閆亞哲，聞 豪，杜 江，楊 勇，劉正杰,3，林 春,3，文國(guó)松,3，毛自朝,3

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南生物谷藥業(yè)股份有限公司，昆明 650503；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)小宗作物研究中心，昆明 650201)

【研究意義】燈盞花學(xué)名短葶飛蓬[Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand.-Mazz.]為菊科飛蓬屬草本植物。從燈盞花中已鑒定出黃酮及黃酮苷類、吡喃酮類、倍半萜、咖啡酰類等成分，其中黃酮及黃酮苷類和咖啡酸酯是其主要活性化合物[1-3]。燈盞乙素是從燈盞花中提取的黃酮苷類活性成分，能透過(guò)血腦屏障，可以有效改善血液循環(huán)，臨床多用于預(yù)防和治療心腦血管疾病，如中風(fēng)、冠心病、心絞痛、腦缺血等[4]。由于過(guò)度開采，燈盞花野生資源日益枯竭，篩選高燈盞乙素種源，培育優(yōu)良栽培品種是今后燈盞花育種的一個(gè)重要方向[5]。【前人研究進(jìn)展】隨著測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已經(jīng)成為挖掘藥用植物新基因、解析次生代謝生物合成途徑和基因表達(dá)水平的重要方法[6]。Chen等[7]利用茉莉酸甲酯(MeJA)處理的燈盞花樣品轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定了13個(gè)類黃酮合成相關(guān)的候選基因。張薇等[8]通過(guò)對(duì)自花授粉和異花授粉的燈盞花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析自交不親和相關(guān)的候選基因。田寶強(qiáng)等[9]利用Illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)低氮脅迫(LN)和正常對(duì)照(CK)的燈盞花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探究了燈盞花對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)機(jī)理。2017年通過(guò)組合2代與3代測(cè)序技術(shù)，組裝scaffold水平的基因組草圖[10]，2019年通過(guò)PacBio和Hi-C測(cè)序燈盞花基因組組裝到染色體水平[11]，為燈盞花藥用活性化合物的合成與積累提供研究基礎(chǔ)。燈盞乙素生物合成途徑已經(jīng)被闡明，分為以下3個(gè)階段。具體是①苯丙烷途徑：苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)的作用下生成4-香豆酰輔酶A；②核心類黃酮途徑：4-香豆酰輔酶A在查爾酮合酶(CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的作用下生成柚皮素；③柚皮素在黃酮合酶(FSII)的催化下脫氫形成芹菜素，芹菜素在黃酮6-羥化酶(F6H)和野黃芩苷7-O-葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(F7GAT)催化下形成燈盞乙素[10-15]。柚皮素是其他黃酮類化合物的主要前體物質(zhì)，通過(guò)不同的分支途徑，分別可以生成花青素、原花青素、黃酮、黃酮醇和異黃酮等[16]，如在黃烷酮3-羥化酶(F3H)作用下進(jìn)入花青素、原花青素途徑[17-18]。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊生超研究團(tuán)隊(duì)與中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所江會(huì)鋒研究團(tuán)隊(duì)合作，在燈盞花基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，篩選到燈盞花素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因(EbF6H和EbF7GAT)，并在釀酒酵母底盤細(xì)胞中構(gòu)建了燈盞乙素全合成的細(xì)胞工廠，首次實(shí)現(xiàn)了燈盞乙素的全合成[19]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】首先通過(guò)HPLC測(cè)定燈盞乙素含量，再對(duì)高、低燈盞乙素樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。分析燈盞乙素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)情況，對(duì)所得差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的分析為進(jìn)一步研究燈盞乙素合成與積累，為燈盞花種質(zhì)資源篩選及分子育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為燈盞花“生物谷1號(hào)”， 采集地為云南生物谷藥業(yè)股份有限公司彌勒燈盞花種植基地。彌勒市屬燈盞花道地產(chǎn)區(qū)，亞熱帶季風(fēng)氣候，年降雨量952 mm，年均溫度18.8 ℃，日照時(shí)數(shù)長(zhǎng)達(dá)2176 h，無(wú)霜期326 d，土壤為砂質(zhì)紅壤，紅河州特殊的地理位置，得天獨(dú)厚的氣候條件，非常適宜燈盞花生長(zhǎng)。

2017年8月16日于盛花期采燈盞花葉片樣品，各樣品一式兩份，一份用于活性化合物的測(cè)定，另一份保存于液氮中用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。燈盞花基因組數(shù)據(jù)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)楊生超研究團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 燈盞乙素含量測(cè)定 參照《中國(guó)藥典，2020》等方法[20-21]，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸溶液(40∶60)為流動(dòng)相；流速為每分鐘1.0 mL；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm，每份樣品測(cè)3個(gè)重復(fù)，測(cè)定燈盞花中燈盞乙素的含量。并用Excel和SPSS對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 基于燈盞乙素含量測(cè)定結(jié)果，選擇有顯著差異的4組燈盞花樣品(每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，送武漢古奧基因科技有限公司完成RNA測(cè)序，于2020年6月完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。提取RNA質(zhì)量檢測(cè)合格后，進(jìn)行mRNA富集純化、片段化，構(gòu)建Illumina測(cè)序文庫(kù)，進(jìn)行雙端(pair-end)測(cè)序，每份樣品獲得約12 Gb數(shù)據(jù)。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 燈盞花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所獲得原始測(cè)序片段(Raw reads)，過(guò)濾總體質(zhì)量較低、含有測(cè)序引物、末端質(zhì)量偏低等不合格的Reads后得到Clean reads；預(yù)處理后的Clean reads比對(duì)到燈盞花基因組，定量燈盞花基因表達(dá)水平。用DESeq2軟件篩選燈盞花不同樣品間DEGs。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 2020年10月采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)部分DEGs的表達(dá)情況。各試劑加量及擴(kuò)增程序參照TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒說(shuō)明書，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因在各個(gè)樣品中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 燈盞乙素含量

用HPLC測(cè)定33份燈盞花樣品(每份樣品測(cè)3個(gè)重復(fù))葉片中燈盞乙素含量，選擇4組燈盞花樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，其中S3、S5和S6為高燈盞乙素含量樣品，S4(CK)為低燈盞乙素含量對(duì)照樣品(CK)。S3中燈盞乙素含量最高為4.53 mg/g，S4(CK)中燈盞乙素含量最低為2.00 mg/g；如圖1所示，S3、S5的燈盞乙素含量極顯著(P<0.01)高于S4(CK)，S6的燈盞乙素含量顯著(P<0.05)高于S4(CK)。

**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)** indicate the extremely significant difference (P<0.01),* indicates the significant difference (P<0.05)圖1 燈盞花燈盞乙素含量Fig.1 Scutellarin content in E.breviscapus

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

燈盞花轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾、除雜等預(yù)處理后共得到152.32 Gb的Clean reads，每個(gè)樣品數(shù)據(jù)量在10.77～14.84 Gb，測(cè)序質(zhì)量和深度符合要求，可以用于后續(xù)分析。預(yù)處理后的Clean reads與燈盞花參考基因組比對(duì)[11]，其中S5比對(duì)率最高為71.46%，S6比對(duì)率最低為67.75%(表1)。

表1 燈盞花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 1 Preprocessing results of transcriptome data of E. breviscapus

2.3 燈盞乙素合成相關(guān)基因表達(dá)分析

燈盞花基因組可編碼基因中，注釋到5條KEGG通路與燈盞乙素生物合成相關(guān)(表2)。KEGG通路中苯丙烷生物合成(ko00940)有200個(gè)基因，類黃酮生物合成(ko00941)有57個(gè)基因，苯丙烷代謝(ko00360)有36個(gè)基因，黃酮和黃酮醇生物合成(ko00944)有4個(gè)基因，異黃酮生物合成(ko00943)有3個(gè)基因。

表2 燈盞乙素合成相關(guān)途徑及基因數(shù)目Table 2 Pathways and genes number related to scutellarin biosynthesis

如圖2-A所示，與燈盞乙素生物合成相關(guān)的基因，苯丙烷途徑中鑒定了6條PAL、2條C4H、5條4CL；核心類黃酮途徑中鑒定了4條CHS、6條CHI；燈盞乙素分支途徑中的FSII、F6H、F7GAT是單拷貝基因，3個(gè)基因串聯(lián)定位在第1號(hào)染色體上115 kb的片段內(nèi)?？Х人狨シ种緩借b定了5條HCT、4條C3H。其它分支途徑鑒定了1條F3H、4條F3’H和5條FLS。這些酶基因在各個(gè)樣品中的表達(dá)水平(TPM)以熱圖呈現(xiàn)(圖2-B)。

A：燈盞乙素合成通路圖；B：基因表達(dá)熱圖A: Scutellarin biosynthesis pathway; B: Heatmap of enzyme genes 圖2 燈盞乙素合成通路及共表達(dá)基因熱圖Fig.2 Scutellarin biosynthesis pathway and genes heatmap

2.4 差異表達(dá)基因篩選

將高燈盞乙素含量樣品S3、S5和S6分別與低燈盞乙素含量樣品S4兩兩比較，分析差異表達(dá)基因DEGs。結(jié)S3vsS4共有2143個(gè)DEGs，S5vsS4有1968個(gè)DEGs，S6vsS4有1801個(gè)DEGs。3組兩兩比較的差異表達(dá)基因有490個(gè)共同基因(圖3)，其中277個(gè)在高燈盞乙素含量樣品中上調(diào)表達(dá)，另外213個(gè)下調(diào)表達(dá)。它們可能在燈盞乙素的生物合成或調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可作為后續(xù)研究的重點(diǎn)。

A、B、C分別表示S3vsS4、S4vsS5和S4vsS6差異表達(dá)基因火山圖；D表示3組差異比較組合的韋恩圖A, B and C represent differential expression genes of S3vsS4, S4vsS5 and S4vsS6, respectively; D represents the venn diagram of the three groups of difference comparison圖3 燈盞花差異表達(dá)基因Fig.3 Differentially expressed genes in E. breviscapus

差異表達(dá)基因KEGG富集分析結(jié)果(圖4)顯示，S3vsS4、S4vsS5和S4vsS6分別有13、14、14條基因在類黃酮生物合成(ko00941：Flavonoid biosynthesis)途徑。其中CHI有3條(Eb_V2_03181、Eb_V2_17259、Eb_V2_40770)，F(xiàn)3H有1條(Eb_V2_40771)，F(xiàn)3’H有2條(Eb_V2_04241、Eb_V2_04245)，HCT有4條(Eb_V2_04655、Eb_V2_06276、Eb_V2_15753和Eb_V2_38267)，CCoAMT有3條(Eb_V2_10078、Eb_V2_20841和Eb_V2_34161)。另外，燈盞乙素合成第三階段的起始酶FSII在低燈盞乙素樣品S4中表達(dá)量最低，但由于該基因基礎(chǔ)表達(dá)水平較高，log2FoldChange小于1，沒有被篩選為DEG，推測(cè)FSII在燈盞乙素積累也有重要作用。

圖4 差異表達(dá)基因KEGG代謝通路富集Fig.4 DEGs enriched in KEGG pathway

2.5 差異表達(dá)基因qRT-PCR分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果可靠性，選擇燈盞乙素生物合成相關(guān)的5個(gè)差異表達(dá)基因CHI(Eb_V2_03181)、F3H(Eb_V2_40771)、F3’H(Eb_V2_04241)、HCT(Eb_V2_4655)、CCoAMT(Eb_V2_20841)進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，上述基因的差異表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。類黃酮代謝下游的基因CHI、F3H和F3’H在低燈盞乙素樣品S4(CK)中下調(diào)表達(dá)，參與咖啡酸酯途徑的HCT和CCoAMT基因在S4(CK)中上調(diào)表達(dá)(圖5)。

圖5 5個(gè)差異基因的qRT-PCRFig.5 qRT-PCR of 5 DEGs

2.6 燈盞乙素合成相關(guān)DEGs生物信息學(xué)分析

CHI(Eb_V2_03181)蛋白質(zhì)分子量(Molecular weight，Mw)為27.17 kD，理論等電點(diǎn)(Theoretical isoelectric point, pI)為4.66，F(xiàn)3H(Eb_V2_40771)蛋白質(zhì)Mw為41.15，pI為5.67，F(xiàn)3’H(Eb_V2_04241)蛋白質(zhì)Mw為39.92，pI為8.87，HCT(Eb_V2_4655)蛋白質(zhì)Mw為46.88，pI為5.43，CCoAMT(Eb_V2_20841)蛋白質(zhì)Mw為29.36，pI為5.32。在線預(yù)測(cè)結(jié)果顯示F3’H(Eb_V2_04241)存在跨膜結(jié)構(gòu)域?；騿?dòng)子區(qū)域順式作用元件分析(圖6)結(jié)果顯示，啟動(dòng)子區(qū)域含有大量光反應(yīng)元件，同時(shí)還有生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸、水楊酸和茉莉酸甲酯等激素響應(yīng)元件。F3H(Eb_V2_40771)、F3’H(Eb_V2_04241)、HCT(Eb_V2_4655)基因啟動(dòng)子區(qū)域含有MYB結(jié)合位點(diǎn)。

圖6 5個(gè)差異表達(dá)基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件Fig.6 Cis-acting elements in promoter regions of 5 DEGs

3 討 論

3.1 燈盞乙素生物合成關(guān)鍵基因

燈盞乙素是燈盞花中的黃酮苷，臨床證明燈盞乙素對(duì)高血壓、腦溢血、腦栓塞及其后遺癥具有較好療效[22-23]。隨著燈盞花基因組的發(fā)表，燈盞乙素生物合成途徑中合成酶基因及催化步驟已基本被闡明，并實(shí)現(xiàn)在酵母中表達(dá)來(lái)合成燈盞乙素[19]。燈盞花基因組可編碼基因中，注釋到5條KEGG通路與燈盞乙素生物合成相關(guān)。值得關(guān)注的是，直接參與燈盞乙素合成的FSII(Eb_V2_05115)、F6H(Eb_V2_05117)、F7GAT(Eb_V2_05114)都是單拷貝基因，且3個(gè)基因定位在第1號(hào)染色體上115 kb的片段內(nèi)，形成功能相關(guān)的基因簇。推測(cè)該區(qū)間內(nèi)存在響應(yīng)生物或非生物信號(hào)的DNA片段，在燈盞乙素的合成和積累中發(fā)揮重要作用。類似于原核生物的操縱子，在玉米、水稻、擬南芥、番茄等植物的基因組中存在彼此功能相關(guān)的非同源基因簇，分別參與合成苯并噁唑嗪酮類、萜類和生物堿類等次生代謝產(chǎn)物[24]。基因簇可以通過(guò)不同調(diào)控因子和染色質(zhì)重塑等調(diào)節(jié)作用，實(shí)現(xiàn)基因簇中各基因的共表達(dá)和共調(diào)控，從而使代謝途徑的調(diào)控更具有協(xié)同性[25]。

3.2 燈盞乙素合成相關(guān)基因表達(dá)分析

本研究在HPLC測(cè)定燈盞花葉片燈盞乙素含量的基礎(chǔ)上，結(jié)合RNAseq技術(shù)以高、低燈盞乙素含量葉片為材料篩選DEGs。差異表達(dá)基因KEGG富集分析分別有13、14、14條基因在類黃酮生物合成(ko00941：Flavonoid biosynthesis)途徑，差異趨勢(shì)一致的有3條CHI，1條F3H，2條F3’H，4條HCT，3條CCoAMT。其中類黃酮代謝下游的基因CHI、F3H和F3’H在高燈盞乙素含量樣品中上調(diào)表達(dá)，參與咖啡酸酯途徑的HCT和CCoAMT基因在低燈盞乙素含量樣品S4中上調(diào)表達(dá)。

CHI是黃酮代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，降低CHI活性或CHI基因突變體能導(dǎo)致黃酮化合物的含量顯著降低[26]，矮牽牛CHI基因轉(zhuǎn)入番茄后，其果皮中黃酮類含量比對(duì)照增加了78倍。Chen等[27]通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)EbCHI的燈盞花毛狀根體系，使燈盞乙素的積累有顯著提高，其含量最高為天然根的10倍。本研究中，燈盞花CHI表達(dá)量在高燈盞乙素樣品中明顯高于低燈盞乙素樣品，再次說(shuō)明CHI在類黃酮代謝中發(fā)揮重要作用。參與花青素途徑的基因F3H和F3’H，在高燈盞乙素樣品中上調(diào)表達(dá)。相反，參與類黃酮上游咖啡酸酯途徑的基因HCT和CCoAMT，在低燈盞乙素樣品中上調(diào)表達(dá)。從苯丙烷代謝整體來(lái)看HCT和CCoAMT的高表達(dá)，使更多的原料去往咖啡酸酯途徑，從而導(dǎo)致S4樣品中的燈盞乙素含量顯著降低。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)高、低燈盞乙素含量燈盞花樣品進(jìn)行RNAseq測(cè)序，篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)5個(gè)與燈盞乙素生物合成相關(guān)DEGs進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序TPM差異表達(dá)趨勢(shì)一致，CHI、F3H和F3’H在高燈盞乙素樣品中上調(diào)表達(dá)，HCT和CCoAMT基因在低燈盞乙素樣品中上調(diào)表達(dá)。此外，發(fā)現(xiàn)單拷貝的FSII、F6H、F7GAT形成基因簇定位在1號(hào)染色體上。本研究有助于進(jìn)一步了解燈盞乙素生物合成機(jī)制。