至含有240μmol/L胡桃醌（先乙醇溶解，再加入培養(yǎng)基）的培養(yǎng)基，每組50條。每天記錄線蟲的生存及死亡個數，并繪制生存曲線，直至所有線蟲死亡。實驗重復3次。

2.9 線蟲體內ROS及脂褐質水平測定ROS水平測定：挑取同期化的L4期幼蟲到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個平板，每個平板20條）繼續(xù)干預5 d后，用M9緩沖溶液沖洗培養(yǎng)基3次，轉移到離心管中離心取上清液。吸取50μL上清液和50μL H2DCF-DA避光混勻后，在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長530 nm的熒光顯微鏡下每10 min進行1次熒光強度測定。連續(xù)測定2 h，并以上清液蛋白質濃度進行相對熒光強度標準化。

脂褐質水平測定：選取同期化的L4期幼蟲到新的各組培養(yǎng)板上（每組4個平板，每個平板20條）繼續(xù)干預7 d，用1%疊氮化鈉溶液將其麻醉，隨即轉移到2%瓊脂糖凝膠墊片上，然后通過熒光顯微鏡（激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長420 nm），單色數碼相機以及Image Pro Plus software獲取熒光圖像。

2.10 體內抗氧化酶活性測定同期化后的線蟲生長到L4期后，將各組線蟲轉移到NGM培養(yǎng)基上，分別以不同濃度的樣品干預5 d，用M9緩沖溶液沖洗培養(yǎng)皿并收集各板上的成蟲。冷凍研磨后離心，棄上清液，最終制成5%的線蟲勻漿，參照相關試劑盒進行SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的測定，并以上清液蛋白質濃度進行標準化。

2.11 統(tǒng)計方法實驗均重復進行3次。實驗結果均用均數±標準差（±s）表示，采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析并用最小顯著性差異法進行多重比較，顯著水平設置為P＜0.01或P＜0.001。另外，使用GraphPad（Windows 5.00版）軟件進行l(wèi)og-rank檢驗分析生存曲線顯著性。

3 結果與分析

3.1 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲壽命的影響本研究以蝦青素為陽性對照。有研究表明，蝦青素可有效清除自由基，抑制體內過氧化反應，能夠延緩線蟲壽命[17-18]。本研究結果如圖1、表1所示，與空白組相比，不同濃度的龜鹿二仙膠均提高了秀麗隱桿線蟲的平均健康壽命。空白組線蟲平均壽命為（14.88±1.58）d，陽性對照組線蟲的平均壽命為（27.73±5.01）d，而龜鹿二仙膠低劑量組線蟲的平均壽命和最長壽命分別延長至（18.93±4.20）d和（28.07±5.82）d，其效果與蝦青素陽性對照組相當，且與空白組相比形成顯著性差異（P＜0.01），表明龜鹿二仙膠能夠有效地延長線蟲的健康壽命。

表1 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲平均壽命和最長壽命的影響Table 1 Effects of Guilu Erxian Jiao on average and maximum life span of Caenorhabditis elegans（±s）

表1 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲平均壽命和最長壽命的影響Table 1 Effects of Guilu Erxian Jiao on average and maximum life span of Caenorhabditis elegans（±s）

①P＜0.01，與空白組比較

組別空白組龜鹿二仙膠低劑量組龜鹿二仙膠中劑量組龜鹿二仙膠高劑量組陽性對照組中位生存時間/d 15.00±2.83 18.67±4.50①17.00±2.94 17.67±3.30①18.33±3.86平均壽命/d 14.88±1.58 18.93±4.20①17.17±3.41①16.84±3.18①18.22±3.28最長壽命/d 23.67±2.70 28.07±5.82①25.80±5.16 25.53±4.36 27.73±5.01

圖1 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Figure 1 Effects of Guilu Erxian Jiao on life span of Caenorhabditis elegans

3.2 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲行動能力的影響線蟲運動能力與線蟲壽命有直接關系，能夠有效地評價機體的衰老速度[19]。本研究觀察龜鹿二仙膠對線蟲第4、8、12、16天運動能力的影響，結果如圖2所示：當線蟲處于生命早期階段（第4天），空白組、龜鹿二仙膠各劑量組和陽性對照組均有90%左右的線蟲保持在A狀態(tài)；第8天，空白組、龜鹿二仙膠各劑量組和陽性對照組線蟲運動能力與第4天相比，A狀態(tài)的線蟲顯著減少，此時線蟲大部分處于B狀態(tài)；在線蟲中晚期階段（第12天），除陽性對照組有6%線蟲處于A狀態(tài)，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組中分別有80%、90%和83%的線蟲保持在運動B狀態(tài)，與空白組相比分別提高了31%、48%和36%?？梢婟斅苟赡z可以顯著提高線蟲的運動能力，且濃度在2.5 mg/mL時其效果最好，進一步說明龜鹿二仙膠不僅可以延長線蟲壽命還可以提高線蟲行動力。

圖2 不同濃度龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲運動能力的影響Figure 2 Effects of different concentrations of Guilu Erxian Jiao on the motility of Caenorhabditis elegans

3.3 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲產卵量的影響線蟲通常在L4期的前4 d具有很高的繁殖能力。本研究結果如圖3-A所示，隨著線蟲的衰老，產卵量逐漸降低。龜鹿二仙膠組第2、3天線蟲產卵量高于空白組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。如圖3-B結果顯示，龜鹿二仙膠樣品組總產卵量與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？梢婟斅苟赡z干預對線蟲的生殖能力沒有影響，表明龜鹿二仙膠延長秀麗隱桿線蟲壽命并沒有打破“能量守恒學說”，故其可能不是通過“飲食限制”來延長線蟲壽命的[20]。

圖3 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲產卵量的影響Figure 3 Effects of Guilu Erxian Jiao on oviposition quantity of Caenorhabditis elegans

3.4 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲吞咽頻率的影響結果如圖4所示，與空白組比較，龜鹿二仙膠低劑量組線蟲的吞咽運動頻率升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中劑量組和高劑量組線蟲的吞咽運動頻率顯著升高（P＜0.001），表明龜鹿二仙膠加快了線蟲的攝食能力，具有一定的抗衰老能力。

圖4 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲吞咽頻率的影響Figure 4 The effect of Guilu Erxian Jiao on swallowing frequency of Caenorhabditis elegans

3.5 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲應激能力的影響如圖5-A所示：與空白組相比較，經龜鹿二仙膠干預后，線蟲在37℃熱應激壓力下的存活率曲線明顯向右移動；此外，與空白組比較，龜鹿二仙膠低劑量組的存活率提高了13%，中劑量組和高劑量組的存活率分別提高了19%和21%。結果表明，龜鹿二仙膠能明顯增強線蟲熱抵抗力，并以劑量依賴的方式延長線蟲壽命。

繼而檢測線蟲抗紫外脅迫能力，結果如圖5-B所示，在紫外照射環(huán)境下，龜鹿二仙膠各劑量組線蟲存活時間較空白組延長，其中，高劑量組（5 mg/mL）線蟲存活時間可達到216 h，較空白組壽命延長了73%。

研究[21]表明，胡桃醌能夠使處于其中的線蟲在短時間內產生大量的氧自由基，引起氧化應激，導致線蟲體內急性氧化損傷。本研究結果如圖5-C所示，經龜鹿二仙膠樣品干預后的線蟲存活率曲線明顯向右移動，低、中、高劑量組存活率較空白組分別提高了36%、44%和56%。

圖5 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲應激能力的影響Figure 5 The effect of Guilu Erxian Jiao on the stress ability of Caenorhabditis elegans

以上結果表明，龜鹿二仙膠在熱應激、紫外應激、胡桃醌應激等壓力環(huán)境下均可以延長線蟲壽命，這與根皮素和益智仁對線蟲應激能力的影響結果相一致[22-23]。具體結果見表2。

表2 不同條件對各組秀麗隱桿線蟲應激能力的影響Table 2 Effects of different conditions on stress ability in each group of Caenorhabditis elegans

3.6 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲脂褐質及ROS水平的影響如圖6-A、圖6-B所示，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組L4期線蟲體內脂褐質水平較空白組顯著降低（均P＜0.001），且呈劑量依賴性，其中，高劑量組（5 mg/mL）脂褐質水平較空白組降低了65.78%。結果表明龜鹿二仙膠具有較好地降低線蟲體內脂褐質含量的能力。線蟲體內ROS隨著時間的延長而增多。第5天，各組線蟲體內ROS水平如圖6-C所示，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組的ROS水平較空白組顯著降低（均P＜0.001），表明龜鹿二仙膠可以有效降低線蟲體內ROS水平，進而降低體內脂褐質的堆積。

圖6 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲脂褐質及ROS水平的影響Figure 6 Effects of Guilu Erxian Jiao on lipofuscin leveland ROS levelof Caenorhabditis elegans

3.7 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲體內氧化應激指標的影響結果如圖7所示，與空白組比較，龜鹿二仙膠低、中、高劑量組和陽性對照組線蟲體內抗氧化應激指標SOD、CAT和GSH-Px酶活性均顯著升高，其中，高劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。龜鹿二仙膠低、中、高劑量組和陽性對照組線蟲體內氧化產物MDA含量顯著降低，較空白組分別降低了15.24%、24.69%和30.24%。結果表明龜鹿二仙膠能夠有效地提高秀麗隱桿線蟲體內抗氧化能力，減輕氧化損傷，延長線蟲壽命，當濃度為5 mg/mL時，效果更明顯。

圖7 龜鹿二仙膠對秀麗隱桿線蟲體內氧化應激指標的影響Figure 7 Effects of Guilu Erxian Jiao on oxidative stress indexes of Caenorhabditis elegans in vivo

4 討論

中醫(yī)學對衰老的研究歷史悠久，中醫(yī)認為衰老的主要病機為陰陽失調、臟腑衰虛、精氣衰竭，常用健脾補氣、養(yǎng)陰補陽、補腎填精的中草藥進行調理[24]。龜鹿二仙膠具有滋陰補陽、健腎補脾、延緩衰老的功效[7]，但其作用機制尚不明確。本研究采用秀麗隱桿線蟲衰老模型，首次研究龜鹿二仙膠在延長壽命的同時對線蟲基礎生理指標的影響。

自由基是衰老過程中最重要的因素之一，高溫會導致機體內部代謝紊亂、酶失活以及氧氣傳輸受阻，使機體內產生大量的活性氧，引起氧化應激[20，25]。經過紫外線長時間照射，機體內自由基平衡會被打破，甚至引起蛋白質變性和DNA損傷，最終加速衰老[26]。也有研究表明，胡桃醌在線蟲體內發(fā)生氧化還原反應時會誘導細胞產生氧化應激反應，短時間內產生大量的自由基，從而引起急性氧化損傷[27]。ROS的過量堆積不僅會導致脂質過氧化，產生大量的MDA，還會破壞蛋白質，引起氧化應激，因此通過抑制ROS的積累可以延緩衰老[28]。另外，機體也會分泌CAT、SOD和GSH-Px等酶類物質抑制體內ROS的積累，因此，提高線蟲體內抗氧化酶活性是至關重要的。提示延緩線蟲衰老的作用機制與抗氧化作用、清除或抑制自由基、增強抗衰老活性和調控衰老相關基因等[29]有關。

本實驗結果顯示，龜鹿二仙膠能夠延長健康和應激條件下線蟲的壽命，提高其運動能力和吞咽頻率以及體內SOD、CAT和GSH-Px酶的活性，同時降低線蟲體內ROS、脂褐質的積累以及MDA含量，故龜鹿二仙膠可能是通過降低體內ROS含量、提高機體抗氧化酶活性來降低體內氧自由基蓄積，減緩細胞氧化損傷，進而起到延長壽命的作用。