董蓉嬌，彭進喬，尹元萍，王天明，梁 坤，楊曉菲，董文漢，張雅瓊，梁 泉

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處，昆明 650201；4.云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，昆明 650500)

【研究意義】磷是作物養(yǎng)分三要素之一，參與了植物的光合作用、呼吸代謝、能量轉(zhuǎn)化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物大分子合成以及酶活性的調(diào)節(jié)等，缺磷將導(dǎo)致作物營養(yǎng)失調(diào)，最終影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。作物所需的磷素90%以上來自土壤，土壤缺磷的現(xiàn)象在世界范圍內(nèi)普遍存在，至少有30%～40% 的作物產(chǎn)量受到低磷脅迫的嚴(yán)重抑制，中國南方地區(qū)酸性土壤上尤為嚴(yán)重[1]。土壤中全磷含量并不低，但由于有效磷含量低、磷的移動性差、磷容易被土壤固定，以及磷的當(dāng)季利用率低等原因[2-3]，遠遠不能滿足作物生長發(fā)育的需要。傳統(tǒng)種植中主要通過施用磷肥來解決土壤磷供應(yīng)不足的問題。但是，施用的磷肥容易被土壤固定為難溶性磷，并且磷肥的當(dāng)季利用率一般只有10%～20%，大部分磷肥由于不能被作物及時吸收利用而流失，導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，造成環(huán)境的污染。因此，開展作物磷高效利用的種質(zhì)資源篩選，培育磷高效利用的作物新品種，提高作物活化和利用土壤磷庫的能力，是解決作物需磷與土壤供磷矛盾、改善植物磷素營養(yǎng)狀況的有效途徑。植物對磷的吸收和利用能力的相對大小以磷效率(Phosphorus efficiency)來表示。了解作物高效吸收利用磷的生理和分子機制是作物磷效率遺傳改良的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。前人提出諸如生理指示性狀、生長發(fā)育指標(biāo)以及經(jīng)濟產(chǎn)量等一系列磷效率的評價指標(biāo)，如根系形態(tài)[4]、根冠比[5]、單株籽粒重[6]等。但由于取樣分析難度大以及缺乏特異性指標(biāo)，導(dǎo)致準(zhǔn)確性不高、篩選效率低?！厩叭搜芯窟M展】擬南芥[7]、水稻[8]、大豆[9]、菜豆[10]、玉米[11]、柱花草[12]、臍橙[13]在低磷脅迫條件下根系酸性磷酸酶(ACP)活性都增加。田江等研究表明大豆真葉和根ACP活性隨著缺磷處理時間顯著增加[14]。敖雪等在對磷脅迫條件下不同大豆基因型保護酶活性的研究中，發(fā)現(xiàn)磷高效品種的過氧化物酶(POD)活性在生殖生長階段較高，后期仍保持較高水平[15]。李濤通過對低磷脅迫下熊貓豆側(cè)根增多的生理機制研究，發(fā)現(xiàn)低磷脅迫條件下根系中吲哚乙酸氧化酶(IAAO)和POD活性高于正常施磷水平[16]。李玉京等研究表明低磷營養(yǎng)脅迫條件下，長春偃麥草—中國春和燈芯偃麥草—中國春兩套二體異附加系分泌的ACP和核糖核酸酶(RNAse)活性都不同程度的顯著提高[17]?！颈狙芯壳腥朦c】根系是植物吸收利用土壤磷的主要器官。因此，提高作物磷效率重點在于提高根系對磷的吸收利用。目前關(guān)于低磷脅迫條件下大豆根際酶活性變化方面的相關(guān)研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究設(shè)置高磷(1 mmol/L KH2PO4)和低磷(0.5 μmol/L KH2PO4)的水培試驗，探索大豆磷高效近等基因系根際ACP、POD、RNAse、IAAO活性的變化，為大豆耐低磷生理機制及磷高效大豆品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為本課題組培育的大豆磷高效相關(guān)根形態(tài)構(gòu)型近等基因系(NIL)[18]及其受體親本BD2(CK)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 采用水培試驗，在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進行，設(shè)置高磷(1 mmol/L KH2PO4，HP)和低磷(0.5 μmol/L KH2PO4，LP)2個磷水平，3次重復(fù)，每重復(fù)中NIL和BD2分別種植12株，每批次測定1種酶，15 d取樣分析。

每個處理各挑選60粒飽滿種子，用10%過氧化氫進行表面消毒，放在噴灑過1/2大豆水培全營養(yǎng)液的濾紙上萌發(fā)和催芽，將發(fā)芽盒放置在光照培養(yǎng)箱(光照12 h/d)，每日噴灑1/2大豆水培全營養(yǎng)液，待種子主根長出1 cm左右，將種苗移栽到裝有1/2大豆水培全營養(yǎng)液的塑料盆中培養(yǎng)。待大豆兩片子葉完全展開時，取生長均勻一致的幼苗移入對應(yīng)磷濃度營養(yǎng)液(HP、LP)中。移苗時要注意保持根部的完整性，按照定植板上的標(biāo)簽對號移入，用海綿固定幼苗。水培期間定時通氣，每隔2 d用H2SO4或KOH調(diào)節(jié)pH(5.8～6.0)，每隔3 d全部處理更換高、低磷營養(yǎng)液。大豆幼苗生長期間的平均溫度為 28/19 ℃(日/夜)，相對濕度為 80%，光照時間為12 h/d。

1.2.2 酶活性測定方法 采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的比色法酸性磷酸酶測定試劑盒、比色法過氧化物酶測定試劑盒、植物核糖核酸酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒、植物吲哚乙酸氧化酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒，按照說明書的步驟操作。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行整理統(tǒng)計，利用DPS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan法檢驗不同處理間的差異顯著性，Excel 2010進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性磷酸酶活性分析

由圖1可見，低磷脅迫條件下，NIL與BD2(CK)根系的ACP活性均顯著高于高磷水平，分別增加31.66%、17.25%；NIL和BD2(CK)葉片的ACP活性都高于其高磷水平，其中NIL葉片ACP活性顯著提高，增加14.73%，但BD2(CK)葉片ACP活性僅增加6.21%，與高磷水平差異不顯著。NIL與BD2(CK)比較，2種供磷條件下NIL根系A(chǔ)CP活性均顯著高于BD2(CK)，分別增加6.78%、19.91%；高磷條件下NIL和BD2(CK)葉片ACP活性差異不顯著，低磷條件下NIL葉片ACP活性顯著高于BD2(CK)，增加10.47%。高磷和低磷條件下，NIL根系A(chǔ)CP活性分別是葉片的2.79、3.2倍，BD2(CK)根系A(chǔ)CP活性分別是葉片的2.67、2.95倍。

圖中不同小寫字母表示差異達5%顯著水平，下同Different lowercase letters in the figure indicate that the difference reaches a significant level of 5%, the same as below圖1 不同供磷條件下NIL和BD2(CK)酸性磷酸酶活性比較Fig.1 Comparison of acid phosphatase activity between NIL and BD2(CK) under different phosphorus supply conditions

2.2 過氧化物酶活性分析

由圖2可見，低磷脅迫條件下，NIL和BD2(CK)根系POD活性均顯著高于高磷水平，分別增加20.98%、30.58%；NIL和BD2(CK)比較，高磷和低磷條件下，NIL根系POD活性都顯著高于BD2(CK)，分別高19.24%、10.48%。低磷脅迫條件下，NIL和BD2(CK)葉片POD活性均顯著高于其高磷水平，分別增加23.4%、6.55%；NIL和BD2(CK)比較，高磷和低磷條件下NIL葉片POD活性都顯著高于BD2(CK)，分別高9.54%、26.86%。高磷和低磷條件下，NIL和BD2(CK)根系POD活性明顯高于其葉片，NIL根系POD活性分別是其葉片的6.23、6.11倍，BD2(CK)根系POD活性分別是其葉片的5.72、7.01倍。

圖2 不同供磷條件下NIL和BD2(CK)過氧化物酶活性比較Fig.2 Comparison of peroxidase activity between NIL and BD2(CK) under different phosphorus supply conditions

2.3 核糖核酸酶活性分析

由圖3可見，低磷脅迫條件下，NIL和BD2(CK)根系RNase活性均顯著高于高磷水平，分別增加21.93%、49.60%；NIL和BD2(CK)比較，高磷和低磷條件下NIL根系RNAse活性均顯著高于BD2(CK)，分別增加49.34%、21.71%。低磷脅迫條件下，NIL和BD2(CK)葉片的RNase活性顯著高于其高磷水平，分別提高120.95%、99.73%；NIL和BD2(CK)比較，高磷條件下NIL和BD2(CK)葉片RNAse活性差異不顯著，低磷條件下NIL葉片RNAse活性顯著高于BD2(CK)，高15.94%。NIL和BD2(CK)根系和葉片RNAse活性比較，高磷和低磷條件下NIL根系RNAse活性分別是其葉片的2.42、1.34倍，BD2(CK)根系RNAse活性分別是其葉片的1.7、1.27倍。

圖3 不同供磷條件下NIL和BD2(CK)核糖核酸酶活性比較Fig.3 Comparison of ribonuclease activities between NIL and BD2(CK) under different phosphorus supply conditions

2.4 生長素氧化酶活性分析

由圖4可見，低磷脅迫條件下，NIL和BD2(CK)根系IAAO活性都顯著高于高磷水平，分別增加41.89%、52.32%；NIL和BD2(CK)比較，高磷和低磷條件下NIL根系IAAO活性都顯著高于BD2(CK)，分別高31.31%、22.31%。低磷脅迫條件下，NIL和BD2(CK)葉片IAAO活性均顯著高于高磷水平，分別增加18.52%、21.63%；NIL和BD2(CK)比較，高磷和低磷條件下NIL葉片IAAO活性都顯著高于BD2(CK)，分別高11.55%、8.7%。NIL和BD2(CK)根系和葉片IAAO活性比較發(fā)現(xiàn)，高磷和低磷條件下NIL根系IAAO活性分別是其葉片的1.43、1.71倍，BD2(CK)根系IAAO活性分別是其葉片的1.21、1.52倍。

圖4 不同供磷條件下NIL和BD2(CK)生長素氧化酶活性比較Fig.4 Comparison of auxin oxidase activity between NIL and BD2(CK) under different phosphorus supply conditions

3 討 論

ACP活性受植物供磷狀況的影響，低磷脅迫條件下植物體內(nèi)ACP活性提高，有利于有機磷的分解和再利用，根系分泌的ACP能水解土壤中的有機磷，提高磷效率[19]。不同大豆品種間，ACP活性越高的品種對磷吸收和再利用能力越強，耐低磷能力較強[20]；不同大豆基因型在不同磷脅迫時間內(nèi)ACP酶活性均增加，磷高效基因型根部和葉片酶活性增幅遠高于磷低效基因型，各基因型根部酶活性高于其葉片[21；磷高效大豆基因型的子葉ACP活性遠高于磷低效大豆基因型[22]；通過對不同磷處理下276個大豆基因型根部和葉部ACP活性研究發(fā)現(xiàn)，低磷條件下142個大豆基因型葉部和根部ACP活性高于高磷處理，66個基因型葉部ACP活性顯著高于根部，53個基因型根部ACP活性顯著高于葉部，說明低磷條件下不同基因型酶活性存在明顯差異，不同基因型根部和葉部酶活性高低也存在不同[23]。本研究中，低磷脅迫條件下NIL和BD2(CK)根系和葉片ACP活性與高磷水平相比差異顯著；不同磷水平下不同大豆基因型根系A(chǔ)CP活性均高于葉片，NIL根系和葉片的ACP活性顯著高于BD2(CK)；低磷脅迫條件下，不同大豆基因型ACP活性差異顯著，故ACP活性可作為磷高效基因型篩選指標(biāo)。

POD在植物體內(nèi)活性較高，是主要防御因子之一，能夠減少逆境脅迫對植物體的損傷，因此酶活性的變化程度可反應(yīng)出植物耐低磷能力的強弱[24]。研究表明低磷脅迫促使谷子根系POD活性增加[25]；小麥葉片POD活性上升[26]；不同基因型大豆POD活性降低，磷高效大豆品種BX10降幅小于磷敏感對照品種BD2[27]。本研究中，低磷脅迫條件下NIL和BD2(CK)根系和葉片POD活性與高磷水平相比差異顯著；不同磷水平下不同大豆基因型根系POD活性均高于葉片，NIL根系和葉片POD活性顯著高于BD2(CK)，說明POD活性越高的品種對低磷脅迫的適應(yīng)性越強，故POD活性可作為磷高效基因型篩選指標(biāo)。

植物體內(nèi)RNAse活性增強使RNA降解加劇釋放磷酸根離子，使其重新參與體內(nèi)磷素循環(huán)，根系分泌到根際中的RNAse能降解土壤中有機物質(zhì)釋放磷酸根離子[28]，故RNAse活性增強對于充分利用磷養(yǎng)分具有重要意義。低磷處理后不同基因型玉米RNase活性都有升高的趨勢，其中磷高效品種差異達極顯著水平[29]，說明RNase活性是磷高效品種的重要評價指標(biāo)。然而有研究認為低磷脅迫條件下苗期水稻根系RNase活性均明顯提高，但RNase活性在品種間差異不顯著，不可作為磷高效品種篩選指標(biāo)[30]，與本文研究結(jié)論存在一定差異，低磷脅迫條件下，NIL和BD2(CK)兩種基因型大豆根系和葉片的RNAse活性不同程度顯著提高，NIL酶活性顯著高于BD2(CK)；不同磷水平下不同大豆基因型根系RNAse高于葉片，因此RNAse活性增強是植物對低磷脅迫的一種適應(yīng)性變化，可作為磷高效基因型大豆篩選指標(biāo)。

IAAO是IAA分解代謝的關(guān)鍵酶，IAAO與植物不定根形成有關(guān)[31]，IAAO還與植物抗逆性有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)油菜子葉在營養(yǎng)脅迫1 d時，IAAO活性明顯下降，但之后逐漸增強，在11 d達到高峰，高出對照酶活性1倍以上，比處理前酶活性增加30%以上[32]。本研究中低磷脅迫條件下不同基因型大豆根系和葉片IAAO活性不同程度顯著提高，NIL酶活性顯著高于BD2(CK)；不同磷水平下不同大豆基因型根系IAAO活性高于葉片，可知IAAO活性增加是植物對低磷脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)之一，故IAAO活性可作為磷高效基因型篩選指標(biāo)之一。

4 結(jié) 論

低磷脅迫條件下，NIL根部ACP、POD、RNAse、IAAO活性均顯著高于BD2(CK)，分別提高19.91%、10.48%、21.71%、22.31%；葉部ACP、POD、RNAse、IAAO活性均顯著高于BD2(CK)，分別提高10.47%、26.86%、15.94%、8.7%。其中NIL和BD2(CK)根系A(chǔ)CP、POD、RNAse、IAAO活性均高于葉片，說明不同組織部位在磷脅迫條件下相關(guān)酶活性增加幅度存在差異，NIL和BD2(CK)適應(yīng)磷脅迫環(huán)境方面存在基因型差異，NIL明顯優(yōu)于BD2(CK)，故ACP、POD、RNAse、IAAO活性可作為磷效率評價指標(biāo)用于大豆磷高效基因型的篩選。