黃一承，仲美橋，韓妍，李丹，李曉磊

(長春大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工吉林省普通高等學(xué)校重點實驗室，長春 130022)

傳統(tǒng)發(fā)酵食品是通過微生物作用而形成的食品。目前我國人民生活水平日益提高，人們對發(fā)酵食品的品質(zhì)也有了新的要求，在發(fā)酵食品的營養(yǎng)價值及風味等方面的需求不斷提升。發(fā)酵食品可以根據(jù)原料不同分為發(fā)酵谷類食品、發(fā)酵豆類食品、發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品以及其他發(fā)酵制品，含有豐富的功能成分，如醬油、腐乳等發(fā)酵豆類食品含有大豆多肽、大豆異黃酮等成分，能有效促進腸胃運動，降低膽固醇[1]。發(fā)酵食品因為發(fā)酵方式的特點，往往具有獨特的風味，風味是食品品質(zhì)的評價指標之一，能夠影響消費者對食品的接受度，因此對于發(fā)酵食品的風味研究越來越成為研究的熱點。

對食品風味物質(zhì)的分析包括前處理、定性定量分析以及貢獻率的分析等。針對食品中復(fù)雜多樣的揮發(fā)性化合物，氣相色譜是一種傳統(tǒng)的分析方法，其憑借不同揮發(fā)性化合物在色譜柱中的保留時間不同而對化合物進行分離，但是定性分析往往只能依據(jù)組分的保留特征，不能快速準確定性化合物。近年來，氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry， GC-MS)聯(lián)用技術(shù)和氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry， GC-IMS)聯(lián)用技術(shù)成為分析食品風味物質(zhì)的常用方法，能夠有效地分離復(fù)雜的揮發(fā)性風味物質(zhì)并進行定性和定量分析，這些技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中[2-5]。本文將對氣相色譜聯(lián)用技術(shù)的原理、風味物質(zhì)前處理方法及其在發(fā)酵食品風味方面的應(yīng)用進行歸納總結(jié)，同時對其不足及發(fā)展方向進行討論，為發(fā)酵食品風味的研究提供理論依據(jù)。

1 發(fā)酵食品風味研究

發(fā)酵食品是將原料在微生物作用下通過固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)發(fā)酵或自然發(fā)酵[6-7]制得的，在發(fā)酵過程中通過一系列反應(yīng)生成和消耗各種化合物，從而改變食品的營養(yǎng)及風味[8]。除了營養(yǎng)功效外，發(fā)酵食品受消費者歡迎的原因還有其獨特的風味。原料、發(fā)酵環(huán)境、微生物種類和發(fā)酵時間等因素導(dǎo)致不同發(fā)酵食品具有不同的風味，為探究特色風味的形成原因并改良發(fā)酵工藝，國內(nèi)外研究人員進行了大量風味研究，見表1。微生物在食品發(fā)酵過程中起重要作用，食品發(fā)酵常用的微生物包括乳酸菌、酵母菌、霉菌等，不同微生物的代謝方式及產(chǎn)物存在差異。

表1 風味形成影響因素研究Table 1 Study on the influencing factors of flavor formation

1.1 發(fā)酵菌株對發(fā)酵食品風味的影響

1.1.1 乳酸菌對發(fā)酵食品風味的影響

乳酸菌是發(fā)酵食品常用的發(fā)酵菌株之一，包括植物乳桿菌、戊糖片球菌、雙歧桿菌等，是發(fā)酵食品中酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)含量變化的重要原因，對改變產(chǎn)品風味、產(chǎn)生氨基酸和酚類物質(zhì)、提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值具有積極意義[9]。

梁紅敏等[10]通過副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌制作葡萄酵素，結(jié)果表明4種乳桿菌均能提高酵素的總酚含量和抗氧化能力，其中干酪乳桿菌的產(chǎn)酸能力最強。

1.1.2 酵母菌對發(fā)酵食品風味的影響

發(fā)酵中常見的酵母菌有釀酒酵母、漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母等。酵母菌與發(fā)酵食品的醇類、酯類及有機酸物質(zhì)的生成密切相關(guān)，其中酵母菌在酒精發(fā)酵階段起重要作用，能夠?qū)⒃现械钠咸烟寝D(zhuǎn)換成乙醇和二氧化碳，并在這個過程中產(chǎn)生大量醇類和酯類副產(chǎn)物，構(gòu)成了豐富的產(chǎn)品風味[11]。

Liu等[12]通過釀酒酵母及4種非釀酒酵母(葡萄有孢漢遜酵母、美極梅奇酵母、耐熱克魯維酵母和德爾布有孢圓酵母)發(fā)酵黃桃酒，揭示了不同非釀酒酵母菌株的特征代謝產(chǎn)物，其中葡萄有孢漢遜酵母對乙酸乙酯的產(chǎn)量提升最大，耐熱克魯維酵母能夠降低可滴定酸度并提升苯乙醇含量。

1.1.3 霉菌對發(fā)酵食品風味的影響

霉菌主要包括根霉、曲霉、毛霉、青霉等。醬油、醋等采用固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)品離不開制曲的過程，曲中往往存在大量的霉菌，在制曲過程中及發(fā)酵的初期起重要作用。霉菌在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等，蛋白酶等物質(zhì)能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)原料分解成氨基酸等營養(yǎng)且具有風味的物質(zhì)。淀粉酶等物質(zhì)能夠?qū)⒌矸垲愒戏纸獬尚》肿犹?，增加營養(yǎng)價值并為其他微生物提供更適宜的條件，從而進一步產(chǎn)生大量風味物質(zhì)。

王巧云[13]通過毛霉和根霉發(fā)酵腐乳，發(fā)現(xiàn)在毛霉、根霉以及混合發(fā)酵下，腐乳的總酸及氨基酸含量增加，此外，混合發(fā)酵的腐乳具有更好的抗氧化活性。

1.2 其他發(fā)酵條件對發(fā)酵食品風味的影響

除了發(fā)酵菌株外，發(fā)酵原料、發(fā)酵時間和發(fā)酵環(huán)境(溫度、pH、鹽度等)也是發(fā)酵食品風味形成的重要貢獻者。發(fā)酵原料的不同會改變發(fā)酵起始化合物含量，發(fā)酵環(huán)境和發(fā)酵時間會影響微生物的發(fā)酵效果，從而改變發(fā)酵食品的最終風味。在對固定產(chǎn)品風味形成的優(yōu)化研究中，國內(nèi)外研究人員往往從這些方面入手進行工藝優(yōu)化。

He等[14]研究不同溫度下發(fā)酵酸菜的揮發(fā)性化合物含量，結(jié)果表明隨著發(fā)酵溫度的升高，揮發(fā)性化合物種類增加，且不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵產(chǎn)品中作用的微生物種類存在差異。

2 風味測定方法

2.1 GC-MS及GC-IMS技術(shù)簡述

GC-MS與GC-IMS是風味研究中常用的儀器，GC-MS與GC-IMS原理及特點見表2。目前食品風味的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點[15-16]，Web of Science 檢索結(jié)果顯示GC-MS仍然是食品風味研究的主要方法，但從2019年開始，通過GC-IMS對食品風味進行研究的文章數(shù)量快速攀升，2020年與2021年漲幅分別達到了250%和132%。

表2 GC-MS與GC-IMS原理及特點Table 2 Principles and characteristics of GC-MS and GC-IMS

2.2 食品風味物質(zhì)提取方法

測定食品風味成分往往需要對樣品進行前處理，目前常用的前處理方法包括液液萃取、同時蒸餾萃取、溶劑輔助風味蒸發(fā)、固相萃取、固相微萃取、攪拌棒吸附萃取、薄膜固相微萃取等(見表3)。前處理方法的選擇與樣品物理化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)，蒸餾或頂空(HS)技術(shù)適合處理高揮發(fā)性化合物，使用液液萃取和固相萃取方法必須考慮樣品的溶解度，使用固相萃取、固相微萃取、攪拌棒吸附萃取和薄膜固相微萃取需要考慮樣品的極性[19]。

表3 樣品前處理方法原理及特點Table 3 Principles and characteristics of sample pretreatment methods

2.2.1 液液萃取

液液萃取(LLE)是通過分析物在水樣與有機溶劑之間的溶解度差異來萃取分析物，通常使用二氯甲烷、乙醚、正戊烷和正己烷等萃取能力高的溶劑或其中幾種的混合物。LLE具有許多優(yōu)點。例如萃取范圍較為廣泛，能夠萃取具有不同揮發(fā)性和極性的化合物。但是它還具有多種缺點，例如需求的溶劑量較大，另外，液液萃取相較其他方法步驟多、耗時長，且溶劑的選擇取決于要萃取的化合物。

2.2.2 同時蒸餾萃取

同時蒸餾萃取(SDE)也是通過溶劑萃取的原理來實現(xiàn)的，與LLE相比，SDE是通過加熱將樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)與萃取溶劑蒸汽混合達到萃取的目的，因此SDE能夠有效防止非揮發(fā)性成分對結(jié)果的干擾。但是，長時間的加熱可能會破壞揮發(fā)性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

2.2.3 溶劑輔助風味蒸發(fā)

溶劑輔助風味蒸發(fā)(SAFE)是在水或有機溶劑輔助下提高真空度，從而使揮發(fā)性化合物與非揮發(fā)性化合物分離。SAFE萃取過程中不需要升溫，因此對化合物結(jié)構(gòu)破壞較小，萃取出的化合物更接近樣品。但是SAFE也存在缺點，例如操作過程相對復(fù)雜且對易揮發(fā)化合物萃取效果不佳。

2.2.4 固相萃取

固相萃取(SPE)是通過吸附劑的選擇性保留化合物，隨后用一種對分析物親和力強于吸附劑的溶劑進行洗脫得到所需化合物。因此溶劑的極性十分重要，極性過高或過低均會導(dǎo)致萃取效果降低。與LLE相比，SPE減少了有機溶劑的體積、耗時短，并且能夠有效避免分析物分解。盡管如此，SPE也有一些缺點，如繼續(xù)使用有機溶劑。

2.2.5 固相微萃取

固相微萃取(SPME)是通過涂有吸收性聚合物材料(固定相)的熔融石英纖維來實現(xiàn)的。SPME能夠用于氣態(tài)、水甚至固體樣品。分析物在樣品和固定相之間存在分配平衡，因此可以將部分樣品吸附在固定相上，并在進樣口解吸。

SPME纖維可以通過兩種不同的方式引入到樣品中:直接浸入或頂空。直接浸入是將光纖直接浸入液體樣品中，比頂空更靈敏，更適合萃取液體樣品中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物，但纖維的壽命較短。頂空是將光纖暴露在氣態(tài)樣品或固液樣品上方的蒸汽中，纖維的壽命比DI-SPME更長，因為它不與樣品接觸。HS-SPME比DI-SPME更適合于萃取氣態(tài)、水溶液和固體樣品中的高揮發(fā)性化合物。

與其他更傳統(tǒng)的前處理技術(shù)相比，固相微萃取技術(shù)的主要優(yōu)點是：簡單和快速，樣品量小，不需要有機溶劑或較高的處理溫度，更便宜，可以提高檢測限，萃取和濃縮相結(jié)合且可用于固體、液體和氣體樣品。固相微萃取的優(yōu)點以及成熟的技術(shù)令它成為目前最為常用的一種前處理方法，見表4。

表4 前處理方法在測定發(fā)酵食品中揮發(fā)性化合物方面的應(yīng)用Table 4 Application of pretreatment methods in the determination of volatile compounds in fermented food

2.2.6 攪拌棒吸附萃取

攪拌棒吸附萃取(SBSE)是將一個封裝在涂有吸收材料的玻璃中的磁棒放入含有樣品的小瓶中來吸收所需的化合物，之后再進行解吸。SBSE與SPME的原理相似，因此在溶劑使用、速度、簡易程度等方面，與SPME的優(yōu)點相同。但SBSE比SPME的靈敏度高50～250倍且允許測定更多的樣品量，這是因為SBSE采用攪拌棒替代了萃取纖維，吸收材料體積顯著增大。SBSE也有一些局限性，例如，攪拌棒不能直接在進樣器中解吸，此外，目前SBSE可用的吸收材料還在不斷研究，而且對自動化的研究較少。

2.2.7 薄膜固相微萃取

薄膜固相微萃取(TF-SPME)是由覆蓋有吸收材料的碳膜組成。TF-SPME與SPME、SBSE一樣，也可以采用頂空或浸入的方式。它能夠有效解決SPME和SBSE存在的一些缺點，例如，它比SPME具有更大的表面積和固定相體積，因此更敏感且吸收量更大。另一方面，TF-SPME的膜由多種吸收劑組成，通常是二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(DVB/PDMS)，而SBSE的吸收材料往往采用PDMS，因此TF-SPME比SBSE能夠分析更多種類的化合物。這是一種較為新穎并在不斷發(fā)展的技術(shù)，因此目前采用TF-SPME結(jié)合GC分析酵食品的研究還比較少。

2.2.8 衍生化

有機酸、糖類等非揮發(fā)性化合物對樣品的口感及氣味也存在影響及修飾作用，因此對發(fā)酵食品中非揮發(fā)性化合物的測定也是一個研究方向。衍生化是通過GC測定非揮發(fā)性化合物的一個常用前處理方法，能夠增加高沸點化合物的揮發(fā)性并修飾峰形，主要包括硅烷化反應(yīng)、酯化反應(yīng)、醚化反應(yīng)、?；磻?yīng)等。各種衍生化方法的對象及常用試劑見表5。

表5 衍生化方法對象及常用試劑Table 5 Objects and common reagents of derivatization methods

3 展望

GC-MS和GC-IMS已被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，且隨著基礎(chǔ)理論的不斷豐富，使用這些技術(shù)對發(fā)酵食品風味成分進行分析已成為發(fā)展趨勢，國內(nèi)外研究人員通過該技術(shù)已對各種發(fā)酵食品的風味物質(zhì)進行了測定，為推動食品發(fā)酵行業(yè)發(fā)展提供了強有力的支持。但是，氣相色譜技術(shù)在發(fā)酵食品的風味研究上還有一些缺陷和不足，未來氣相色譜技術(shù)在發(fā)酵食品分析上的應(yīng)用可以從以下兩個方面進行深入研究：首先，發(fā)酵食品種類眾多，樣品前處理方法尤為重要，為了能夠更好、更全面地分析樣品中物質(zhì)，應(yīng)對前處理條件進行不斷優(yōu)化以及考慮前處理方法的結(jié)合；其次，食品發(fā)酵是一個復(fù)雜的過程，可以通過氣相色譜等儀器測定的指標對其中的條件和機制進行更深入的研究。