陳碩博，沈煜韜，謝鵬堯，陸旭琦，何 勇，岑海燕

（浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，杭州 310058；農業(yè)農村部光譜檢測重點實驗室，杭州 310058； 浙江大學現(xiàn)代光學儀器國家重點實驗室，杭州 310027）

0 引 言

柑橘黃龍?。℉uanglongbing, HLB）嚴重影響柑橘的產量和品質，由于難以預防和控制，傳播速度快，且目前尚無根治的方法，被稱為“柑橘癌癥”。因其巨大的危害性，2020年9月中國農業(yè)農村部將其列入《一類農作物病蟲害名錄》。因此，對柑橘黃龍病的及時準確監(jiān)測有利于病害的防控，對柑橘產業(yè)穩(wěn)定健康發(fā)展起著極其重要的作用。目前診斷HLB的方法主要包括田間觀察法和實驗室生化分析法兩類。由于田間觀察法簡單易行，在基層生產活動中的使用較為普遍，其判別依據主要是感染黃龍病的植株顯現(xiàn)出來的典型癥狀，如葉片顏色和果實轉色程度等。但該方法對農藝人員的知識和經驗要求較高，主觀性強，有其他病害如黃斑病、缺素癥等與黃龍病有相似的癥狀，極易對HLB的診斷造成誤判。實驗室有多種方法檢測黃龍病，但這些方法過程較為復雜，對實驗人員的專業(yè)技能要求高、檢測成本高且檢測周期長，不利于推廣應用。

近年來隨著光譜技術與遙感技術的發(fā)展，HLB的無損檢測逐漸成為了可能。Pérez等利用一種便攜式拉曼光譜儀結合主成分分析和線性判別分析算法識別健康和HLB柑橘植株，其正確識別率可達到89.2%。Sankaran等利用傅里葉近紅外光譜儀對被干燥和粉碎的柑橘葉片進行檢測，對HLB的識別率可達到95%，但對未顯癥HLB柑橘葉片的診斷正確率僅為48.2%。劉燕德等在利用高光譜成像技術在380～1 080 nm光譜范圍內對HLB進行病情等級判別，對所采集的柑橘葉片高光譜圖像按染病程度和缺素分成5類，采用偏最小二乘判別分析法（Partial Least Squares Discrimination Analysis, PLS-DA）的模型誤判率僅為5.6%。蘭玉彬等獲取了柑橘果園的無人機低空高光譜影像，發(fā)現(xiàn)核函數(shù)為二次項的支持向量機（Support Vector Machine, SVM）判別模型對一階導數(shù)預處理的健康和HLB植株的全波段光譜分類效果最好，準確率達到了94.7%。Deng等利用無人機搭載高光譜成像儀采集柑橘園的遙感影像，采用遺傳算法提取特征波段進一步構建多種植被指數(shù)，再結合冠層光譜特征參數(shù)構建了多特征融合的HLB檢測方法，該方法在訓練集和驗證集的分類精度分別達到了99.33%和99.72%。

以上研究大多基于染病葉片與健康葉片的光譜或圖像特征差異采用分類識別算法對柑橘黃龍病進行診斷，對未顯癥HLB的研究較少且診斷精度較低，對葉片遭受黃龍病菌侵染后的光合生理差異亦缺乏研究。植物在受到生物或非生物脅迫后，其光合作用強度會發(fā)生明顯變化，而葉綠素熒光與植物的光合作用密切相關。研究表明，植物吸收的太陽輻射能量用于3個方面：光合作用、熱耗散、熒光發(fā)射。這三者在植物生理上是密切關聯(lián)的，存在著近似此消彼長的關系，因此可以通過熒光更為直接地探測與植物光合作用相關的信息。Sankaran等利用手持式熒光傳感器在室內環(huán)境下基于袋裝決策樹（Bagged Decision Tree, BDT）分類器對健康和顯癥黃龍病柑橘葉片的總體分類準確率達到了97%。Cen等利用葉綠素熒光成像技術在實驗室環(huán)境下實現(xiàn)了健康、黃龍病和缺素柑橘葉片的高精度識別。翁海勇等同樣利用葉綠素熒光成像技術提取健康和黃龍病柑橘葉片的熒光參數(shù)結合碳水化合物代謝分析實現(xiàn)了柑橘黃龍病的檢測。但以上研究都需要主動的激發(fā)光源且需對葉片破壞性采樣，難以滿足大田環(huán)境下對柑橘黃龍病快速無損診斷的要求。而日光誘導葉綠素熒光（Sun-induced Chlorophyll Fluorescence, SIF）技術適合在自然環(huán)境下對植物脅迫下光合生理的變化進行無損檢測，得到了日益廣泛的重視。競霞等利用隨機森林協(xié)同SIF和反射率光譜實現(xiàn)了對小麥條銹病的監(jiān)測。白宗璠等利用改進離散粒子群算法（Modified Discrete Binary Particle Swarm Optimization, MDBPSO）優(yōu)化的全波段光譜數(shù)據協(xié)同冠層SIF結合隨機森林和后向傳播神經網絡算法構建了小麥條銹病的遙感探測模型，對小麥條銹病病情指數(shù)的反演精度達到了90%以上。而將日光誘導葉綠素熒光技術用于柑橘黃龍病診斷的研究尚未見報道。因此本研究通過分析健康、未顯癥黃龍病、顯癥黃龍病以及與黃龍病癥狀類似的黃斑病柑橘葉片的光合參數(shù)與光合色素含量差異，嘗試揭示黃龍病菌侵染柑橘葉片的光合響應機理，利用光譜和日光誘導葉綠素熒光技術分析4種類型葉片的反射率光譜和SIF光譜差異，并進一步構建柑橘黃龍病的診斷模型，以期實現(xiàn)柑橘黃龍病的原位快速診斷。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試柑橘品種為涌泉蜜桔，果園位于浙江省臺州市臨海市沿江鎮(zhèn)上百巖村（121°16′48″ E，28°43′12″ N，海拔37 m），試驗前根據柑橘黃龍病研究專家的建議標記健康（Healthy）、未顯癥黃龍?。╝symptomatic HLB, aHLB）、顯癥黃龍?。╯ymptomatic HLB, sHLB）及癥狀與黃龍病相似的黃斑病（Macular）柑橘葉片（圖1）。團隊前期研究已對比了缺素癥和黃龍病的差異，本研究進一步拓展了區(qū)分黃龍病與其他相似癥狀柑橘病害（如黃斑病）的可能性。田間試驗結束后，剪下標記葉片所在枝梢，并用去離子水浸潤的脫脂棉包裹切口處迅速裝入標記好的密封袋，封口后轉移至保鮮盒保存。取樣時間分別為2021年2月22日、3月22日和4月29日，采集樣品數(shù)量分別為60、54和48片。將樣品帶至實驗室后，在葉脈兩側分別打孔以測葉片色素含量，中心葉脈剪碎后按照國家規(guī)定的標準黃龍病檢測方法-實時熒光定量PCR（quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction, qPCR）法對葉片進行標定。最后確定健康、未顯癥黃龍病、顯癥黃龍病以及黃斑病葉片分別為45、33、45、39片，共計樣本162片。

圖1 不同柑橘葉片樣本的RGB圖像 Fig.1 RGB images of different citrus leaf samples

1.2 數(shù)據采集

1）光合參數(shù)。使用Li-6800便攜式光合系統(tǒng)測量柑橘葉片的光合參數(shù)，主要包括凈光合速率（mol/(m·s)），胞間二氧化碳濃度（mol/mol），氣孔導度（mol/(m2·s)）和蒸騰速率（mol/(m·s)），測量前設置葉室CO濃度為400mol/mol，相對濕度為50%，葉片溫度為25℃，光強為1 200mol/(m·s)。再測量柑橘葉片的光合-CO響應曲線（the photosynthetic COresponse curve, A-Ci）。A-Ci曲線CO濃度梯度設置為400、300、200、100、50、0、400、400、600、800、1 000、1 200mol/mol，測定完成后，基于Farquhar光合作用模型計算得到葉片最大羧化速率和最大電子傳遞速率。測量的健康、未顯癥黃龍病、顯癥黃龍病和黃斑病葉片樣本的數(shù)量分別為15、11、15和13片。

2）SIF光譜。利用ASD FieldSpec 4（analytical spectral device，ASD，美國ASD公司）便攜式地物光譜儀結合FluoWat葉片夾測量葉片的SIF光譜。由于葉片夾上下2個位置都可以插入光纖，因此可以同時測得葉片正面和背面的SIF光譜。葉片夾入FluoWat葉片夾后，將入射的太陽光束人工對準相對于葉片表面45°方向的開孔，測量并記錄葉片的反射和透射數(shù)據集。然后使用高性能低通濾波片（＜650 nm）對650 nm以上的光進行截斷，分別得到上行和下行的SIF光譜。FluoWat葉片夾的工作原理如圖2所示。測量點保持在葉片葉寬最大位置的中央葉脈左側。由于試驗期間太陽光光入射強度可能受太陽角度和云量的影響而不同，通過對測量的SIF光譜進行標準化處理，計算得到SIF產量指數(shù)。具體計算公式參考文獻[26]。

圖2 FluoWat工作原理圖 Fig.2 The working diagram of FluoWat

3）反射率光譜。將剪下的枝梢?guī)雽嶒炇覂群?，迅速按照SIF光譜測量標記的順序對葉片的反射率光譜進行逐一測定。使用儀器為ASD FieldSpec 4 地物光譜儀結合內置光源的葉片夾。測量前使用葉片夾自帶的標準板進行暗電流和白板標定，將灰度值轉化為反射率值。每個葉片樣本保存5條光譜曲線，取其算數(shù)平均值作為該樣本最終的反射率值。ASD高光譜儀測定的波段范圍為 350～2 500 nm，測量結果輸出間隔1 nm的光譜反射率數(shù)據。反射率光譜測定完成后，迅速進行光合色素含量的測定。

4）光合色素含量。采用分光光度法測定柑橘葉片的葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量。在葉片葉脈兩側分別打孔得到小圓葉，裝入5 mL離心管，加入研磨珠至研磨機研磨后再對每個樣品加入95%乙醇并再次研磨。將樣品在暗室環(huán)境下靜置2～3 h后離心。取上清液于96孔微孔板，使用美國BioTek公司生產的Epoch 2酶標儀配合96孔微孔板測定樣品溶液在665、649和470 nm波長下的吸光度，并以95%乙醇為參照，參考文獻分別計算葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量。測量的健康、未顯癥黃龍病、顯癥黃龍病和黃斑病葉片樣本的數(shù)量分別為45、33、45和39片。

1.3 數(shù)據處理

分別基于反射率光譜和SIF光譜建立柑橘HLB的診斷模型。構建反射率光譜診斷模型時，首先利用競爭性自適應加權算法（Competitive Adaptive Reweighted Sampling, CARS）算法篩選特征波段，再將特征波段的反射率作為輸入結合K最鄰近法（K-nearest Neighbor, KNN）對4種類型的柑橘葉片進行分類識別。構建SIF光譜診斷模型時，首先參考已有文獻確定SIF光譜的峰值位置，再基于峰值位置波長的SIF產量指數(shù)結合KNN算法構建4類葉片的診斷模型。通過比較兩類模型的最終診斷正確率，確定柑橘HLB的最佳診斷模型。

1）特征波段篩選算法。CARS算法可以有效降低各波長變量之間的高度共線性問題，進而提高預測模型的速度和精度。在實際波長變量優(yōu)選過程中，通過偏最小二乘（Partial Least Squares，PLS）模型回歸系數(shù)絕對值較大的波長變量，剔除模型回歸系數(shù)絕對值較小的波長變量，可以得到多個優(yōu)選變量子集，再利用交叉驗證的方法建模，次蒙特卡羅采樣后選擇個子集，獲得個模型的交叉驗證均方根誤差（Root Mean Square Error of Cross-validation，RMSECV），RMSECV最小的優(yōu)選變量子集即為最優(yōu)變量子集，包含的變量即為篩選得到的特征波段集合。本次試驗將蒙特卡羅采樣次數(shù)設置為50，在MATLAB R2021a（The Mathworks Inc.，USA）軟件環(huán)境中運行。

2）分類算法。KNN通過計算維空間中一個樣本點與其他樣本點的距離來判斷該樣本與其他樣本點的差異來選擇類別，訓練簡單高效，數(shù)學原理易理解，應用廣泛。采用5折交叉驗證來防止模型過擬合，經多次測試，鄰點個數(shù)設置為10時，分類精度較高且運行速度較快，距離度量采用Euclidean距離法，距離權重設置為等距離。

3）模型評價指標。本研究采用混淆矩陣評價判別模型的識別效果。混淆矩陣把預測類別與實際類別的所有結果進行組合，形成了真正（True Positive, TP）、假正（False Positive, FP）、真負（True Negative, TN）和假負（False Negative, FN）四種情形。進而可以計算出真正率（True Positive Rate，TPR）=TP/(TP+FN)，假負率（False Negative Rate，F(xiàn)NR）=FN/(FP+TN)，以及總體正確率（Overall Accuracy，OA）=TP/(TP+FP)。

4）SIF產量指數(shù)。計算公式如式（1）～（5），本文參考已有文獻使用687和741 nm波長處的發(fā)射峰計算SIF產量指數(shù)。具體描述如表1所示。

表1 本文用到的日光誘導葉綠素熒光產量指數(shù) Table 1 Sun-induced Chlorophyll Fluorescence (SIF) yield indices used in this study

式中為波長，nm；為太陽輻照度，mW/(m·nm·sr)；PAR（Photosynthetically Active Radiation）為光合有效輻射，mW/(m·sr)；為反射率，無量綱；為透射率，無量綱；fAPAR（Fraction of Absorbed Photosynthetically Active Radiation）為植物光合有效輻射吸收比例，無量綱；APAR（Absorbed Photosynthetically Active Radiation）為植物吸收的光合有效輻射，mW/(m·sr)；為上行SIF，mW/(m·nm·sr)；為下行SIF，mW/(m·nm·sr)；FY為上行SIF產量，nm；FY為下行SIF產量，nm。

2 結果與分析

2.1 柑橘黃龍病對柑橘葉片光合參數(shù)與色素含量的影響

計算不同類型柑橘葉片的光合參數(shù)的總體平均值與標準差，如圖3所示。健康柑橘葉片的凈光合速率明顯大于黃斑病和黃龍病葉片（圖3a），說明柑橘葉片被病原菌侵染后光合作用強度明顯減弱，而柑橘黃龍病侵染后的葉片又明顯小于黃斑病葉片的凈光合速率，可能是因為黃龍病屬于細菌性病害，對葉片組織內部光合機構的破壞要大于真菌型病害黃斑病的緣故。黃龍病顯癥與未顯癥葉片的凈光合速率無明顯差異，說明健康柑橘葉片的光合機構在受到黃龍病菌侵染后開始遭受破壞，在柑橘黃龍病未表現(xiàn)出明顯特征的潛伏期已經表現(xiàn)出來。健康葉片的胞間二氧化碳濃度明顯低于其他三類染病葉片（圖3a），由于二氧化碳是光合作用的主要原料，所以健康葉片相較于染病葉片的光合作用較強，因此消耗了更多的二氧化碳，使得細胞間二氧化碳濃度較低。由于控制環(huán)境二氧化碳濃度為400mol/mol，3種染病葉片的光合作用強度較弱，幾乎對二氧化碳沒有消耗，其胞間二氧化碳濃度維持在400mol/mol左右，而健康葉片的胞間二氧化碳濃度則明顯低于400mol/mol，維持在300mol/mol左右。蒸騰速率的快慢反映了植物的水分代謝能力，可以一定程度上反映植物的健康狀況。當植物收到生物或非生物脅迫時，蒸騰速率均會表現(xiàn)出與正常植物的明顯差異。從圖3b中可以看出，健康葉片的蒸騰速率明顯高于其他3類染病葉片，說明受到病害脅迫的柑橘葉片的水分代謝出現(xiàn)了異常。而受黃龍病菌侵染的柑橘黃龍病葉片的蒸騰速率又明顯低于受柑橘球腔菌侵染的黃斑病葉片，這從一定程度上揭示了黃龍病對柑橘的危害大于黃斑病的原因。氣孔導度表示葉片氣孔的張開程度，是影響植物光合作用的主要因素。從圖3b中可以看出，健康柑橘葉片的氣孔導度明顯高于其他3類染病葉片，這是造成健康葉片的凈光合速率和蒸騰速率明顯高于其他3類染病葉片的主要原因。

圖3 不同柑橘葉片樣本的光合參數(shù) Fig.3 Photosynthetic parameters of different citrus leaf samples

通過設置不同的二氧化碳濃度得到光合-二氧化碳響應曲線，基于Farquhar模型計算得到不同染病類型柑橘葉片的最大羧化速率和最大電子傳遞速率（圖4a）。最大羧化速率反映了的表觀羧化活性，其大小取決于的數(shù)量和活化程度，是植物光合能力強弱的特性參數(shù)。最大電子速率用來估算植物分配到碳同化的光合電子流和分配到光呼吸的光合電子流。從圖4a中可以看出，健康葉片的最大羧化速率和最大電子傳遞速率均明顯大于其他3種染病葉片，而黃龍病葉片的最大羧化速率和最大電子傳遞速率最低，說明活化的酶的數(shù)量在柑橘葉片遭受黃龍病菌侵染后明顯減少，其直接造成了葉片光合作用中碳同化速率的降低，進而影響柑橘的產量和品質。

光合色素在光合作用中起到參與吸收、傳遞光能或引起原初光化學反應的作用，主要包括葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素等。不同類型柑橘葉片的光合色素含量如圖4b所示。4種類型葉片的3種色素含量分布一致，均表現(xiàn)為健康葉片的含量最高，顯癥黃龍病葉片的含量最低。顯癥黃龍病的葉綠素含量顯著小于健康和未顯癥葉片，盡管其類胡蘿卜素含量亦小于健康和未顯癥葉片，但健康或者未顯癥黃龍病葉片的葉綠素與類胡蘿卜素含量比值大于顯癥黃龍病葉片，這可能是造成黃龍病葉片出現(xiàn)黃化的主要原因。

圖4 不同柑橘葉片樣本的光合能力和色素含量 Fig.4 Photosynthetic capacity and pigment content of different citrus leaf samples

2.2 柑橘葉片的反射率特征與黃龍病診斷結果

4種不同類型的柑橘葉片的反射率光譜如圖5所示。無論是健康葉片還是染病葉片均表現(xiàn)出典型的植被光譜特征。整體來看，在可見光波段（500～680 nm）和近紅外波段（750～1250 nm），顯癥黃龍病和黃斑病葉片的反射率高于健康和未顯癥黃龍病葉片。而健康葉片與黃龍病未顯癥葉片的光譜反射率十分接近，這為利用光譜區(qū)分潛伏期黃龍病葉片和健康葉片帶來一定的困難。同樣地，顯癥黃龍病葉片由于和黃斑病葉片都出現(xiàn)一定的黃化癥狀，在反射率光譜的表現(xiàn)亦差異不大。

圖5 不同柑橘葉片樣本的反射率光譜特征 Fig.5 Reflectance spectra of different citrus leaf samples

圖6表示根據CARS算法篩選的特征波段結果圖。隨著運行次數(shù)的增加，RMSECV呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢，在運行次數(shù)為20時，RMSECV達到最小值，為0.494（圖6a）。從圖6b可以看出，隨著運行次數(shù)的增加，被篩選出來的波段數(shù)量呈減少趨勢，前10次運行的波段數(shù)量迅速減少，30次以后逐漸平穩(wěn)。當RMSECV最小，運行次數(shù)為20時，對應的波段數(shù)量為144個。因此將篩選出來的144個波段的作為特征波段，輸入其反射率結合KNN算法對4類葉片進行分類。

圖6 CARS算法篩選特征波段 Fig.6 Screening optimal wavebands by Competitive Adaptive Reweighted Sampling (CARS) algorithm

基于特征波段反射率的4種類型柑橘葉片的分類結果的混淆矩陣如圖7所示。4類葉片的分類真正率均在60%以上，未顯癥黃龍病和顯癥黃龍病的真正率分別72.7%和75.6%，健康葉片的分類真正率最高，達到了82.2%。黃斑病葉片的分類真正率僅為64.1%，有23.1%錯分的是把其分類為顯癥黃龍病，而顯癥黃龍病葉片的分類真正率也僅為75.6%，20.0%被識別為黃斑病，這說明顯癥黃龍病葉片與黃斑病葉片較為接近的反射率光譜為柑橘黃龍病的診斷帶來的一定的難度。未顯癥黃龍病葉片的分類真正率為72.7%，而有21.2%的葉片被誤分為健康葉片，同時健康葉片的分類精度雖然達到了82.2%，但是仍有13.3%被誤分為未顯癥黃龍病葉片，同樣地，十分接近的反射率光譜，使兩類葉片被互相誤判的可能性較大。

圖7 基于特征波段反射率的KNN分類結果 Fig.7 K-nearest Neighbor (KNN) classification results based on reflectance of optimal wavebands

2.3 柑橘葉片的SIF光譜特征與黃龍病診斷結果

不同類型柑橘葉片的上行SIF產量和下行SIF產量如圖8所示。從圖8a可以看出，不同病害類型的柑橘葉片的上行SIF產量均表現(xiàn)出雙峰的特征，這是由光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)Ⅰ共同貢獻，峰值位置位于紅光區(qū)域的690 nm和遠紅光區(qū)域的740 nm波長附近，且在690 nm波長附近，顯癥黃龍病的SIF產量明顯大于其他3類葉片，而在740 nm附近未顯癥黃龍病葉片的SIF產量大于其他3類葉片。4種染病類型的柑橘葉片的下行SIF產量則表現(xiàn)出單峰的特征（圖8b），這是由于當透射光從葉片表面穿過葉肉細胞到達葉片背面時，葉綠素對紅光的重吸收效應造成的。而遠紅光區(qū)域的峰值位置亦出現(xiàn)在位740 nm波長附近，但在紅光區(qū)域內，顯癥黃龍病的SIF產量明顯大于其他3類葉片，這可能與自身葉綠素含量減少有關系。峰值位置的SIF產量表現(xiàn)出一定差異，4種類型葉片可以實現(xiàn)較好的區(qū)分識別。

圖8 不同柑橘葉片樣本的上行和下行SIF產量光譜 Fig.8 Upward and downward sun-induced Chlorophyll (SIF) yield spectra of different citrus leaf samples

圖9顯示了基于不同SIF產量指數(shù)的KNN算法對4種不同類型柑橘葉片的分類效果。比較兩組上行SIF產量指數(shù)Up687和Up741的診斷效果（圖9a、9b），健康和顯癥黃龍病葉片的分類真正率均達到了80.0%，基于Up741的模型較基于Up687的模型將未顯癥黃龍病和黃斑病的分類真正率從69.7%和61.5%分別提升到了75.8%和71.8%。分析兩組下行SIF產量指數(shù)Dw687和Dw741的診斷效果（圖9c、9d）可知，未顯癥黃龍病和黃斑病葉片的分類真正率均為78.8%，基于Dw687的模型對健康葉片和顯癥黃龍病葉片的分類真正率分別為82.2%和84.4%，基于Dw741的模型對健康和顯癥黃龍病葉片的分類精度均達到了85%以上。綜合4種SIF產量指數(shù)來看，基于Dw741的KNN模型對顯癥黃龍病葉片的診斷精度最高，達到了88.9%，對其他3類葉片的識別精度較其他3種模型也較高或者相當，但對于未顯癥黃龍病和黃斑病葉片的識別精度僅為78.8%和73.3%，仍有一定的提升空間。為此，通過兩個波段SIF產量進行比值處理，構建比值SIF產量指數(shù)，嘗試進一步提升模型的診斷精度（圖9e、9f）?；贒w687/741的模型對未顯癥黃龍病和黃斑病的診斷精度均提升到80%左右，對健康葉片的診斷精度提升到了將近90%，對顯癥黃龍病的診斷精度無變化，為81.8%。反觀基于兩組上行SIF產量指數(shù)構建的比值SIF產量指數(shù)Up687/741，參與構建的KNN模型對相較于其他兩組模型，對4種葉片的識別精度均有不同程度的提高，均達到了80%以上，其中對健康葉片和顯癥黃龍病葉片的識別精度分別為88.9%和91.1%，對未顯癥黃龍病葉片和黃斑病葉片的識別精度均超過80%，分別為84.8%和82.1%。綜上所述，基于Up687/741的KNN模型對柑橘黃龍病的診斷精度最高。

圖9 基于不同SIF產量指數(shù)的KNN分類結果 Fig.9 K-nearest Neighbor (KNN) classification results based on different Sun-induced Chlorophyll Fluorescence (SIF) yield indices

2.4 特征波段反射率模型與SIF產量指數(shù)模型的診斷精度對比

柑橘受黃龍病菌侵染后，內部生理生化指標發(fā)生一定程度的變化，這些指標的變化導致光譜的響應。由于未顯癥時期葉片組織內部生化組分含量的變化十分微弱，或使反射率光譜對其進行準確識別存在一定困難。而黃斑病與黃龍病癥狀相似度較高，使反射率光譜模型對其進行識別時常出現(xiàn)誤判（圖9）。如果在實際應用中對黃斑病植株誤判為黃龍病植株進行挖除，將會對果農造成不可挽回的損失。因此本研究設計的4種類型柑橘葉片都需要有較高的診斷精度。由2.1節(jié)可知，柑橘的光合作用在未顯癥時期已經遭到破壞，而SIF技術正是光合作用的探針，在田間對黃龍病進行原位檢測值得探索。對比分析基于特征波段反射率和SIF產量指數(shù)的KNN模型的總體分類精度可知（表2），SIF產量指數(shù)模型的分類精度除Up687模型精度與特征波段反射率模型相當外，其余均優(yōu)于特征波段反射率模型?；趩畏逦恢肧IF指數(shù)的總體識別正確率均在80%左右，基于雙峰位置的比值SIF指數(shù)的總體識別正確率則達到了85%以上，其中基于Up687/741的KNN模型的正確率最高，達到了87.0%，且對于每類葉片的分類準確率均是所有模型里最高的。結合圖8與圖4b分析可知，由于顯癥黃龍病葉片的葉綠素含量顯著低于健康葉片和黃斑病葉片，致使上行SIF和下行SIF在紅光區(qū)域的重吸收效應減弱，因此顯癥黃斑病的上行SIF和下行SIF在687 nm的峰值位置處均大于其他3類葉片。由于葉綠素對紅光區(qū)域的SIF的重吸收，使得紅光區(qū)域SIF與遠紅光區(qū)域SIF的比值能夠反映葉片受黃龍病菌侵染而造成的脅迫狀態(tài)，這可能是比值SIF指數(shù)模型診斷精度較高的原因。這與前人的研究結果是一致的。

表 2 基于特征波段反射率和SIF產量指數(shù)的KNN模型的總體精度對比 Table 2 Overall accuracies of K-nearest Neighbor (KNN) models based on reflectance of optimal wavebands and Sun-induced Chlorophyll Fluorescence (SIF) yield indices

3 討 論

柑橘黃龍病主要由韌皮部桿菌屬類細菌Liberibacter 引起，屬于革蘭氏陰性細菌，影響中國的主要為亞洲種（Liberibacter asiaticus，Las）病菌。由于黃龍病菌潛伏期較長，侵染柑橘后并不立即顯癥，但其傳染性與危害性在新宿主已經存在。因此在黃龍病菌侵染柑橘初期（未顯癥黃龍病時期），控制蛋白合成的基因受病菌影響或上調表達或下調表達，下調表達的基因可能控制著酶的合成，從而使酶數(shù)量較少，活性減弱，直接造成減?。▓D4a），葉片光合作用被極大削弱（圖3）。而上調表達的基因可能使篩管阻塞蛋白含量增加進行阻塞防御，亦阻塞了糖類等營養(yǎng)分子的運輸，導致根系無法及時吸收利用有機營養(yǎng)，導致根系吸收礦質元素能力下降，從而造成柑橘植株地上部分缺乏部分礦質元素（如N、Fe、Mg、Zn等），而這些元素與葉綠素合成有關，任一元素含量的減少都將導致黃化癥狀，此時已進入黃龍病的顯癥時期。圖4b顯示的未顯癥黃龍病柑橘葉片的葉綠素含量略高于黃龍病葉片的原因可能是因為在柑橘宿主與黃龍病病原菌互作的過程中，病原操縱宿主一些其他生物學過程引發(fā)了植物的防御反應。

盡管研究提出的模型對柑橘黃龍病的原位快速診斷取得了較好的效果，但診斷精度仍有較大的提升空間，對SIF光譜進行進一步的預處理，不同SIF指數(shù)的構建，多種分類算法的進一步嘗試都有可能不同程度提高對黃龍病的診斷精度。對不同生育階段、不同品種、不同氣候類型下的柑橘組合研究更有利于提高模型的普適性和應用價值。

4 結 論

1）黃龍病菌的侵染使柑橘葉片光合色素含量發(fā)生顯著變化，未顯癥時期含量升高，顯癥時期降低；黃龍病菌的侵染使柑橘葉片光合作用明顯減弱，在未顯癥時期已經表現(xiàn)出來；

2）基于CARS算法提取的特征波段反射率構建的KNN分類模型對健康柑橘葉片的分類正確率為82.2%，對未顯癥黃龍病和顯癥黃龍病的分類正確率分別為72.7%和75.6%，21.2%的未顯癥黃龍病被診斷為健康，對黃斑病的分類正確率為64.1%，23.1%被誤診為顯癥黃龍??；

3）基于687和741 nm SIF產量峰值位置構建的上行比值SIF產量指數(shù)Up687/741結合KNN模型對顯癥柑橘黃龍病的診斷精度達到了91.1%，對未顯癥黃龍病達到了84.8%，均優(yōu)于特征波段反射率模型，說明其對于潛伏期黃龍病的診斷具有一定的優(yōu)越性，為實現(xiàn)柑橘黃龍病的田間原位、快速、早期診斷提供了參考。