劉貴芳，田發(fā)益

（1.西藏農(nóng)牧學院動物科學學院，西藏林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學院生物技術中心，西藏林芝 860000）

維生素E（VE），又名生育酚、抗不育維生素，是苯并二氫吡喃衍生物的總稱（周筱丹等，2010）。研究表明，VE 具有增強免疫機能、有效防治疾病、改善繁殖性能、提高應激能力、調(diào)節(jié)基因表達及細胞信號轉(zhuǎn)導等重要的生理生化功能，是動物機體必需的一種微量營養(yǎng)素（張晉青等，2010）。在動物機體內(nèi)主要存在于血漿脂蛋白、細胞膜和脂庫中。VE 酚類化合物能釋放活性氫，阻斷自由基的鏈式反應，保護細胞膜和亞細胞膜（Angelo等，2000），使細胞膜上多不飽和脂肪酸（PUFA）免受活性氧自由基（ROS）的攻擊。

在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中，精準配方與按需補飼是關鍵，VE 含量是評價飼料中營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標。但西藏環(huán)境惡劣，冬春季節(jié)飼草匱乏，合理利用主要飼料作物進行飼料配制，以增強家畜機體免疫力和降低養(yǎng)殖成本十分必要。

青稞是西藏主要的糧食作物，多種植于3000 m以上的高原農(nóng)區(qū)，是具高原特色的農(nóng)作物之一。據(jù)報道，青稞富含蛋白質(zhì)、維生素及微量元素硒等營養(yǎng)成分，β-葡聚糖、黃酮類化合物及γ-氨基丁酸等活性物質(zhì)含量也較高。2019 年西藏青稞播種面積高達1.40×105hm2，占西藏總糧食作物播種面積的75.82%，產(chǎn)量為79.85 萬t，占總糧食產(chǎn)量的76.26%（2020 西藏統(tǒng)計年鑒，2021）。芫根（Brassica rapa L）適應高海拔氣候，塊根為主要的食用部分（西藏植物志第二卷，1985），主要含維生素、多糖、黃酮等成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌等作用（李雅雙等，2013）。研究表明，飼喂芫根的家畜，夏秋增膘長肉，冬春保膘，母畜可提高產(chǎn)奶量（中國飼用植物志第一卷，1987）。2020年，西藏小麥播種面積為3.661×104hm2，產(chǎn)量為18.73 萬t；玉米播種面積為4.66×103hm2，產(chǎn)量為2.50 萬t；豆類播種面積為4.85×103hm2，產(chǎn)量為1.76 萬t；稻谷播種面積為3.161×104hm2，產(chǎn)量為4331 t（2020西藏統(tǒng)計年鑒，2021）。因此測定西藏飼糧作物的VE 含量，可為西藏飼糧配制提供基礎數(shù)據(jù)。

目前，VE 含量測定的方法主要有液相色譜法（LC）、氣相色譜法（GC）、合相色譜法（UPC2）、毛細管電泳法（CE）及電化學法（EP）等（王石等，2019）。因操作復雜，測定難度大，本實驗選用熒光分光光度法測定17 種西藏飼糧作物中的VE 含量，重復性好，方法較為簡便。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 儀器：F96Pro 熒光分光光度計（上海棱光科技有限公司）；試劑：50 mg VE 標樣、VC、正己烷、60%硫酸、無水乙醇、KOH、重蒸水；飼料作物均來自西藏市場（大米和糯米來自墨脫縣）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準工作溶液的制備（1）在50 mg 的VE標樣中加入50 mL 無水乙醇，稀釋液溶解終濃度為10 μg/mL。（2）使用吸量管分別移取1、2、4、8 mL 標樣工作液，各補無水乙醇至10 mL，即標準曲線濃度為1、2、4、8 μg/mL。0～ 4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品處理 將風干待測定的17 種樣品粉碎后過80 目篩。

1.2.3 皂化 豆類作物樣品稱取0.1～ 0.2 g，糧食作物樣品稱取0.5～ 1 g，置于25 mL 離心管中，加入10 mL 無水乙醇，每管再加入0.4 g 的VC，防止VE 在強堿性介質(zhì)中氧化。隨后加入0.5～ 1 g 的KOH，皂化10 min，再加10 mL 蒸餾水，輕輕晃動使皂化物完全溶解。如果皂化不徹底，繼續(xù)加入KOH 至完全被皂化。

1.2.4 提取與洗滌 精確加入10 mL 正己烷，振蕩4 min，待分層后吸取上層溶液至新的15 mL離心管，將提取液用30 mL 水分3 次洗滌，使醇-水消除干凈。

1.2.5 測量 加入60%硫酸2 mL，搖動1 min，靜置分層后吸取上層溶液于1 cm 石英比色皿中，置于熒光分光光度計（Ex=295 nm、Em=325 nm），測量正己烷溶液中的相對熒光強度，同時做空白對照。VE 提取含量計算公式為：

VE/（μg/g）=（C×10）/m；

式中：C 為VE 提取物濃度，μg/mL；m 為飼料作物樣品的重量，g。

1.2.6 標準曲線的測定 取1、2、4、8 μg/mL 不同濃度的標準VE 進行熒光光度測定，以濃度為橫坐標，以OD 值為縱坐標繪制標準曲線，如圖1 所示。VE 含量在0.1301～ 0.3708 μg/mL時，熒光OD 值與VE 含量呈良好的線性關系，R2=0.9924。

圖1 標準曲線

1.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0 軟件進行t檢驗和F 檢驗。

2 結果

2.1 17 種飼糧作物VE 含量 由表1 所示，12 種糧食作物與5 類豆類作物進行兩組均數(shù)間的t 檢驗，豆類組間的VE 含量顯著高于糧食作物，F(xiàn)=27.049，P=0.000，差異極顯著。對5 類豆類進行組間F 檢驗，F(xiàn)=30.780，P=0.000，差異極顯著，含量最高的是黃豆，為（210.904±7.089）μg/g，最低的是刀豆，為（145.130±7.301）μg/g。其中黃豆與黑豆、綠豆、刀豆均差異極顯著，P <0.01；黃豆與紅豆差異顯著，P <0.05。12 種糧食作物中，VE 含量最高的是青稞，測得值為（50.135±1.539）μg/g，其次是蕎麥，為（42.620±0.060）μg/g，最低的是糯米，為（23.887±1.400）μg/g，采用F 差異性分析，組間F=63.705，P=0.000，差異極顯著。其中青稞與其余11種糧食作物均差異極顯著，P <0.01。

表1 17 種飼糧作物VE 含量測定結果

3 討論

3.1 西藏高海拔地區(qū)與區(qū)外飼糧作物VE 含量的比對 有研究測得黑豆、山東綠豆、東北黃豆、北京玉米VE 含量分別為219 μg/g（陳穎等，2008）、279 μg/g（程霜等，1999）、219.534 μg/g（劉煥成等，2008）、52.84 μg/g（李祿慧等，2011）。本研究測得西藏黑豆VE 含量為（177.740±7.830）μg/g，綠豆為（148.975±0.817）μg/g，黃豆為（210.904±7.089）μg/g，玉米為（41.883±1.547）μg/g。相較于區(qū)外飼糧作物，西藏地區(qū)飼糧作物VE 含量均較低，說明西藏紫外線和光照強烈，不及時收割易對VE 造成破壞。此外，研究測定青海彩色青稞VE含量為（42.4±0.010）μg/g，白青稞為（37.7 ±0.024）μg/g（張帥等，2017），本研究測得西藏青稞VE 含量為（50.135±1.539）μg/g，黑青稞為（37.017±1.527）μg/g，小藍青稞為（40.044±1.406）μg/g。可能與不同品種青稞所需的溫度、光照、土壤營養(yǎng)成分等生長環(huán)境有關，機理有待進一步研究。

3.2 VE 在動物機體內(nèi)主要的生物學功能 VE進入動物機體后直接被小腸吸收，經(jīng)血液中的脂蛋白轉(zhuǎn)運到肝臟儲存和調(diào)控，用于各組織的攝取和代謝（張翠羽，2020）。動物機體內(nèi)VE 主要來源于配合飼料，當飼草料保存不當、存放時間較長或動物肝臟受損，機體內(nèi)攝入或分泌的VE 量減少（何生虎，2005），會導致動物的繁殖性能降低及引發(fā)營養(yǎng)代謝性疾?。≧eis等，2003）。研究表明，母畜VE 缺乏時會出現(xiàn)卵巢機能下降，性周期異常，無受精能力，胚胎發(fā)育遲緩并出現(xiàn)流產(chǎn)，死胎及胎衣不下等癥狀（金海峰，2019）；公畜則出現(xiàn)睪丸萎縮，精子運動異常等障礙（Hogan，1993）。Naderi 等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期和泌乳早期的奶牛易發(fā)生VE 亞臨床缺乏癥，其病與胎衣不下、子宮炎及乳腺炎發(fā)病有關；楊雨等（2019）研究表明，2 周齡雛雞VE 缺乏易引起白肌病、胰腺營養(yǎng)性萎縮及腦軟化等疾病。根據(jù)動物機體補充VE 含量，能夠提高免疫力，增強細胞介導、體液免疫及嗜中性粒細胞的功能（Beharka等，2000）。研究表明，動物機體補充VE 含量可增強嗜中性粒細胞活性，從而增強機體對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等條件性致病菌的殺傷力（Dewolf等，2014）；Smith 等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，添加VE 可降低母牛乳體細胞數(shù)、乳腺內(nèi)感染及乳房炎的發(fā)病率。本研究t 檢驗結果表明，豆類組間的VE 含量顯著高于糧食作物，F(xiàn)=27.049，P=0.000，差異極顯著。5 類豆類中，VE 含量最高的是黃豆，為（210.904±7.089）μg/g，最低的是刀豆，含量為（145.130±7.301）μg/g，采用組間F 檢驗表明，F(xiàn)=30.780，P=0.000，差異極顯著。12 種糧食作物中，VE 含量最高的是青稞，測得值為（50.135±1.539）μg/g，最低的是糯米，含量為（23.887±1.400）μg/g，采用F 差異性分析，組間F=63.705，P=0.000，差異極顯著。說明西藏飼糧作物中黃豆和青稞VE 含量較高。

3.3 飼糧作物中VE 的有效保存 收割的飼草及作物在陽光下暴曬后VE 含量降低。此外，飼糧作物VE 損耗量與干燥的時間及方式也具有相關性（Thafvelin等，1996）。研究表明，芫根凍干粉中測得VE 含量為42.3 μg/g（劉曄峰，2012）。本研究結果測得芫根在強紫外線下直接曬干的VE 含量為（25.062±1.469）μg/g，與芫根凍干粉VE 含量相比，損失率為40.75%，說明VE 本身是一種抗氧化劑，在細胞膜上容易被氧化，使分子結構中的游離酚式羥基發(fā)生化學反應生成醌，極易受到溫度、水分、光照及化學反應等多種因素的影響。西藏主要飼糧作物VE 含量的次序為：青稞（50.135±1.539）μg/g >小 麥（42.502 ±0.311）μg/g >玉 米（41.883±1.547）μg/g>小藍青稞（40.044±1.406）μg/g>黑青稞（37.017±1.527）μg/g>芫根（25.062±1.469）μg/g，直接添加在飼料中會很快失去效價。將抗氧化功能的羥基脂化變成VE 醋酸酯，可提高VE的穩(wěn)定性（黃其春，2000），并能在動物體內(nèi)緩慢地去酯化而釋放出VE（Bulychev，1998）。研究表明，當載體的pH 為6～8，含水量低于12%，飼料制粒的溫度高和延長飼料的調(diào)配時間，可使大量的VE 受到破壞，而VE 醋酸酯很少被破壞（龔利敏等，1998）。因此，飼料及配合飼料儲存在通風低溫、光線暗淡且干燥的環(huán)境有利于延長其VE 的保存時間。

3.4 VE 含量測定的方法比對 GC 能準確測定VE 含量，靈敏度高，應用廣泛，可分析多組混合物等。但膽固醇等硬脂類對測定有干擾，需進行柱層析，定性能力較弱（劉曼等，2019）。LC 分辨率高，檢測靈敏度強，是檢測VE 的首選方法，但分析成本高，日常維護費用昂貴，分析時間較長。UPC2 是一個新型色譜，具有較高的分離效率，可將GC 與LC 技術完美的結合，為未解決的分析難題提供了可能，但測定儀器價格貴，在行業(yè)中尚未普及（王石等，2019）。熒光分光光度法測定VE，操作簡便快速，靈敏度高，可用于批量飼料作物VE 的分析。

4 小結

西藏冬、春季節(jié)乏草，家畜因營養(yǎng)不良，抵抗力下降，易出現(xiàn)與VE 缺乏相關的營養(yǎng)代謝性疾病，死亡率較高。西藏5 類豆類作物和12 種糧食作物2 組均數(shù)間的VE 含量差異極顯著。5 類豆類作物組間差異極顯著，VE 含量最高的是黃豆，為（210.904±7.089）μg/g。12 種糧食作物組間差異極顯著，青稞的VE 含量最高，為（50.135±1.539）μg/g。西藏主要的飼料作物黃豆和青稞，可作為VE 的首選飼料。因此，可通過不同養(yǎng)分飼料的合理搭配，補充動物機體VE 的攝入，以滿足動物正常發(fā)育的需求，增強動物機體免疫力，提高高原家畜對致病菌的抵抗能力，從而減少疾病的發(fā)生。