許妍 吳育,2 謝輝 華政穎 顏翠萍 殷放宙 李偉東*

1.教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023 2.南通市中醫(yī)院，江蘇 南通 226000 3.泰州市藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300

骨質(zhì)疏松癥是一種系統(tǒng)性骨骼疾病，其特征為骨密度降低和骨微結(jié)構(gòu)破壞[1]。臨床上常用的抗骨質(zhì)疏松藥主要有基本補充劑、抑制骨吸收藥和促進(jìn)骨形成藥這幾大類。然而目前這些藥物療效有限，同時伴有許多不良反應(yīng)[2]。

補骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)有補腎壯陽、溫脾止瀉之效，臨床常用于治療骨性疾病和白癜風(fēng)等皮膚病，在中國和亞洲其他國家已有數(shù)百年的使用歷史[3]。中醫(yī)臨床常將補骨脂鹽炙后入藥，根據(jù)傳統(tǒng)的中藥炮制“鹽炙入腎”理論，鹽炙可以引藥下行，促進(jìn)中藥成分進(jìn)入“腎經(jīng)”，增強其溫腎作用[4]，而“腎主骨”“腎充則髓實”。因此，“補腎益髓”的基本治則在中醫(yī)骨科臨床上得到廣泛應(yīng)用[5]。

實驗從補骨脂臨床實際用藥出發(fā)，采用傳統(tǒng)水煎劑給藥，比較補骨脂生品、鹽品抗骨質(zhì)疏松作用的同時，分析補骨脂鹽炙前后化學(xué)成分在體內(nèi)外的變化，探究其炮制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

補骨脂購于北京同仁堂(產(chǎn)地：四川，批號：180501)。補骨脂鹽品按照《中華人民共和國藥典》(2015版 Ⅳ部) 的指導(dǎo)原則進(jìn)行加工。

生品和鹽品打粉，過篩。分別稱取粉末500 g，加入5 000 mL蒸餾水提取1 h，過濾，濃縮，補骨脂調(diào)整最終濃度為0.2 g/mL。

1.2 動物

SPF級雌性SD大鼠(合格證：20180004033817；倫理審查編號：201903A011)，體重220～260 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 去卵巢大鼠模型的建立

40只大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham)、去卵巢(OVX)組、生品組和鹽品組。

大鼠麻醉，于脊柱兩側(cè)做縱向切口，切去雙側(cè)卵巢。假手術(shù)組：打開腹腔后僅切除卵巢附近大小相近的一團(tuán)脂肪組織，保留完整卵巢。

1.4 給藥及樣本采集

術(shù)后4周，給藥組每天分別以0.4 g/200 g體重(約人臨床用藥劑量的2倍)補骨脂生、鹽品灌胃，其余兩組給予生理鹽水。12周后記錄大鼠體重，采集血液、子宮、股骨和脛骨。

1.5 血清生化標(biāo)志物的檢測

ALP、Ca、P采用生化試劑盒檢測(Beyotime，上海，中國)；OC、E2用ELISA試劑盒檢測(南京建成生物工程研究所，南京，中國)。

1.6 生物力學(xué)強度的測試

每組隨機(jī)抽取右側(cè)的股骨和脛骨樣本(n=5)進(jìn)行三點彎曲實驗(Instron 5566；Instron Corp., USA)。

1.7 骨密度測量

每組隨機(jī)抽取左側(cè)股骨和脛骨樣本(n=5)，用小動物骨密度測試軟件(Region High Resolution，Version 4076；HOGIC)測定左側(cè)骨遠(yuǎn)端的骨密度。

1.8 Micro-CT 骨微結(jié)構(gòu)分析

每組隨機(jī)抽取左側(cè)股骨樣本(n=5)進(jìn)行CT掃描(CT-Sharp，ZKKS-MCT，中國，ZKKS-MCT)。

1.9 補骨脂含藥血清的制備

30只大鼠隨機(jī)分為3組：對照組、補骨脂生品、鹽品組。給藥組每天分別以0.4 g/200 g體重灌胃，對照組給予生理鹽水。第7天給藥2 h后，取血。血樣于室溫靜置1 h，3 600 r/min，10 min，取上清。將收集到的血清于56 ℃，滅活30 min，保存于-80 ℃。

1.10 成骨細(xì)胞增殖及代謝的血清生化標(biāo)志物測定

從剛出生的Wistar大鼠顱骨上提取成骨細(xì)胞并培養(yǎng)。種板24 h后，分別加入5%、10%、20%的補骨脂生、鹽品的含藥血清和空白血清，繼續(xù)孵育12、24、48 h后檢測細(xì)胞增殖率和培養(yǎng)液中ALP活性。每個實驗獨立進(jìn)行3次。

1.11 補骨脂生、鹽品主要有效成分的體內(nèi)外含量測定

1.11.1體外水煎液含量測定：取生、鹽品粉末各0.5 g，加50 mL水提取1 h。過濾并蒸發(fā)溶劑，甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容。平行3份。

用高效液相色譜(HPLC)測254 nm處成分含量 (Waters e2695 2998 UV，USA)。色譜柱：Hypersil ODS2 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水(A)，甲醇(B) and 乙腈(C)。

1.11.2大鼠體內(nèi)含藥血清測定：每組隨機(jī)抽取5份血清，加入甲醇和內(nèi)標(biāo)，渦旋3 min，12 000 r/min，5 min，取上清，氮氣吹干，加甲醇復(fù)溶，混勻3 min，12 000 r/min，5 min，取上清用UPLC-Triple Quad 5500進(jìn)行分析。

正離子模式的電噴霧電離源；色譜柱：Extend C18 (Agilent，USA，2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：0.1%甲酸(A)和乙腈(B)。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 25.0軟件(SPSS Inc., Chicago, USA)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 體重和子宮指數(shù)的測定

如圖1A所示，OVX組的體重明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)；給藥后大鼠體重明顯下降，生、鹽品之間沒有顯著性差異(P>0.05)。圖1B顯示，OVX組子宮指數(shù)[子宮重量(mg)/體重(g)]遠(yuǎn)低于假手術(shù)組(P<0.01)，給予補骨脂生品后，子宮指數(shù)上升(P<0.05)，鹽品組的子宮指數(shù)有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組大鼠體重(A)和子宮指數(shù)(B)的變化(*P<0.05，**P<0.01)Fig.1 Changes on body weight (A) and uterus index (B) of rats (*P<0.05, **P<0.01)

實驗結(jié)果提示，去卵巢之后，大鼠體內(nèi)激素紊亂，機(jī)體負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致食欲增大，體重代償性增加，而補骨脂抑制了去卵巢引起的體重代償性增加，生、鹽品作用相當(dāng)。同時由于雌激素減少，子宮功能受到影響，子宮萎縮甚至功能消失，子宮指數(shù)降低，補骨脂生品可以刺激子宮，明顯增加子宮重量，而鹽品也有同樣的作用趨勢，但趨勢不明顯。

2.2 補骨脂對OVX大鼠血清生化標(biāo)志物的影響

如表1所示，OVX組血清生化指標(biāo)均有顯著變化(P<0.01)，而補骨脂在一定程度上逆轉(zhuǎn)了OVX誘導(dǎo)的各種病理性變化。生、鹽品對各生化指標(biāo)的影響相同，無顯著性差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)變化Table.1 Changes in serum biochemical indexes of the rats in each group

2.3 補骨脂對OVX大鼠骨密度的影響

如圖2所示，OVX大鼠的股骨和脛骨的骨密度均明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)，給藥后大鼠的骨密度顯著增加，且補骨脂生、鹽品對骨密度的影響相似，無顯著差異(P>0.05)。

圖2 各組大鼠股骨(A)和脛骨(B)骨密度變化(*P<0.05， **P<0.01)Fig.2 Changes on BMD of femur (A) and tibia (B) of rats (*P<0.05, **P<0.01)

2.4 補骨脂對OVX大鼠生物力學(xué)強度的影響

如表2所示，與假手術(shù)大鼠相比，OVX組的股骨和脛骨的最大載荷和楊氏模量顯著降低。補骨脂鹽品能顯著增加股骨和脛骨的最大載荷(P<0.01)，而生品有增加骨最大載荷的趨勢，但作用不明顯(P>0.05)。補骨脂生、鹽品均可以增加股骨和脛骨的楊氏模量，兩者對脛骨的影響作用相同，沒有顯著差異(P>0.05)，但對股骨的影響有差異，鹽品對股骨的作用優(yōu)于生品(P<0.05)。

表2 各組大鼠的骨生物力學(xué)強度變化Table.2 Changes in biomechanical strength of bone of the rats in each group

2.5 補骨脂對OVX大鼠骨小梁微結(jié)構(gòu)的影響

各組股骨干骺端骨小梁的3 D結(jié)構(gòu)圖像如圖3所示。結(jié)果顯示，補骨脂給藥后，小梁微結(jié)構(gòu)明顯改善。與假手術(shù)組相比，OVX組骨小梁較薄，斷裂較多。生品組和鹽品組骨小梁網(wǎng)比OVX組多，斷裂減少。

圖3 各組大鼠的骨小梁微結(jié)構(gòu)Fig.3 Bone trabecular microstructure of the rats in each group

2.6 補骨脂含藥血清對大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化的影響

補骨脂含藥血清孵育12 h和24 h對細(xì)胞增殖無明顯影響(數(shù)據(jù)未顯示)。在圖4A中，各濃度含藥血清作用48 h后均顯示出明顯的細(xì)胞增殖活性，在相同濃度下，補骨脂鹽品的含藥血清對成骨細(xì)胞的增殖作用優(yōu)于生品(P<0.05)。隨著含藥血清濃度的增加，成骨細(xì)胞增殖率有上升的趨勢，但趨勢不明顯，無顯著差異(P>0.05)。

如圖4B所示，5%、10%和20%的補骨脂鹽品含藥血清均可顯著增加ALP活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，而補骨脂生品含藥血清僅在中、高濃度時才對ALP活性有影響，低濃度時無明顯作用(P>0.05)。生、鹽品含藥血清對ALP活性的影響與其濃度呈正相關(guān)(P<0.01)，含藥血清濃度越高，ALP活性越大。

圖4 補骨脂含藥血清對成骨細(xì)胞增殖(A)和ALP活性(B)的影響(*P<0.05， **P<0.01)Fig.4 Effect of drug-containing serum on proliferation (A) and ALP activity (B) of osteoblasts (*P<0.05, **P<0.01)

2.7 補骨脂中主要有效成分體內(nèi)外含量測定

補骨脂中主要有效成分補骨脂素、異補骨脂素及其苷類成分的體內(nèi)外含量測定結(jié)果見表3。鹽炙后，補骨脂水煎液中苷類成分含量高于生品(P<0.01)，而相應(yīng)的苷元含量減少(P<0.01)，而且補骨脂鹽品水煎液中的苷和苷元的含量總和大于補骨脂生品。補骨脂鹽品含藥血清中補骨脂素和異補骨脂素含量顯著高于補骨脂生品(P<0.01)。

表3 補骨脂中主要有效成分體內(nèi)外含量測定結(jié)果Table.3 Contents of main active components in psoralea corylifolia L. in vitro and in vivo

3 討論

本實驗中，OVX大鼠體重增加，子宮萎縮，BMD降低、骨骼變脆、結(jié)構(gòu)受損，雌激素下降以及血清生化指標(biāo)水平紊亂等一系列變化均與臨床絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松的癥狀一致[6]。而補骨脂生、鹽品均可在不同程度上逆轉(zhuǎn)由去卵巢引起的大鼠體內(nèi)外各種生化指標(biāo)及骨骼的變化，降低去卵巢對大鼠的影響，表現(xiàn)出一定的抗骨質(zhì)疏松作用，且補骨脂生、鹽品的含藥血清均可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，促進(jìn)骨基質(zhì)的分泌，加速骨形成。

鹽炙前后的補骨脂治療骨質(zhì)疏松的效果和機(jī)制均很相似，但總體而言，補骨脂鹽品在諸多指標(biāo)上的作用均優(yōu)于生品。補骨脂鹽品增加骨硬度和骨韌性的效果顯著，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的作用也明顯優(yōu)于生品。絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥的主要原因就是體內(nèi)雌激素減少，不足以抑制破骨細(xì)胞活動，骨合成減少，最終導(dǎo)致骨量減少，骨脆性增加，骨折風(fēng)險也隨之增加[7]。這意味補骨脂鹽品在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，從根源上治療骨質(zhì)疏松的同時，還可以增加骨硬度和骨韌性，降低骨折風(fēng)險，在“對癥”和“對因”兩個方面均優(yōu)于生品。

補骨脂鹽炙前后的主要有效成分的煎出含量存在差異，吸收入血的有效成分含量也存在差異。補骨脂鹽炙增效，增加其抗骨質(zhì)疏松作用的機(jī)制可能有：(1)鹽炙過程殺酶保苷，破壞了酶的活性，從而保留了補骨脂苷、異補骨脂苷等苷類成分[8-9]。而苷類成分易于煎出，吸收入血后又可被代謝成為相應(yīng)的補骨脂素、異補骨脂素等苷元[10]，導(dǎo)致含藥血清中藥效成分含量的高于生品，從而提高了療效；(2)鹽炙促進(jìn)補骨脂中有效成分吸收和代謝，增加其生物利用度[11]；(3)“鹽炙入腎”，即鹽炙可以引藥下行，專入腎經(jīng)，促進(jìn)補骨脂中藥效成分吸收入腎[12]，而“腎主骨”“腎充則髓實”，骨的生成、發(fā)育和強弱與腎息息相關(guān)，從而達(dá)到鹽炙增效的目的[13]。

然而，補骨脂在臨床使用也存在較多的不良反應(yīng)報道[14]，不能忽略其臨床毒性，如肝、腎和光毒性。補骨脂的毒性作用與劑量具有一定相關(guān)性，試驗中補骨脂劑量越大，毒性程度越明顯[15]。炮制[16]和配伍[17]在一定程度上也可以降低補骨脂的毒性。中醫(yī)臨床用藥講究的是君、臣、佐、使相輔相成，對中藥毒性的研究應(yīng)綜合、科學(xué)地進(jìn)行整體評判[18]。

綜上所述，補骨脂生、鹽品均可促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化，加速骨形成，具有較好的抗骨質(zhì)疏松作用。而鹽炙可以增加補骨脂有效成分補骨脂苷、異補骨脂苷等苷類成分的煎出和補骨脂素、異補骨脂素等苷元成分的吸收入血，增強了補骨脂鹽品抗骨質(zhì)疏松的療效。