溫靈燕 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

PK15是一株癌變的豬腎傳代細(xì)胞系，中文名為豬腎上皮細(xì)胞，父母代源自1955年美國Stice提供的成年豬腎細(xì)胞PK-2a，被ATCC收藏（CCL-33）[1]。細(xì)胞具有很高的生長和增殖能力，可以無限傳代。該細(xì)胞對豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒等多種病毒比較敏感，已廣泛應(yīng)用于獸用疫苗的研究和生產(chǎn)[2]。傳統(tǒng)PK15細(xì)胞培養(yǎng)大多是貼壁型培養(yǎng)，但細(xì)胞貼壁轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝已不能滿足產(chǎn)業(yè)化疫苗生產(chǎn)需求，而且PK15細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)中會出現(xiàn)生長不穩(wěn)定的情況，反復(fù)傳代過程中細(xì)胞極容易抱團(tuán)，之后就可能表現(xiàn)出生長不良甚至不能繼續(xù)傳代等情況。貼壁細(xì)胞生產(chǎn)放大采用的細(xì)胞工廠或轉(zhuǎn)瓶工藝，勞動(dòng)強(qiáng)度大，可使用的細(xì)胞密度低，制約了規(guī)?；呙缟a(chǎn)工藝發(fā)展。

全懸浮培養(yǎng)技術(shù)與貼壁的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)相比有很大優(yōu)勢。全懸浮培養(yǎng)不需要載體，不需要血清，也不需要胰酶消化培養(yǎng)，減少人為介入，最重要的是細(xì)胞的生長密度不受附著物限制，工藝放大更簡單，只需要增加培養(yǎng)體積即可，能更快擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性，提高勞動(dòng)效率，長期使用成本低。本試驗(yàn)初步探討PK15細(xì)胞全懸浮條件下在錐形瓶上的生長和產(chǎn)毒情況，為之后放大至反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 PK15懸浮細(xì)胞株，由兆豐華生物科技（福州）有限公司自主馴化、保存；PCV2-DBN-SX07，由兆豐華生物科技（福州）有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 MEM，購自壹生科公司。

1.2 儀器設(shè)備 搖床；倒置生物顯微鏡37XB，購自上海光學(xué)儀器一廠；臺式低速離心機(jī)，購自上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠。

1.3 方法

1.3.1 健康細(xì)胞制備 復(fù)蘇一支凍存密度約為0.66×106個(gè)/mL的PK15懸浮細(xì)胞，離心后，棄上清，用預(yù)熱的壹生科MEM培養(yǎng)基輕輕吹打后全部加入至250 mL搖瓶中，搖瓶液體裝量為75 mL，混勻，取樣，計(jì)數(shù)，記錄起始細(xì)胞密度。放置在搖床上培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h取樣，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，記錄細(xì)胞密度。

1.3.2 細(xì)胞傳代 細(xì)胞長至72 h時(shí)，按傳代后所需要的細(xì)胞數(shù)計(jì)算出所需吸取的細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min后，棄上清，加入新鮮的懸浮培養(yǎng)液，放置搖瓶中混勻，取樣，計(jì)數(shù)，記錄起始細(xì)胞密度。于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h取傳代的細(xì)胞樣品計(jì)數(shù)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。以此方法連續(xù)傳代3次。

1.3.3 接毒試驗(yàn) 取一瓶生長良好的全懸浮細(xì)胞按相同的起始密度分成3個(gè)搖瓶細(xì)胞，按1%、3%、5%接毒量接種PCV2-DBN-SX07，病毒效價(jià)為106.5TCID50/mL。在72 h、96 h、120 h分別取樣，觀察細(xì)胞狀態(tài)并留樣測毒。共進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 PK15懸浮細(xì)胞搖瓶生長狀態(tài)觀察試驗(yàn) 從圖1可以看到，細(xì)胞在72 h時(shí)處于生長旺盛時(shí)期，所以本試驗(yàn)傳代的時(shí)間選擇在72 h。PK15懸浮細(xì)胞在剛復(fù)蘇時(shí)生長速度比較緩慢，在0～24 h，細(xì)胞處于潛伏期，細(xì)胞數(shù)目稍有增加；24～48 h處在適應(yīng)期，細(xì)胞開始慢慢適應(yīng)，生長密度為起始密度的2.27倍；到72 h細(xì)胞密度達(dá)到初始密度的3.03倍（見表1）。細(xì)胞適應(yīng)一代后，在24 h細(xì)胞密度達(dá)到初始密度的3.06倍，在48 h達(dá)3.62倍，到72 h為4.1倍（見表2）；細(xì)胞適應(yīng)二代后，增長倍數(shù)在72 h達(dá)到了8.1倍（見表3），而且細(xì)胞狀態(tài)越來越好，越來越圓潤透亮。從鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)（見圖2），三次培養(yǎng)的細(xì)胞除了在密度上有差別外，形態(tài)上差別不大，均比較圓潤，光澤度佳，細(xì)胞呈單個(gè)，極少數(shù)有兩個(gè)或三個(gè)的小團(tuán)塊，是比較理想的懸浮細(xì)胞的狀態(tài)。

表1 PK15懸浮細(xì)胞第一次生長情況

表2 PK15懸浮細(xì)胞第二次生長情況

表3 PK15懸浮細(xì)胞第三次生長情況

圖1 三次細(xì)胞生長折線圖

圖2 不同時(shí)間段細(xì)胞在顯微鏡下的狀態(tài)

2.2 PK15懸浮細(xì)胞產(chǎn)毒試驗(yàn) 本試驗(yàn)按照三個(gè)接毒量（1%、3%、5%）進(jìn)行比較。由第一次產(chǎn)毒試驗(yàn)結(jié)果可以看出（見表4、圖3），1%接毒量的細(xì)胞產(chǎn)毒效價(jià)比3%和5%略高，接毒量3%比5%的產(chǎn)毒效價(jià)略高，收獲病毒時(shí)間在72 h的效價(jià)比96 h和120 h效價(jià)高。故第一次產(chǎn)毒試驗(yàn)1%接毒量和收獲時(shí)間72 h是比較好的工藝。

表4 第一次接毒的效價(jià)結(jié)果

圖3 第一次接毒的效價(jià)結(jié)果折線圖

從表5、圖4可以看出，第二次產(chǎn)毒試驗(yàn)1%接毒量的效價(jià)比3%和5%略高，收獲病毒時(shí)間也是在72 h比96 h和120 h效價(jià)高。故第二次產(chǎn)毒試驗(yàn)1%接毒量和收獲時(shí)間在72 h也是比較合適的工藝。

圖4 第二次接毒的效價(jià)結(jié)果折線圖

表5 第二次接毒的效價(jià)結(jié)果

從表6、圖5可以看出，第三次產(chǎn)毒試驗(yàn)3%接毒量的效價(jià)比1%和5%都更有優(yōu)勢，在72 h時(shí)1%接毒量的效價(jià)比3%和5%略低一些，但在96 h和120 h的效價(jià)都比3%和5%接毒量略高。第三次產(chǎn)毒試驗(yàn)3%接毒量和收獲時(shí)間在72 h是比較合適的工藝。

圖5 第三次接毒的效價(jià)結(jié)果折線圖

表6 第三次接毒的效價(jià)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

在培養(yǎng)條件、接種密度合適的情況下，細(xì)胞能在比較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到對數(shù)生長期。本試驗(yàn)初步探索了PK15細(xì)胞懸浮搖瓶培養(yǎng)和接毒工藝，結(jié)果表明：細(xì)胞接種密度在0.5×106個(gè)/mL～0.6×106個(gè)/mL，可以使PK15細(xì)胞在搖瓶上生長，且細(xì)胞在搖瓶的最適傳代時(shí)間為72 h。三次接毒結(jié)果初步確定，在起始密度一樣的條件下，接毒量為1%和3%都是搖瓶培養(yǎng)適合的接毒工藝；收獲病毒時(shí)間在72 h比96 h和120 h更有優(yōu)勢。但是從規(guī)?；a(chǎn)考慮，接種劑量的大小和收獲時(shí)間的長短是重要的因素。接毒量小可以節(jié)省種毒量，收獲時(shí)間短也可以縮短生產(chǎn)周期，故選擇1%接毒量和收獲病毒時(shí)間在72 h作為最適的搖瓶培養(yǎng)工藝方案。后期將進(jìn)一步開展生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)工藝研究。