顧海洋，翟世民，王冬，張麗平，付少海,3

(1.江蘇省紡織品數(shù)字噴墨印花工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫 214122；2.生態(tài)紡織教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫 214122；3.國家先進印染技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 泰安 271001)

我國作為皮革生產(chǎn)大國，每年皮革產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的23%[1]，每年制革污泥的產(chǎn)量已超過100萬 t， 且每年以10%的速度增長[2-4]。制革污泥含有豐富的蛋白質(zhì)，含量約為20%～40%，對其提取和利用是制革污泥資源化的重要途徑之一[5-9]。污泥蛋白質(zhì)的提取主要有物理法[10-11]、化學(xué)法[12-13]、生物法[14-15]和聯(lián)合處理法[16-18]。本文采用熱堿法處理制革污泥，獲得蛋白質(zhì)水解液，通過酸化的方式提取制革污泥蛋白質(zhì)，并分析其基本性質(zhì)和安全性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

制革污泥，河北齊盛皮革有限公司提供，污泥基本性質(zhì)見表1；氫氧化鈉、硫酸、硫酸銨、二苯氨基脲均為分析純；福林酚，生物級試劑。

表1 制革污泥的基本性質(zhì)

KH-200水熱反應(yīng)釜；ST3100 pH儀；PMK1602ZH電子天平；L550離心機；DZF-6050真空干燥箱。

1.2 實驗方法

制革污泥在運輸前經(jīng)過壓濾脫水處理，為了模擬制革污泥脫水前的狀態(tài)，將制革污泥的含水率調(diào)至95%。

1.2.1 制革污泥蛋白質(zhì)水解液的制備 取100 mL污泥于水熱反應(yīng)釜中，NaOH加入量為9 g/L，充分攪拌，150 ℃加熱60 min。待冷卻后，測定蛋白質(zhì)水解液中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.2 制革污泥蛋白的提取 取一定量的污泥蛋白質(zhì)水解液，用硫酸銨調(diào)節(jié)pH至7左右，然后加入1.5%(水解液質(zhì)量)的硅藻土作為吸附劑[19]，在30 ℃下處理2 h。完成吸附后，用1 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)水解液pH至4，在室溫下靜止1 h，離心、烘干獲得污泥蛋白粉末。計算蛋白質(zhì)提取率(R)。

(1)

式中,Mh為熱堿處理后上清液中蛋白質(zhì)的含量；Ms為制革污泥中蛋白質(zhì)的含量。

1.3 分析方法

1.3.1 制革污泥蛋白質(zhì)的含量分析 采用福林酚法測定污泥上清液蛋白質(zhì)的含量。

1.3.2 制革污泥蛋白質(zhì)的純度分析 采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2003)測定污泥中蛋白質(zhì)的含量和污泥蛋白粉末的純度，蛋白質(zhì)含量計算公式(蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化系數(shù)為6.25)：

蛋白質(zhì)含量=氮元素重量比(%)×6.25

(2)

1.3.3 制革污泥蛋白質(zhì)的元素分析 用有機元素分析儀測量制革污泥蛋白質(zhì)中C、H、O、N元素含量，采用X射線能譜儀(EDS)測量制革污泥蛋白質(zhì)中其他元素的含量。

1.3.4 制革污泥蛋白質(zhì)的Cr元素分析 采用IPC-MS測量制革污泥蛋白質(zhì)中Cr元素的含量；采用二苯碳酰二肼分光光度法(GB/T 1555.4—1995)測量制革污泥蛋白質(zhì)中Cr6+的含量。

1.3.5 制革污泥蛋白質(zhì)的氨基酸分析 采用氨基酸高效液相色譜儀測量制革污泥蛋白質(zhì)中氨基酸的含量。

1.3.6 制革污泥蛋白質(zhì)的分子量分析 采用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)測量制革污泥蛋白質(zhì)的分子量分布。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaOH用量對制革污泥蛋白質(zhì)提取率的影響

圖1為NaOH用量對蛋白質(zhì)提取率的影響。

圖1 NaOH用量對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 The influence of NaOH dosage on protein extraction rate

由圖1可知，蛋白質(zhì)的提取率隨著NaOH用量的增加而增大，NaOH用量為9 g/L時，提取率達到最大值71.2%，NaOH用量超過9 g/L，提取率下降。

2.2 處理時間對制革污泥蛋白質(zhì)提取率的影響

圖2為處理時間對蛋白質(zhì)提取率的影響。

圖2 處理時間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 The influence of treatment time on protein extraction rate

由圖2可知，蛋白質(zhì)的提取率隨著處理時間的延長而增大，處理時間為60 min時，提取率達到最大值70.5%。當(dāng)處理時間超過60 min時，蛋白質(zhì)的提取率隨之下降。

2.3 處理溫度對制革污泥蛋白質(zhì)提取率的影響

圖3為處理溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響。

圖3 處理溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 The influence of temperature on protein extraction rate

由圖3可知，蛋白質(zhì)的提取率隨著提取溫度的增加而增大，提取溫度為150 ℃時，提取率達到最大值71.9%。處理溫度過150 ℃時，蛋白質(zhì)的提取率隨之降低。

污泥蛋白質(zhì)在提取工藝中，存在蛋白質(zhì)析出溶解和蛋白質(zhì)分解兩種過程[20]。制革污泥中蛋白質(zhì)主要來源于微生物細胞和皮屑廢棄物。在熱堿的作用下，污泥微生物細胞破裂，釋放蛋白質(zhì)；皮屑廢棄物在堿性環(huán)境中降解成蛋白質(zhì)，液相中的蛋白質(zhì)濃度增加，此時蛋白質(zhì)的析出過程占主導(dǎo)。隨著NaOH用量、溫度、處理時間的增加，在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)逐漸水解成氨基酸，最終分解成氨氮，此時蛋白質(zhì)的分解過程占主導(dǎo)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的提取率下降。因此，NaOH用量、溫度、處理時間的增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率先增大后減小。

2.4 響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素實驗得出的數(shù)據(jù)，采用Design-Expert 10軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗，分別以處理溫度、處理時間、NaOH用量為自變量，以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面實驗。因素水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面分析因素及水平

表3 響應(yīng)面實驗結(jié)果

蛋白質(zhì)提取率的回歸線性方程為：

蛋白質(zhì)提取率(%)=-306.99-3.37A+1.84B+16.41C+7.78×10-4AB+2.78×10-4AC-8.33×10-4BC-0.011A2-0.016B2-0.906C2,方差分析見表4。

表4 方差分析結(jié)果

由表4可知，模型P值為0.000 2(<0.01)，極為顯著；失擬項P值為0.332 3(>0.05)，不顯著。說明模型的精確度較高，可以反映各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響關(guān)系。圖4為響應(yīng)面3D圖。

由圖4可知，交互因素中對污泥蛋白提取的影響順序為：溫度×?xí)r間>時間×NaOH>溫度×NaOH，與方差分析的結(jié)果保持一致。

圖4 響應(yīng)面3D圖Fig.4 Response surface 3D diagram

根據(jù)響應(yīng)面實驗得到蛋白質(zhì)提取率的二次回歸方程，計算預(yù)測值和實際值之間的歸一化偏差(ND)和歸一化標(biāo)準(zhǔn)差(NSD)[21]。

(3)

(4)

式中PR(exp)——實際的蛋白質(zhì)提取率，%；

PR(pre)——預(yù)測的蛋白質(zhì)提取率，%；

n——實驗的次數(shù)。

根據(jù)模型的預(yù)測，污泥蛋白最佳的提取條件：溫度148.3 ℃，時間60.3 min，NaOH用量為9.1 g/L，污泥蛋白提取率為72.6%。預(yù)測值與單因素實驗得出的結(jié)果較為接近。蛋白質(zhì)提取率預(yù)測值與實際值的歸一化偏差和歸一化標(biāo)準(zhǔn)差分別3.8%和1.5%，均低于10%，說明模型準(zhǔn)確性較高。

2.5 制革污泥蛋白質(zhì)分析

將熱堿處理后得到的蛋白質(zhì)水解液pH調(diào)節(jié)至4，室溫靜止1 h后得到制革污泥蛋白。

2.5.1 元素分析 制革污泥蛋白為白色粉末狀，粗蛋白含量為83.1%，灰分占6.2%，總Cr含量為1.5 mg/kg， 其中Cr6+含量低于檢出限，制革污泥蛋白的鉻含量符合國家安全標(biāo)準(zhǔn)。表5為制革污泥蛋白的元素組成。

表5 污泥蛋白元素組成

由表5可知，制革污泥蛋白含有Na、Cl、Ca元素表明蛋白質(zhì)含少量的無機鹽。制革污泥蛋白具有較高的純度，且無機鹽的含量較少。圖5為制革污泥蛋白的SEM圖。

圖5 污泥蛋白質(zhì)在不同倍數(shù)下的SEM圖片F(xiàn)ig.5 SEM images of sludge protein under different magnificationsa.5 000倍;b.10 000倍

由圖5可知，制革污泥蛋白質(zhì)顆粒較小，顆粒呈不規(guī)則的形狀。

2.5.2 紅外分析 污泥蛋白紅外圖譜見圖6。

圖6 制革污泥蛋白FTIR圖Fig.6 FTIR image of tannery sludge protein

2.5.3 氨基酸分析 將污泥蛋白在6 mol/L HCl溶液120 ℃水解22 h，分析制革污泥蛋白氨基酸含量，制革污泥蛋白氨基酸組成見表6。

表6 制革污泥蛋白氨基酸組成

由表6可知，污泥蛋白包含常見的14種氨基酸，氨基酸占制革污泥蛋白總量的31.9%，氨基酸含量較高。其中甘氨酸的含量最高為8.59/100， 其次是谷氨酸為3.8/100。

2.5.4 蛋白質(zhì)分子量分析 溫度對蛋白質(zhì)提取率影響較強，因此分析堿處理溫度對蛋白質(zhì)分子量的影響,結(jié)果見圖7。

圖7 制革污泥蛋白分子量分布Fig.7 Molecular weight distribution of tannery sludge protein

由圖7可知，堿處理溫度為100 ℃時，污泥蛋白質(zhì)分子量分布為5～170 kDa，提取溫度為150 ℃時，污泥蛋白質(zhì)分子量分布為5～35 kDa，提取溫度為200 ℃時，污泥蛋白質(zhì)分子量為5～22 kDa。隨著提取溫度的提升，蛋白質(zhì)的分子量分布逐漸減小。在堿性環(huán)境下，溫度提高，加速了蛋白質(zhì)的水解，大分子蛋白質(zhì)水解成小分子蛋白質(zhì)。

3 結(jié)論

熱堿法提取制革污泥蛋白質(zhì)的最佳條件：溫度150 ℃，時間60 min，NaOH用量為9 g/L，蛋白質(zhì)的提取率為71.2%。純度為83.01%，氨基酸含量占31.07%，無機鹽含量保持在較低的水平?？侰r含量為1.5 mg/kg，其中Cr6+含量低于檢出限，符合國家安全標(biāo)準(zhǔn)(GB 13078—2001)，具有較高的使用價值。