徐素云，王艷萍，周聰，耿偉濤，王金菊

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

紅茶菌是一種有著悠久歷史的傳統(tǒng)發(fā)酵茶飲料，以糖、茶、水為原料，主要由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌協(xié)同發(fā)酵而成，口感清爽宜人，富含茶多酚、有機酸等多種活性功能成分，具有抗氧化、抗炎、預防和治療糖尿病等保健功效[1-2]。紅茶菌一直以來以天然混合菌種家庭自然發(fā)酵方式被應用和流傳，但這種方式存在微生物菌相復雜、生產周期長、發(fā)酵過程易受雜菌污染以及產品風味不均一等多種不利因素，故而限制了它的開發(fā)和應用[3]。近年來有學者對其發(fā)酵菌種及發(fā)酵工藝進行研究[4-5]。林娟等[6]以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter sp.）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為發(fā)酵菌種，制備出香醇爽口、獨特風味的新型紅茶菌；宋清鵬等[7]以總酸、D-葡糖糖二酸 1，4-內酯（D-glucaro acid-1，4-lactone，DSL）含量為工藝優(yōu)化指標探討接種量、發(fā)酵溫度、初始可溶性固形物等因素對其成分影響，研發(fā)出了一款高產DSL且口感佳的紅茶菌飲料。目前紅茶菌市場產品種類單一、品質不穩(wěn)定，因此探究紅茶菌發(fā)酵菌株及優(yōu)化工藝條件是紅茶菌飲料實現(xiàn)產業(yè)化、大規(guī)?；难芯炕A及必要條件。

本試驗在前期工作的基礎上，以傳統(tǒng)發(fā)酵紅茶菌中分離純化所獲的優(yōu)良菌株：木糖駒形氏菌（Komagataeibacter xylinus）1512、拜耳接合酵母菌（Zygosaccharomyces bailii）1484、植物乳桿菌1298為發(fā)酵菌種，通過檢測其發(fā)酵液的總酸、總糖含量及感官評分等指標，進行復配研究，制備新型混合發(fā)酵劑；同時以總酸含量及感官評分為指標通過單因素及響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵條件及生產工藝，為紅茶菌飲料實現(xiàn)標準化、工業(yè)化生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶：杭州名杭茶葉有限公司；蔗糖：河南金潤食品添加劑有限公司；無水乙醇、甲酸、乙酸、丁酸、檸檬酸、硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：天津市四通化工廠；植物總酚檢測試劑盒：北京雷根生物技術有限公司。

紅茶菌母液菌種：河南中沃實業(yè)有限公司；木糖駒形氏菌（Komagataeibacter xylinus）1512、拜耳接合酵母菌（Zygosaccharomyces bailii）1484、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）1298：天津科技大學食品工程與生物技術學院食品生物技術實驗室從傳統(tǒng)紅茶菌母液分離所獲的優(yōu)勢菌株[6，8]。MRS培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、葡萄糖-酵母浸膏-碳酸鈣（glucose-yeast extract-calcium carbonate，GYC）培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基：天津市江天化工技術有限公司。

1.2 儀器與設備

JA2003型電子分析天平：日本YAMATO公司；Multiskan GO型酶標儀：美國Thermo公司；HF safe 900型超凈工作臺：上海力申科學儀器有限公司；LC-16高效液相色譜儀：日本島津公司；Sigma3-18k高速冷凍離心機：德國Sigma公司；B-600型低速離心機：河北省安新縣白洋離心機廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 技術路線

技術路線如下。

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 茶湯制備

將綠茶以一定的比例添加到沸水中，煮沸5 min后用8層紗布過濾，再加入一定量蔗糖溶解，封口膜封口，于90℃水浴滅菌10 min后冷卻至25℃～30℃?zhèn)溆肹9]。

1.3.2.2 菌種活化與馴化

將木糖駒形氏菌1512、拜耳接合酵母菌1484、植物乳桿菌1298以及紅茶菌母液分別接種于滅菌后的GYC培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)48 h后傳代2次，再將活化后的菌株（木糖駒形氏菌1512、拜耳接合酵母菌1484、植物乳桿菌1298）接種于滅菌的茶湯中培養(yǎng)3 d～4 d，使發(fā)酵菌種適應茶湯中的環(huán)境（種子液濃度達到108CFU/mL）[10]。

1.3.2.3 滅菌

將紅茶菌發(fā)酵液在90℃水浴殺菌10 min后，冷卻至40℃以下[11]。

1.3.3 傳統(tǒng)紅茶菌制備

將活化后的紅茶菌母液以體積分數(shù)6%的接種量接種于茶湯中，于30℃恒溫靜置培養(yǎng)12 d，得到傳統(tǒng)紅茶菌（pH 值為 2.3～2.9）[12]。

1.3.4 紅茶菌發(fā)酵菌種復配比例研究

取馴化好的種子液（木糖駒形氏桿菌1512、拜耳接合酵母菌1484、植物乳桿菌1298），以6%總接種量，按不同體積比復配接種于茶湯中，30℃培養(yǎng)發(fā)酵8 d，檢測其發(fā)酵液總糖、總酸、總酚含量及感官評分指標，篩選得出最佳配比。

1.3.5 紅茶菌發(fā)酵條件的確定

1.3.5.1 單因素試驗

以感官評分為主要指標、總酸含量為輔助指標，分別考察茶葉添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、蔗糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）、發(fā)酵時間（4、6、8、10、12 d）、發(fā)酵溫度（26、28、30、32、34 ℃）對紅茶菌發(fā)酵效果的影響，以確定最佳單因素水平。

1.3.5.2 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計結合加權綜合性評分法[9]，選取影響紅茶菌發(fā)酵效果較大的4個因素：蔗糖添加量、接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度為考察因素，以總酸（權重比例為30%）與感官評分（權重比例為70%）的綜合分值為響應值，進行四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗，試驗設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 感官品質評定

參考齊海麗等[13]、鄧雯瑾等[14]的感官評定方法，結合紅茶菌發(fā)酵飲料的自身特點，邀請10名專家及工作人員對感官品質進行分析，評分標準見表2。

表2 紅茶菌發(fā)酵飲料感官評分標準Table 2 Sensory evaluation criteria of kombucha

1.3.7 理化指標的測定

pH值參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》進行測定；總酸參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》進行測定；總糖采用苯酚硫酸法[15]測定；總酚采用總酚試劑盒檢測；生長曲線采用分光光度計測定OD600nm值；有機酸采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[16]測定。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采 用 PASW Statistics v18、Design Expert 8.0.6 及Excel軟件對各項指標進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 紅茶菌純種混合最佳體積比研究結果

紅茶菌中主要微生物由醋酸菌、酵母菌以及少量乳酸菌組成[1]，在前期試驗基礎上，以河南濟源地區(qū)傳統(tǒng)紅茶菌篩選所獲的優(yōu)良菌株（木糖駒形氏桿菌1512、拜耳接合酵母菌1484、植物乳桿菌1298）為發(fā)酵菌種，并組成不同的菌種比例，以6%總接種量接種于茶湯發(fā)酵8 d后，觀察發(fā)酵液主要成分變化及感官品質，篩選最佳菌株體積比，結果如表3所示。

表3 紅茶菌理化指標及感官評分結果Table 3 Physicochemical index and sensory score of kombucha

由表3可知，不同菌種體積比制備的紅茶菌總糖、總酸、總酚含量及感官評分均有不同。拜耳接合酵母菌1484比例過高（1∶2∶1）或植物乳桿菌1298比例過高（1∶1∶2），均會引起發(fā)酵不足、糖代謝不充分、酸味不夠的現(xiàn)象；其中木糖駒形氏桿菌1512∶拜耳接合酵母菌1484∶植物乳桿菌1298體積比為2∶1∶1時，發(fā)酵的紅茶菌總酸、總酚含量最高，分別為7.96mg/mL和1.38mg/mL，總糖含量最低為21.17 mg/mL，口感酸甜適口，滋味最佳。

2.2 紅茶菌發(fā)酵單因素試驗結果

2.2.1 紅茶菌發(fā)酵液茶葉添加量的確定

茶葉添加量對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響見圖1。

圖1 茶葉添加量對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響Fig.1 Effects of tea dosage on sensory score and total acid content of kombucha

茶作為紅茶菌的發(fā)酵基質，為菌株的生長提供了豐富的營養(yǎng)物質，同時在風味上也賦予了紅茶菌特有的茶香[17]，因此研究茶葉添加量對紅茶菌發(fā)酵的影響十分必要。由圖1可知，在一定茶葉添加量范圍內，紅茶菌的感官評分及總酸含量隨著茶葉添加量的增加而升高，在茶葉添加量為1.0%時，其感官評分及總酸含量達到最高分別為8.91分和8 mg/mL，但當添加量超過1.0%時，感官評分及總酸含量顯著下降（p＜0.05）。研究表明，茶葉添加量不足時，無法給予菌株充足的營養(yǎng)物質，導致產品發(fā)酵不充分、酸味不足、茶香不足；茶葉添加量過高時，則會引起發(fā)酵液的單寧酸、茶多酚過剩從而抑制了菌體的生長和發(fā)酵速度，并且單寧酸也會造成紅茶菌澀味過重[18]。綜上所述選擇茶葉添加量為1.0%進行下一步試驗。

2.2.2 紅茶菌發(fā)酵液蔗糖添加量的確定

蔗糖添加量對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響見圖2。

圖2 蔗糖添加量對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響Fig.2 Effects of sugar dosage on sensory score and total acid content of kombucha

碳源是微生物生長的一類重要營養(yǎng)物質，而蔗糖是發(fā)酵飲料的主要碳物質來源[19]。由圖2可知，在一定添加量范圍內，紅茶菌的感官評分及總酸含量隨著蔗糖添加量的增加而升高，當蔗糖添加量為8%時，其感官評分達到最高為8.66分，添加量超過8%時，感官評分下降，主要由于過量的蔗糖引發(fā)飲料口感過甜，產生膩味；蔗糖添加量為8%時總酸含量最高，超過8%時，總酸含量下降，主要原因是過量的蔗糖會造成菌種的滲透壓增強，從而影響到菌種的生長及繁殖[15]，因此綜合考慮，選擇蔗糖添加量為7%、8%、9%進行下一步試驗。

2.2.3 紅茶菌發(fā)酵液接種量的確定

接種量對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響見圖3。

圖3 接種量對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響Fig.3 Effects of inoculation amount on sensory score and total acid content of kombucha

發(fā)酵菌種的多少直接影響到發(fā)酵速度及品質。由圖3可知，一定接種量范圍內，紅茶菌的感官評分及總酸含量隨著接種量的增加而升高，接種量為6%時，感官評分達到最高（8.7分），添加量超過8%時，感官評分下降。主要由于接種量過大會引起溶氧不足，影響產物合成及廢物代謝[20]；總酸含量在接種量為8%時含量最高，超過8%其含量下降，主要由于過多的菌種會引起營養(yǎng)缺乏、菌種早衰、自溶等狀況，不利于酸類物質的生成[21]，因此綜合考慮，選擇接種量為5%、6%、7%進行下一步試驗。

2.2.4 紅茶菌發(fā)酵液發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature on sensory score and total acid content of kombucha

溫度是影響發(fā)酵速度和質量的一個重要因素。由圖4可知，紅茶菌的感官評分及總酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高呈先升高后降低的趨勢。發(fā)酵溫度為30℃時紅茶菌的感官評分及總酸含量最高，分別為8.89分和7.92 mg/mL；當發(fā)酵溫度過低時菌種的生長代謝較慢，不利于總酸的生成和品質的穩(wěn)定[7]；發(fā)酵溫度過高時發(fā)酵菌種體內的酶會失活，同樣不利于產品品質的穩(wěn)定和酸物質的生成[8]。綜上，選擇發(fā)酵溫度為29、30、31℃進行下一步試驗。

2.2.5 紅茶菌發(fā)酵液發(fā)酵時間的確定

發(fā)酵時間對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵時間對紅茶菌感官評分及總酸含量的影響Fig.5 Effects of fermentation time on sensory score and total acid content of kombucha

發(fā)酵時間也是影響發(fā)酵品質的一個重要因素。由圖5可知，紅茶菌感官評分隨著發(fā)酵時間延長呈先升高后降低的趨勢。紅茶菌發(fā)酵液在8 d時己達到發(fā)酵成熟的標準，其感官評分最佳，總酸含量相對較高，分別為8.73分和8 mg/mL，而發(fā)酵時間超過8 d后感官評分呈下降趨勢，總酸含量雖有所上升但趨勢緩慢，主要由于隨著發(fā)酵時間的延長，菌種出現(xiàn)老齡化、產酸能力下降、代謝廢物增強，從而影響風味和酸度[17]。綜上所述，選擇發(fā)酵時間為7、8、9 d進行下一步試驗。

2.3 響應面法優(yōu)化紅茶菌發(fā)酵工藝結果

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗

在單因素試驗基礎上，選擇影響最顯著的4個因素（蔗糖添加量、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間）進行響應面法優(yōu)化，試驗結果見表4。

表4 響應面設計試驗結果Table 4 Response surface test results

用Design Expert 8.0.6軟件進行多元回歸分析，得到以下回歸方程：Y=94.50-4.61A-10.41B-9.74C-9.63D+1.07AB-0.53AC-3.32AD+0.060BC-7.75BD-1.50CD-34.90A2-41.71B2-36.80C2+16.84D2。方差分析見表5。

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表5可知，以綜合分值為響應值時，模型p＜0.01，表明二次方程模型極顯著；同時失擬項p=0.096 7＞0.05，失擬項差異不顯著，說明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小；4個因素對綜合分值影響的大小依次為接種量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞蔗糖添加量。

2.3.2 響應面交互作用分析與優(yōu)化

通過Design Expert 8.0.6軟件對各因素之間的交互作用進行響應面分析，繪制響應面曲線圖，結果如圖6所示。

圖6 試驗因子交互作用對綜合分值的影響Fig.6 Influence of interaction of test factors on comprehensive indexes

響應曲面越陡峭表示因素之間的影響程度越大[22]。由圖6可知，發(fā)酵時間與接種量交互的坡度很陡峭，說明兩者交互作用對綜合分值的影響極顯著（p＜0.01），該結果與方差分析結果一致。此外，由Design Expert 8.0.6軟件分析所得紅茶菌發(fā)酵飲料的最優(yōu)配方為蔗糖添加量7.97%、接種量5.92%、發(fā)酵時間7.04 d、發(fā)酵溫度30.08℃，預測綜合分值為98.61%。為了方便工業(yè)化生產最終將發(fā)酵工藝條件調整為蔗糖添加量8%、接種量6%、發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度30℃，按最優(yōu)工藝參數(shù)進行3次重復驗證試驗，結果取平均值，得到產品最終綜合分值為98.12%，其中感官評分9.5分，總酸含量為8.61 mg/mL。優(yōu)化后的產品比傳統(tǒng)紅茶菌發(fā)酵時間縮短了3 d～5 d[23]。

2.4 紅茶菌發(fā)酵液理化指標的測定

對新型紅茶菌、傳統(tǒng)紅茶菌、未發(fā)酵茶湯的理化指標對比分析，結果見表6。

表6 產品指標結果Table 6 Products indicators results mg/mL

由表6可知，新型紅茶菌總酸、總酚含量高于傳統(tǒng)紅茶菌，而總糖含量低于傳統(tǒng)紅茶菌，表明新型紅茶菌菌株產酸及代謝糖能力優(yōu)于傳統(tǒng)混合發(fā)酵劑。此外有機酸結果顯示，除甲酸含量外，乙酸、丁酸、檸檬酸及乳酸含量在新型紅茶菌中含量均優(yōu)于傳統(tǒng)紅茶菌，差異顯著（p＜0.05），乙酸、檸檬酸是一種酸味劑，不僅可改善產品的口感，也可防止雜菌的生長[24]，丁酸具有抗炎、降血糖、調節(jié)腸道菌群等功效[1]。

2.5 新型紅茶菌與傳統(tǒng)紅茶菌感官評價結果

邀請10名專家及工作人員對新型紅茶菌及傳統(tǒng)紅茶菌進行的感官品質分析，結果見表7。

表7 紅茶菌感官評分Table 7 Sensory score of kombucha

由表7可知，新型紅茶菌感官評分高于傳統(tǒng)紅茶菌，新型紅茶菌感官評分為9.50，傳統(tǒng)紅茶菌為8.96，差異極顯著（p＜0.01），且主要差異表現(xiàn)在口感風味，新型紅茶菌口感風味值為3.73，而傳統(tǒng)紅茶菌值為3.30。分析原因為傳統(tǒng)紅茶菌發(fā)酵菌種復雜，含有風味不佳的菌種，如鯨桿菌（Cetobacterium）、亞棲熱菌（Meiothermus）等影響了產品的口感風味[23]，此外工藝優(yōu)化后的新型紅茶菌酸甜可口、口感純正，因此新型紅茶菌口感更佳。

3 結論

通過對發(fā)酵菌株的復配比例研究及發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，最終得出新型紅茶菌最佳配方為木糖駒形氏桿菌1512∶拜耳接合酵母菌1484∶植物乳桿菌1298體積比2∶1∶1、接種量6%、茶葉添加量1.0%、蔗糖添加量8%、發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度30℃，在此條件下制備的紅茶菌感官評分、總酸、總糖、總酚含量分別為 9.5 分、8.61、18.73、1.39 mg/mL，該產品較傳統(tǒng)紅茶菌發(fā)酵時間短、總酸、總酚含量高、總糖含量低、口感更加和諧。以上結果為紅茶菌飲料實現(xiàn)標準化、工業(yè)化提供了一定的理論基礎，但具體風味成分的分析及飲料功效的作用等方面還需進一步探索。