馬曉乾 高 宇 孫 妍 尚爾雨

（黑龍江省林業(yè)科學(xué)院森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081）

細(xì)胞內(nèi)核糖體在mRNA 和tRNA 的協(xié)同作用下，形成核糖體大小亞基蛋白，真核生物核糖體的兩個亞基分別為60S 和40S，幾十種核糖體蛋白和幾種rRNA 構(gòu)成一個核糖體[1,2]。研究表明，昆蟲體內(nèi)的核糖體蛋白功能除參與蛋白質(zhì)的合成外，還參與細(xì)胞增殖與分化、生長發(fā)育及調(diào)控等生理過程。如核糖體蛋白基因GdRpS3 在沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段的表達(dá)與其生長發(fā)育階段及環(huán)境溫度有關(guān)，在其成蟲滯育過程中起著重要作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在缺乏營養(yǎng)的條件下，生物體表現(xiàn)出抑制rRNA 的合成，進(jìn)而打破核糖體蛋白與核糖體RNA之間的平衡關(guān)系，而此時多余的核糖體蛋白L5和L11 與泛素蛋白連接酶E3（E3UbiquitinLigases）樣蛋白MDM2 結(jié)合，加速了脂肪細(xì)胞的脂解過程，使線粒體內(nèi)脂肪酸β 氧化增強，對抗生物體缺乏營養(yǎng)的不利環(huán)境[4,5]。而在這一過程中，RpS3、RpS15、RpL5和RpL11 等不同類型的核糖體蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和營養(yǎng)循環(huán)的作用[6]。

糖體核糖體蛋白RpS8 是一類周期素依賴性激酶11（Cyclin-dependent kinases,CDK11）p46 相互作用蛋白，CDK11 蛋白家族以絲氨酸（Serine，Ser）或蘇氨酸（Threonine,Thr）蛋白激酶的形式在生物體內(nèi)參與細(xì)胞周期和細(xì)胞分化的調(diào)控[7]。有研究發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白基因NlRpS8 在褐飛虱生長和繁殖中發(fā)揮著重要的作用[3]。光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）是一種世界性害蟲，以幼蟲在樹木主干和主枝中蛀坑取食形成危害，分布廣泛，危害楊、柳、榆、槭等十幾種樹種，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[8-11]。解析核糖體蛋白在光肩星天牛生長發(fā)育過程中的功能作用，有助于探索控制光肩星天牛新的方法或途徑，而有關(guān)核糖體蛋白RpS8 在光肩星天牛功能特征還不明確。本研究在分析光肩星天牛AgRpS8序列結(jié)構(gòu)及克隆該基因的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)方法預(yù)測其功能，采用實時熒光定量PCR 方法解析了該基因的時空表達(dá)情況，為進(jìn)一步明確AglaRpS8 功能特征及在光肩星天牛生長發(fā)育過程中的作用機制奠定基礎(chǔ)，以期為光肩星天牛利用靶標(biāo)基因防治提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

光肩星天牛采集于哈爾濱市哈平路行道綠化樹的糖槭。幼蟲和蛹于4～6 月、9～11 月通過解剖被害木段收集；成蟲于7 月上旬至8 月下旬通過人工捕捉收集，在實驗室內(nèi)將雌雄成蟲分開，經(jīng)液氮處理后，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Taq PCR Master 試劑盒、RNA Extraction Kit 提取試劑盒、Taq MasterMix DNA 聚合酶、PrimeScript RT reagent Kit、RNA 酶抑制劑均購于Takara。Prime Script RT reagent Kit、CDSⅢ/3′PCR primer 試劑盒，GenEluteTM回收凝膠試劑盒、Plasmid Extraction Mini Kit 質(zhì)粒提取試劑盒等為Sigma 公司產(chǎn)品?？寺≥d體pMD18T、DH5a 感受態(tài)細(xì)胞由Tiangen 生化提供。

1.3 序列分析

光肩星天牛核糖體蛋白基因AgRpS8（Accession：XP_023310889）CDS 序列從Genbank 中查詢獲得?；蚩寺〖盁晒舛繉嶒炈靡锢肞rimer Premire 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計（表1），由上海美吉生物公司完成。AgRpS8 基因的同源性采用NCBI中的BlastX 和MAFFT 進(jìn)行序列比對分析；AgRpS8蛋白的分子質(zhì)量、等電點等理化性質(zhì)利用在線軟件ExPASy 進(jìn)行分析；AgRpS8 蛋白是否具有信號肽用SignalP V4.1 程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行預(yù)測，是否具有跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)通過TMHMM2.0 預(yù)測。與其他昆蟲的核糖體蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹采用MEAG7 軟件進(jìn)行構(gòu)建并分析。

表1 AgRpS8 基因克隆及熒光定量所用引物

1.4 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成

各取雌雄光肩星天牛成蟲1 頭，于研缽中浸入液氮研磨，利用RNA Extraction Kit 試劑盒提取總RNA，并利用PrimeScript RT reagent Kit 和CDSⅢ/3′PCR primer 反轉(zhuǎn)錄，37℃下培養(yǎng)1 h，生成cDNA 第一鏈。合成后置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存，以待后續(xù)實驗所用。

1.5 qRT-PCR 測定AgRpS8 的時空表達(dá)分析

收集雌雄光肩星天牛1～2 齡、3～4 齡幼蟲、5 齡幼蟲、雄成蟲、初羽未交尾雌成蟲、交尾后懷卵雌成蟲，提取各蟲態(tài)或齡期RNA。根據(jù)CDS 序列設(shè)計引物和內(nèi)參基因見表1。使用50 μL PCR 體系反應(yīng)，在90 ℃下持續(xù)35 s，隨后以95 ℃持續(xù)10 s，以65 ℃持續(xù)30 s，60～90 ℃以0.5 ℃遞增5 s 的40 個循環(huán)生成熔解曲線。每個反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)，基因表達(dá)量利用2-ΔΔCt方法計算[12]。使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0 分析基因在各樣品中相對表達(dá)水平,利用單因素方差（AVOVA）進(jìn)行多重比較分析基因相對表達(dá)量的差異顯著性水平（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgRpS8 基因序列分析

AgRpS8 基因開放閱讀框ORF 區(qū)長度627 pb,編碼208 個氨基酸，無跨膜螺旋區(qū)，N 端沒有信號肽，該蛋白屬于無跨膜螺旋及信號肽結(jié)構(gòu)蛋白（圖1）。經(jīng)在線軟件ExPASy 預(yù)測，AgRpS8 基因等電點（Pl）為5.21，分子量（Mw）為49.992KDa。經(jīng)Hphob方法分析，AgRpS8 基因序列中，疏水性第121 位氨基酸為Hydropathy Score 最高值3.87，第21 位氨基酸為Hydropathy Score 最小值-4.07（圖2）。

圖1 AgRpS8 基因DNA 序列及編碼蛋白的氨基酸序列

圖2 AgRpS8 疏水性分析

AgRpS8 基因保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測為PTZ00148 超級家族40S 核糖體蛋白S8（40S ribosomalprotein S8），其中長度1-618pb 與其一致，E-value 值1.18e-115（圖3）。從AgRpS8 中發(fā)現(xiàn)了6 個p-value 值較高的Motif 結(jié)構(gòu)，為核糖體蛋白家族中常見的保守的結(jié)構(gòu)特點（圖4）。通過BlastP 同源性及序列比對結(jié)果表明，與AgRpS8 同源性排列前三的核糖體蛋白基因依次為：意大利蜜蜂（Apis mellifera）AmRpS8 基因，同源性為87.02%；草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）SfRpS8 基因，同源性為83.65%；果蠅（Drosophila melanogaster）DmRpS8 基因，同源性為78.37%（圖4）。

圖3 AgRpS8 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

圖4 AgRpS8 基因motif 結(jié)構(gòu)分析

圖5 AgRpS8 基因與果蠅、意大利蜜蜂、草地貪夜蛾Rps8 序列比對

進(jìn)一步與其他昆蟲核糖體蛋白RpS8 建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），分析表明，光肩星天牛AgRpS8與赤擬谷盜的2 個核糖體蛋白（TcRpS8-like、TcRpS8）聚集在同一個分支上，表明光肩星天牛AgRpS8 核糖體蛋白與赤擬谷盜的2 個核糖體蛋白可能具有類似的功能，親緣性接近。

圖6 AgRpS8 與其它昆蟲RpS8 的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 AgRpS8 基因的時空表達(dá)特征

通過pMD18-T 載體設(shè)計AgRpS8 基因的引物，選取引物酶切點XbaI 和XmaI（圖7），結(jié)果顯示，核糖體蛋白基因AgRpS8 的相對表達(dá)量在光肩星天牛不同發(fā)育階段均有一定量的表達(dá)，在幼蟲1～2 齡期，3～4 齡期，5 齡期相對表達(dá)量較平穩(wěn)；而在光肩星天牛成蟲期相對表達(dá)量較低；但在光肩星天牛雌蟲交配后懷卵的發(fā)育階段相對表達(dá)量達(dá)到最高值2.46，顯著高于其他發(fā)育階段（P＜0.05）（圖8）。

圖7 pMD18-T 載體酶切點

圖8 AgRpS8 基因在光肩星天牛不同發(fā)育階段相對表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

昆蟲體內(nèi)的核糖體對于維持其正常的生命活動和調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育起著關(guān)鍵作用[13-15]。CDK11 家族蛋白在細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮有重要的作用，RpS8 作為一類核糖體亞基蛋白，參與調(diào)控分泌及代謝途徑[3-5]。本研究解析了光肩星天牛核糖體蛋白AglaRpS8 基因序列結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)和功能特征，在基礎(chǔ)上通過基因保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)發(fā)育分析，AglaRpS8 基因與鞘翅目赤擬谷盜核糖體蛋白TcRpS8 和TcRpS8-like 在結(jié)構(gòu)與功能上可能存在相似的作用。

核糖體蛋白AgRpS8 在光肩星天牛不同發(fā)育階段均有不同程度的表達(dá)，在幼蟲1～5 齡期表達(dá)量較高，在雄性光肩星天牛成蟲和雌性未交配的光肩星天牛成蟲中表達(dá)量降低，而在交配后懷卵的雌性光肩星天牛成蟲中表達(dá)量達(dá)到最高值。這一結(jié)果表明，核糖體蛋白AgRpS8 基因可能參與光肩星天牛雌蟲孕育過程中細(xì)胞的增殖和蛋白質(zhì)合成。本研究初步解析了核糖體蛋白基因AgRpS8 在光肩星天牛不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律，對可能發(fā)揮的功能進(jìn)行了預(yù)測，但未進(jìn)行驗證，是否發(fā)揮有其他生理功能作用也尚不明確，因此，有待進(jìn)一步開展AgRpS8 基因的生理機制及相關(guān)代謝通路的研究。