張浩，高淑君，武沐洋，李睿寧，肖培倫，于樹娜，王曉莉，王凡濤

（濰坊醫(yī)學(xué)院，1口腔醫(yī)學(xué)院，2醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濰坊 261053；4蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000）

人牙髓干細(xì)胞（human Dental pulp stem cells，hDPSCs）是從牙髓組織中分離出的一種外胚層來(lái)源的成體干細(xì)胞[1]，與神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源胚層相同，具有較強(qiáng)的增殖能力，且體外可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，修復(fù)腦損傷。因此，hDPSCs備受人們關(guān)注[2]。目前，體外培養(yǎng)細(xì)胞多在常氧（21% O2）下進(jìn)行，而正常人體組織內(nèi)平均氧濃度僅為5%[3]，且人體不同組織氧濃度也存在較大差異，人腦組織中氧濃度為 3%～8%。不同氧濃度對(duì)hDPSCs的影響、是否低濃度氧更有利于hDPSCs的增殖及其神經(jīng)分化目前均尚不清楚[4]。鑒于hDPSCs是治療腦損傷性疾病的重要干細(xì)胞來(lái)源[5]，若能體外預(yù)處理hDPSCs，提高其增殖及神經(jīng)誘導(dǎo)潛能，將可最大限度發(fā)揮hDPSCs的臨床效能。本研究采用EdU免疫熒光染色法及CCK-8法觀察不同氧濃度（1%、5%、10% 和 21%）培養(yǎng)hDPSCs對(duì)其增殖及細(xì)胞活性的影響，并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，確定hDPSCs體外增殖及神經(jīng)分化誘導(dǎo)的最佳條件，以期為hDPSCs移植治療腦損傷性疾病的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

材料與方法

1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)液（HyClone，美國(guó)）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；I型膠原酶、分散酶（Sigma，美國(guó)）；CD34、CD90 單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；CD146單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；巢蛋白（nestin） 單克隆抗體（ABclonal，美國(guó)）；山羊抗兔 IgG 熒光二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；含DAPI的防淬滅熒光封片劑（Sigma，美國(guó)）；kFluor488-Click-iT EdU試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；CCK-8試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司）；EGF（PeproTech，美國(guó)）；bFGF（MCE，美國(guó)）；B27（Gibco，美國(guó)）；正置相差顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；三氣培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）。

2 hDPSCs 體外分離、培養(yǎng)及分組

臨床上收集拔除完整的智齒，供體年齡在16～20歲，牙齒拔除后將其放入預(yù)冷的含5%雙抗的培養(yǎng)液中，4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用含 5%雙抗的0.01 mol/L PBS反復(fù)沖洗，無(wú)菌條件下取出牙髓，并將牙髓組織剪碎為1 mm3大小。將組織移入1.5 mL EP管中，加入20倍消化酶（3 mg/mL I型膠原酶和4 mg/mL分散酶），置于37 °C環(huán)境下消化15 min，將消化后的組織塊接種到培養(yǎng)瓶中，加入4 mL含體積分?jǐn)?shù) 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，4 h后翻瓶；5 d換液1次，當(dāng)原代細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%時(shí)，進(jìn)行消化、傳代，并將傳代的 hDPSCs 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組（1% O2組、5% O2組、10% O2組）與對(duì)照組（21% O2組）。

3 hDPSCs 表面標(biāo)記物的免疫熒光鑒定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 hDPSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為 4×104個(gè)/mL，接種于24孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞。爬片分別加入兔抗CD34（1:300）、CD90（1:300）和 CD146（1:300）一抗，4℃ 孵育過(guò)夜；次日，洗滌后加入 Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG 熒光二抗（1:100），37 °C 避光孵育1 h，充分洗滌后，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。每張爬片隨機(jī)取5個(gè)視野，正置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

4 EdU試劑盒檢測(cè)hDPSCs增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hDPSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml接種于24孔板，置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁后，將孔板放入三氣培養(yǎng)箱，設(shè)置氧濃度為 1% O2、5% O2、10% O2和 21% O2，分別培養(yǎng)6 h、24 h、72 h后，加入50 μmol/L的EdU，孵育1 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。每張爬片隨機(jī)取5個(gè)視野，正置熒光顯微鏡下觀察、拍照，并計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

5 CCK-8試劑檢測(cè)hDPSCs活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hDPSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/mL接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁后，將孔板放入三氣培養(yǎng)箱，設(shè)置氧濃度為 1% O2、5% O2、10% O2和21% O2，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后每孔滴加10μL CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度（Optical Density，OD）值，比較各組hDPSCs活性。

6 hDPSCs神經(jīng)誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hDPSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合后進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)，去掉原先培養(yǎng)液，加入神經(jīng)誘導(dǎo)液（DMEM加入20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、20% B27），放入三氣培養(yǎng)箱，分別設(shè)定氧濃度為1%、5%、10%和21%，每2 d 更換一次神經(jīng)誘導(dǎo)液，培養(yǎng)5 d后取出細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)瓶隨機(jī)取5個(gè)視野，相差倒置顯微鏡下觀察、拍照，并通過(guò)Image J軟件自動(dòng)計(jì)算細(xì)胞數(shù)目，測(cè)量每個(gè)細(xì)胞突起數(shù)目。突起測(cè)量和計(jì)算方法：以具有突起的細(xì)胞胞體為圓心，畫一個(gè)半徑為20 μm的圓，將其直接連接在細(xì)胞體上，與此圓的交點(diǎn)數(shù)量定義為突起的數(shù)量[6]。

7 Nestin 免疫熒光染色

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hDPSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL接種于孔板中，同前進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)，培養(yǎng)5 d后取出細(xì)胞，同前進(jìn)行免疫熒光染色，加入兔抗nestin（1:500）一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日，加入山羊抗兔熒光二抗（1:100），37 °C 避光孵育1 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。每張爬片隨機(jī)取 5個(gè)視野，正置熒光顯微鏡下觀察、拍照，并采用 Image J軟件分析免疫熒光染色的熒光強(qiáng)度（平均光密度），以此代表Nestin免疫反應(yīng)性（表達(dá)水平）。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析，方差齊性資料，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 體外培養(yǎng) hDPSCs 的形態(tài)學(xué)

牙髓組織經(jīng)過(guò)組織塊酶消化法培養(yǎng)5 d后，在光學(xué)顯微鏡下可見組織塊邊緣有梭形樣細(xì)胞游出，呈放射狀或漩渦狀，排列有序，透光性好。細(xì)胞達(dá)到 80%～90% 匯合后，進(jìn)行消化傳代，相差倒置顯微鏡下觀察，傳代后的細(xì)胞成梭形，部分細(xì)胞為多邊形（圖1）。

2 hDPSCs的鑒定

CD34、CD90、CD146免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果示，培養(yǎng)的hDPSCs免疫熒光染色后，間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物 CD90、CD146均呈陽(yáng)性，細(xì)胞漿染為綠色，細(xì)胞核染為藍(lán)色，即CD90+DAPI+、CD146+DAPI+，培養(yǎng)的hDPSCs不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34，僅可見染為藍(lán)色的細(xì)胞核，即CD34-DAPI+（圖1）。

圖1 hDPSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定。 A，新鮮拔除的智齒；B，組織塊邊緣爬出的hDPSCs，細(xì)胞呈放射狀沿組織塊四周游出（比例尺，200 μm）；C，第3代 hDPSCs呈長(zhǎng)梭形或多角形（比例尺，50 μm）；D，hDPSCs CD34陰性（比例尺，50 μm）；E，hDPSCs CD90陽(yáng)性（比例尺，50 μm）；F，hDPSCs CD146陽(yáng)性（比例尺，50 μm）Fig.1 Isolation, culture and identification of hDPSCs. A, freshly removed wisdom teeth. B, hDPSCs that grew out of the edge of the tissue block, the cells spread radially around the tissue block; scale bar, 200 μm. C, hDPSCs of the third generation appearing long spindle or polygonal; scale bar, 50 μm; D, hDPSCs negative for CD34(scale bar, 50 μm). E, hDPSCs positivel for CD90, scale bar, 50 μm. F, hDPSCs positive for CD146, scale bar, 50 μm

3 5% O2增強(qiáng)hDPSCs增殖作用最強(qiáng)

EdU染色顯示：hDPSCs體外培養(yǎng)6 h時(shí)，各組hDPSCs增殖率無(wú)顯著差異；培養(yǎng)24 h時(shí)，5% O2組hDPSCs增殖率顯著高于21% O2組，1% O2、10% O2組hDPSCs增殖率亦顯著高于21% O2組，但低于5% O2組；培養(yǎng)72 h 時(shí)，5% O2組hDPSCs增殖率于顯著高于21% O2組，1% O2和10% O2組hDPSCs增殖率與21% O2組差別不顯著（圖2，表1）。

圖2 不同氧濃度下對(duì)hDPSCs增殖影響的EdU染色檢測(cè)。hDPSCs培養(yǎng)24 h；DAPI復(fù)染細(xì)胞核；比例尺，50μmFig. 2 EdU staining for effects of different oxygen concentrations on the proliferation of hDPSCs. hDPSCs cultured for 24 h; nuclear counterstaining with DAPI; scale bar, 50 μm

表1 不同氧濃度對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖率的影響Tab. 1 Effect of different oxygen cencentration on proliferation rates of human dental pulp stem cells

4 5% O2增強(qiáng)hDPSCs活力作用最強(qiáng)

CCK-8法檢測(cè)顯示：體外培養(yǎng)24 h，1% O2組hDPSCs活力顯著低于21% O2組，5% O2組細(xì)胞活力顯著高于21% O2組，而10% O2組與21% O2組細(xì)胞活力無(wú)顯著差異（圖3）。

圖3 不同氧濃度對(duì)hDPSCs細(xì)胞活力影響的CCK-8 法檢測(cè)。hDPSCs 培養(yǎng)24 h；*P<0.05；**P<0.01Fig. 3 CCK-8 assay of the effect of different oxygen concentrations on the cell viability of the hDPSCs. hDPSCs cultured for 24 h; *P < 0.05, **P < 0.01

5 5% O2最顯著促進(jìn)hDPSCs神經(jīng)誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)變化

加入神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)5 d后，各組細(xì)胞胞體均變圓，折光度增強(qiáng)，細(xì)胞呈現(xiàn)雙極或多極突起，突起細(xì)、長(zhǎng)，末端分叉，呈典型的神經(jīng)元樣形態(tài)。其中，5% O2組神經(jīng)誘導(dǎo)后的hDPSCs突起最多，最細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞間觸角有連接，并顯著多于 1% O2、10% O2及21% O2組，1% O2、10% O2組突起數(shù)量顯著多于 21% O2組，且10% O2組突起數(shù)量顯著多于 1% O2組（圖4）。

6 5% O2 上調(diào)hDPSCs神經(jīng)誘導(dǎo)后Nestin 表達(dá)最顯著

神經(jīng)誘導(dǎo)5 d后，各組均可見大量Nestin免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，1% O2、5% O2及 10% O2組Nestin免疫反應(yīng)性均顯著強(qiáng)于21% O2組，且5% O2組Nestin免疫反應(yīng)性顯著強(qiáng)于1% O2及 10% O2組，10% O2組Nestin免疫反應(yīng)性亦顯著強(qiáng)于1% O2組（圖4）。

圖4 不同氧濃度對(duì)hDPSCs神經(jīng)誘導(dǎo)5 d后形態(tài)及nestin表達(dá)的影響。A—D，神經(jīng)誘導(dǎo)5 d后hDPSCs形態(tài)；A，1% O2；B，5% O2；C，10% O2；D，21% O2。E—H，神經(jīng)誘導(dǎo)5 d后hDPSCs nestin免疫組織化學(xué)染色，DAPI復(fù)染細(xì)胞核；E，1% O2組；F，5% O2組；G，10% O2組；H，21% O2。比例尺，20 μm。I，突起數(shù)量比較。J，nestin免疫反應(yīng)強(qiáng)度比較；*P<0.05，**P<0.01Fig. 4 The effect of different oxygen concentrations on the morphology and nestin expression in the hDPSCs after neural induction for 5 d. A to D, cell morphology of the hDPSCs after neural induction for 5 d; A, 1% O2; B, 5% O2; C, 10% O2; D, 21% O2. E to H, nestin immunofluorescence staining of the hDPSCs after neural induction for 5 d, nuclear counterstaining with DAPI; E, 1% O2; F, 5% O2; G, 10% O2 ; H, 21% O2. Scale bar, 20 μm. I, comparison of the number of neurites; J, *P<0.05, **P<0.01, compared with 21%O2 group; J, comparison of nestin immunoreactive intensity of the hDPSCs; *P<0.05, **P<0.01

討論

目前干細(xì)胞移植技術(shù)在臨床應(yīng)用中，面臨的關(guān)鍵制約因素是干細(xì)胞移植后存活率低，以及到達(dá)病損部位的細(xì)胞數(shù)量少，而且病損部位常常處于缺血缺氧狀態(tài)。因此，通過(guò)體外預(yù)處理對(duì)維持移植后干細(xì)胞的生物特性顯得格外重要[7]。盡管低氧對(duì) hDPSCs 的影響已有報(bào)道，但hDPSCs最佳的低氧培養(yǎng)條件仍存在爭(zhēng)議。本研究采用EdU免疫熒光染色法觀察1%、5%、10%和21% 4個(gè)不同氧濃度檢測(cè)低氧處理不同時(shí)間點(diǎn)對(duì) hDPSCs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)5% O2環(huán)境下明顯促進(jìn)hDPSCs增殖，且在24 h時(shí)最明顯，這與Ahmed等的研究結(jié)論一致[8]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)不同氧濃度下hDPSCs在不同時(shí)間點(diǎn)增殖速率有差異，氧濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致增殖速率降低，而在 5% O2下細(xì)胞能夠較長(zhǎng)時(shí)間維持較高增殖速率，但具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。培養(yǎng)早期，各組細(xì)胞增殖速率未見顯著差異，但此后生長(zhǎng)迅速[9]，在72 h時(shí)各組增殖速率均下降且差異不顯著，其機(jī)制可能與細(xì)胞大量增殖，生長(zhǎng)空間不足，細(xì)胞之間相互接觸，產(chǎn)生接觸抑制。

在常氧條件下培養(yǎng)的干細(xì)胞，可因其過(guò)早衰老、DNA損傷、染色體畸變和代謝變化等，導(dǎo)致細(xì)胞活性喪失[10,11]，且在常氧環(huán)境下，培養(yǎng)的干細(xì)胞移植到體內(nèi)，由于局部組織缺血缺氧，導(dǎo)致移植后的細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，低氧可以促進(jìn)細(xì)胞HIF-1磷酸化，進(jìn)而上調(diào)VEGF，激活PI3K/Akt通路增加細(xì)胞活性及血管通透[13]，同時(shí)，抑制p53凋亡信號(hào)的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基損傷[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外不同氧濃度培養(yǎng)hDPSCs，對(duì)其活性的影響是不同的，5% O2hDPSCs活性最好，而1%O2條件下，hDPSCs活性降低，10% O2條件下細(xì)胞活性高21% O2，由此可見適宜低氧濃度可以維持細(xì)胞活性，而在較低氧濃度或常氧條件下細(xì)胞活性下降。

hDPSCs 與神經(jīng)系統(tǒng)具有共同的胚層起源，目前研究發(fā)現(xiàn)hDPSCs可以表達(dá)多種神經(jīng)源性標(biāo)記物，如nestin、神經(jīng)絲、β -微管蛋白III等[16]。與常氧相比，低氧環(huán)境下培養(yǎng)牙乳頭干細(xì)胞1周后，其神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因（CNP、SNAIL、NSE、GDNF 和 NT3）的表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)一種類似神經(jīng)元樣，具有角形細(xì)胞體和神經(jīng)突，一些細(xì)胞也可通過(guò)突觸相互連接[17]。本研究中，低氧明顯促進(jìn) hDPSCs神經(jīng)向分化，在5% O2條件下，神經(jīng)誘導(dǎo)后的 hDPSCs 出現(xiàn)雙極或多極突起最多，突起細(xì)而長(zhǎng)，末端具有分叉等典型的神經(jīng)元樣形態(tài)變化。同時(shí)，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在5% O2下誘導(dǎo)的hDPSCs，其神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)特異性蛋白 Nestin的表達(dá)顯著增強(qiáng)。因此，推測(cè)，低氧條件下能夠促進(jìn)hDPSCs神經(jīng)分化，且 5% O2培養(yǎng)效果更佳。

綜上所述，體外低氧培養(yǎng)能夠促進(jìn)hDPSCs增殖，提高細(xì)胞活性，并更易促進(jìn)誘導(dǎo)神經(jīng)分化，其中，在5% O2時(shí)更有利于維持hDPSCs的生物學(xué)特性及神經(jīng)分化，從而為hDPSCs體內(nèi)移植治療腦損傷疾病提供科學(xué)的依據(jù)。