魏金龍 宋小雙 周 琦 鄧 勛 劉艷紅 姜瑞鳳 平曉帆 王新瑩 遇文婧**

（1.黑龍江省森工農化有限公司，黑龍江 哈爾濱 150324；2.黑龍江省林業(yè)科學院森林保護研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省森林植物園，黑龍江 哈爾濱 150040）

樟子松（Pinus sylvestris var.mongolica）是三北地區(qū)治沙造林最多的針葉樹，截至“九五”末期，我國三北地區(qū)樟子松人工林已達50～60 萬hm2[1]。但隨著人工林面積逐年擴大，樟子松病害危害程度日趨嚴重，最嚴重的樟子松枯梢病（Sphaeropsis sapinea）發(fā)病面積已達1 300 hm2，發(fā)病率100%，感病指數44.8，使樟子松的胸徑、材積和樹高等逐年下降，人工林生產量下降40%，減少商品材積65%，造成巨大的經濟損失[2]。樟子松成林后，植株高大，山高林密，大大增加了防治工作的難度。因此，在苗圃期對其進行品質改良，提高其抗逆性和生長優(yōu)勢，不僅能提高苗木產量，還將為營造健康林地環(huán)境起到非常重要的作用。

近年來，木霉（Trichoderma spp.）作為一種新興的微生物肥料越來越受到重視。木霉不僅能通過抗生、重寄生、營養(yǎng)競爭等機制對抗病原真菌，而且能分泌一些小分子蛋白誘導植物產生系統抗病性（Induced Systemic Resistance，ISR）[3]，從而促進生長。木霉分為外生木霉和內生木霉，外生木霉是典型的土壤及根際菌，不能定植在植物組織內，作為肥料施用簡單，適合在農業(yè)上應用；內生木霉定植在植物組織內，受外界環(huán)境因素影響較小，可長期發(fā)揮促生長、增強抗逆性的作用[4]。因此，利用內生木霉在林木苗期施用，可提高寄主抗逆性，不僅避免成林后林木病害防治難度大的問題，也避免連年施用化學藥劑導致土壤肥力下降、環(huán)境污染等問題，達到持續(xù)、有效控制病害的目的。

本研究從黑龍江省牡丹江市江山嬌實驗林場健康樟子松組織中分離獲得一株內生哈茨木霉（T.harzianum）Th30 菌株，并對樟子松出土苗根施互作，通過研究內生木霉Th30 菌株對樟子松幼苗生長生理指標、抗病指數、抗病基因等影響，探討內生木霉Th30 菌株對樟子松幼苗促生抗病能力，旨在為樟子松苗圃提供微生物菌肥提供理論依據和物質基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

內生哈茨木霉Th30菌株分離自黑龍江省牡丹江市江山嬌實驗林場健康樟子松組織。樟子松苗期立枯病病原菌-立枯絲核菌（Rhizoctonia solani，Rs）和樟子松種苗由黑龍江省森林保護研究所病理實驗室提供。

1.2 育苗及根施處理

將種子置于鋪上濕紗布的育苗盤中，濕紗布覆蓋，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日澆水，發(fā)芽后移至裝有滅菌土的花盆中，生長2 個月后再移苗。將移栽苗劃分為處理組和對照組，處理組分為3 個重復組，每組至少有樟子松出土苗500 株。在處理組，分別選擇濃度為1×103個/mL（T1）、1×105個/mL（T2）和1×107個/mL（T3）孢子懸浮液，用200 mL/株水稀釋混勻，紗布過濾后，對出土苗進行根施，每隔10 天在根部施用1 次，共3 次。施用時將根圍表土移開3 cm 厚，菌肥懸液澆于植物根部，將移開的土壤重新覆蓋。對照組用清水澆灌（CK）。

1.3 生長生理指標測定

分別在0、15、30、60 天時測量幼苗的株高、地徑、根系、葉鮮重和干重，并隨機采集生長狀態(tài)一致的樟子松針葉，常規(guī)方法測定針葉中生理生化指標：蛋白質含量（考馬斯亮藍法），脯氨酸含量（茚三酮顯色法），保護酶超氧化物歧化酶SOD（NBT光照化學還原法）和防御酶苯丙氨酸解氨酶PAL（催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨法）活性。并對不同處理的樟子松1 年生和2 年生幼苗的生長進行觀測。

1.4 抗病指數調查

對生長3 個月的幼苗采用輕微傷根法接種立枯絲核菌，60 天后調查樟子松各種病害發(fā)病率和發(fā)病指數。以上實驗每個時間點3 個重復，每個重復測定30 株苗。發(fā)病率（%）=針葉病變植株總數/調查植株總數×100。根據針葉變色長度占針葉長度的比例（x）將病情指數分為1～5 級（表1）。病情指數=∑（該級代表數值×該病級株數）/（調查總株數×最高級的代表數值）×100。

表1 樟子松幼苗病害分級標準

1.5 RT-qPCR 分析樟子松水楊酸和茉莉酸信號中功能基因的轉錄水平

設置對照組CK（清水澆灌），處理組T（105個/mL內生菌孢子懸浮液）誘導樟子松幼苗15 天，起苗將根洗凈，采用TRIzol 方法提取根部總RNA，進行轉錄組測序。通過GO 功能富集和KEGG 通路等對差異表達基因進行功能注釋，篩選到水楊酸轉導路徑中的病程相關基因非表達子基因（NPR1）、茉莉酸轉導路徑中的茉莉酸抗性基因（JAR1）和內參基因（Tubulin alpha），在NCBI 網站上進行BlastX序列對比確定基因序列，利用Primer 6.0 引物設計軟件進行引物設計，由上海生工生物技術服務有限公司合成（表2）。在內生木霉誘導0、5、15、30、60 天后選取生長狀態(tài)一致的樟子松幼苗，每個時間點取3 個重復，每個重復30 株苗。收集根，用液N 速凍后，利用CTAB 方法分別提取根RNA，反轉錄，以稀釋10 倍后的不同cDNA 為模板，用上述3 組引物進行實時定量PCR（RT-qPCR），每組擴增均設3個重復。并采用2-ΔΔCt計算法對數據進行析處理并繪制成曲線圖，以此來檢測樟子松功能基因在內生木霉定殖后的表達模式。

表2 RT-qPCR 引物

2 結果與分析

2.1 內生木霉對樟子松生長指標的影響

根施內生木霉Th30 菌株60 天后，T3（1×105個/mLTh30 孢子懸浮液）處理組的樟子松幼苗的株高、地莖、根長、鮮重和干重均顯著高于對照（P＜0.05），分別為對照的56.42%、33.33%、26.78%、83.23%和50.60%（表3）。T3 處理組的樟子松1 年生和2 年生植株均明顯高于其他處理植株（圖1）。因此，內生木霉Th30 菌株能夠提高樟子松幼苗的生物量，并顯著促進其生長。

圖1 內生木霉Th30 對樟子松幼苗生長的影響

表3 內生木霉菌Th30 對樟子松幼苗生物量的影響

2.2 內生木霉對樟子松生理指標的影響

根施內生木霉Th30 菌株60 天后，樟子松幼苗的不同生理指標（蛋白質含量、脯氨酸含量、SOD和PAL 活性）隨著時間的變化而不同（圖2）。與對照相比，T2 和T3 處理組的可溶性蛋白質含量變化較顯著，在15 天時達到峰值，分別為對照組的8.48和3.71 倍；與對照相比，T1、T2 和T3 處理組的脯氨酸含量均顯著升高，在30 天時達到峰值，分別為對照組的2.82、4.29 和5.64 倍；T1 和T3 處理組的SOD 活性在15 天時達到峰值，分別為對照的2.19和1.33 倍，而T2 處理組的SOD 活性在30 天時達到峰值，為對照組的3.69 倍；T1、T2 和T3 處理組的PAL 活性都在30 天時達到峰值，分別高于對照的0.87、1.89 和1.37 倍。因此，內生木霉Th30 菌株在初期能夠顯著提高樟子松幼苗的可溶性蛋白質含量、脯氨酸含量、以及SOD 和PAL 活性。

圖2 內生木霉對Th30 對樟子松生理指標的影響

2.3 內生木霉對樟子松抗病指數的影響

隨著時間的推移，不同處理下植株病情指數均上升（表4），但發(fā)病程度不同（圖3）。接種初期，病情指數不顯著（P＜0.05），但是接種10 天的CK 組針葉開始出現輕微病斑，而T1 組針葉無明顯變化；接種30 天，CK 組與T3 組之間的病情指數差異顯著（P＜0.05），CK 組病情指數穩(wěn)定上升且針葉基本變黃，而T3 組的病情指數基本平穩(wěn)，且針葉發(fā)病程度明顯滯緩。接種60 天時，CK 組的發(fā)病率顯著高于處理組，其中T3 組的發(fā)病率最低，且CK組針葉全部枯黃，而T3 組的針葉無明顯變化。說明接種內生木霉可以提高樟子松的抗病能力。

表4 樟子松發(fā)病率及病情指數

圖3 接種病原菌后針葉感病變化

2.4 內生木霉對樟子松抗性基因的影響

經RT-qPCR 分析，在內生木霉Th30 菌株定植過程中，樟子松根系中病程相關基因非表達子基因（NPR1）和茉莉酸抗性基因（JAR1）表達水平如圖4和圖5。結果顯示，CK 組根系中NPR1 無明顯變化，T3 組根系中NPR1 在誘導5 天呈負調控，低于對照4 389.98（212.10）倍，之后一直呈正調控，15 天時為表達高峰，為對照的1 772.16（210.75）倍（圖4）。CK 組根系中JAR1 無明顯變化，T3 組根系中JAR1呈正調控，在5 天后顯著增高，在15 天時達到高峰，為對照的5 007.93（212.29）倍（圖5）。這說明內生木霉Th30 菌株在定植樟子松幼苗初期能夠誘導樟子的NPR1 基因和JAR1 基因的表達。

圖4 內生木霉Th30 菌株誘導樟子松根系NPR1 基因的表達水平

圖5 內生木霉Th30 菌株誘導樟子松根系JAR1 基因的表達水平

3 結論與討論

木霉菌被認為是一種可以廣泛應用的新型促生劑[5]，劉暢等[6]利用綠色木霉和哈茨木霉混合菌液灌根處理黃瓜幼苗后，發(fā)現混合菌液能夠顯著促進黃瓜幼苗生長，并且效果優(yōu)于施加單種菌液。鄧俊杰等[7]將哈茨木霉T6 施于月季盆栽土壤中，通過測定月季的相關生理指標表明哈茨木霉T6 具有促進月季生長和提高抗性的作用。李瑞敏等[8]也發(fā)現木霉菌對辣椒種苗的生物量、壯苗指數以及種苗移栽后株高、莖粗、單株果實重及根際木霉菌數量有顯著影響。在本研究中，根施內生木霉Th30 菌株60 天后，T3（1×105個/mL Th30 孢子懸浮液）處理組的樟子松幼苗的株高、地莖、根長、鮮重和干重均顯著高于對照（P＜0.05），1 年生和2 年生植株均明顯高于其他處理植株，因此，內生木霉Th30 菌株能夠提高樟子松幼苗的生物量，并促進其生長。

抗逆性強的植株具有更高的蛋白質[9]和游離脯氨酸含量[10]。SOD 和PAL 等生理酶在植物正常生長發(fā)育和抵御病原菌侵害中也起著重要作用[10]。研究表明，棘孢木霉（T.asperellum）、深綠木霉（T.atroviride）、綠色木霉（T.viride）、長枝木霉（T.longibrachiatum）等均能通過提高植物的抗性生理指標來提高植物的抗病能力[10-13]。在本研究中，在內生木霉Th30處理下的樟子松幼苗中可溶性蛋白質含量、脯氨酸含量、SOD 和PAL 活性均顯著升高，而T3 處理組的發(fā)病率最低，表明Th30 菌株對提高樟子松的抗病能力起到重要作用。

此外植物激素，特別是水楊酸（SA，salicylic acid）和茉莉酸（JA，Jasmonic acid），被廣泛證實能夠響應外界病原微生物的侵染[14]。在SA信號轉導通路中，病程相關基因非表達子基因（NPR）在先天免疫和系統獲得性抗性（System acquired resistance，SAR）中均發(fā)揮重要作用，NPR1 也是病程相關基因PR1（Pathogenesis-relatedproteingene）表達的關鍵成分，其過表達并未導致擬南芥（Arabidopsis thaliana）PR1的表達，從而提高其抗病能力[15]。JAR1 不僅影響JA 類化合物的合成，并且其作為一個信號中間體，參與茉莉酸信號途徑的調控[16]。在本研究中，內生木霉Th30 定植樟子松幼苗過程中，根系中NPR1 基因和JAR1 基因在均在誘導初期顯著上調表達，表明NPR1 基因和JAR1 基因能夠參與Th30 菌株和樟子松幼苗的互作過程，從分子水平上再次證明內生木霉Th30 菌株能夠提高樟子松的抗病能力。

綜上所述，內生哈茨木霉Th30 菌株不僅能夠促進樟子松幼苗的生長，還能通過提高樟子松幼苗蛋白質含量、脯氨酸含量、SOD 和PAL 活性、以及誘導樟子松幼苗根系中病程相關基因非表達子基因（NPR1）和茉莉酸抗性基因（JAR1）上調表達，從而提高樟子松幼苗的抗病能力。因此，在后續(xù)研究中對內生哈茨木霉Th30 菌株進行生物菌肥的開發(fā)和推廣，對樟子松苗圃綠色發(fā)展具有重要意義。