羅希帆，周靈美，謝曉東，陳帥君，楊紅澎，吳疆

一氧化氮合成酶的基因克隆與功能鑒定

羅希帆，周靈美，謝曉東，陳帥君，楊紅澎，吳疆通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300392）

一氧化氮（NO）作為一種極其重要的生物信息分子，其合成依賴于一氧化氮合成酶（NOS），因此NOS在動植物體內(nèi)發(fā)揮著不可替代的作用。本研究通過克隆海洋細(xì)菌JM-2的一氧化氮合成酶基因，利用HⅠ和Ⅲ 對目的基因和載體進(jìn)行雙酶切和連接，然后用熱激轉(zhuǎn)化法將目的基因轉(zhuǎn)到大腸桿菌Top 10和BL-21中，使其成功表達(dá)，得到轉(zhuǎn)化菌株，再利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并進(jìn)行蛋白純化，最后對該蛋白的活性進(jìn)行測定和分析。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中IPTG的最佳濃度為0.1 mmol/L、誘導(dǎo)時間為5 min時，NOS活性最大。

基因克??；蛋白純化；一氧化氮合成酶；活性測定

一氧化氮合成酶（NOS）是迄今為止可知的最大、最復(fù)雜的酶系之一，由于其活力較低，穩(wěn)定性差，受多種因素調(diào)節(jié)，難以測定其活性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮（NO）在生物體各組織中均有分布，它是一種新型的細(xì)胞信使，是分子較小的生物自由基，結(jié)構(gòu)簡單，極不穩(wěn)定，在水中呈微溶性，但脂溶性很強(qiáng)，能夠透過生物膜快速擴(kuò)散，NO的生成離不開NOS[3-4]。研究表明，NO對于動物的神經(jīng)、免疫、呼吸等均有重要影響[5]，對于植物的生長發(fā)育及其逆境脅迫調(diào)控方面也有至關(guān)重要的作用[6-7]。NO還能降低植物氣孔開放，具有抗氧化脅迫能力，增強(qiáng)植物的抗旱性，使其在缺水時仍能正常進(jìn)行光合作用。NO類生物自由基可以直接改變蛋白質(zhì)、酶活性、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾，有利于植物在干旱環(huán)境中生長[8-9]。

在有關(guān)NO的研究中，NO的合成途徑始終是焦點。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌、真菌、動植物體內(nèi)均存在NOS，動植物體內(nèi)NO的生物作用完全依賴于NOS活性[10]。在研究初期，NOS的活性只在內(nèi)皮細(xì)胞中有所發(fā)現(xiàn)，后隨研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)NOS在動植物體內(nèi)存在著廣泛的應(yīng)用[11]。由于NOS穩(wěn)定性差，活性較難測定，特別是NO具有復(fù)雜的理化特性和生物學(xué)特性，因此，關(guān)于NO的研究仍處于初步階段[12]?；诖?，深入研究測定NOS活性以及NO在動植物體內(nèi)的功能，將成為研究的熱點。本研究通過從全基因組中克隆NOS基因，采用熱激轉(zhuǎn)化法將該基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中并使其成功表達(dá)，然后加入IPTG低溫誘導(dǎo)，對目標(biāo)蛋白的活性進(jìn)行測定和分析，以明確NOS異源表達(dá)的催化功能，為NO在植物中進(jìn)一步應(yīng)用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Top 10與BL-21、pet-28a。

1.2 試驗儀器

基因擴(kuò)增儀（BIO RAD）、離心機(jī)（Anke TGL-16C）、恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9052）、恒溫振蕩培養(yǎng)器（PH050A）、三用紫外分析儀（WFH-203B）、超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（JY88-Ⅱ）、高速冷凍離心機(jī)（Aida TGL 16A）、紫外分光光度儀（PGENERAL）。

1.3 主要試驗藥品與試劑

HⅠ、Ⅲ，ThermoFisher；10×PCR Master Mix、DNA Marker Ⅲ、RapiLigation Mix、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；GeneGreen核酸染液、IPTG、Agarose、Tris、SDS-PAEG Loading Buffer、卡那霉素、考馬斯亮藍(lán)R250，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 基因組的克隆與純化

模板1 μL、上下游引物（序列號見表1）各0.5 μL、去離子水10.5 μL、Mix 12.5 μL，總體系為25 μL。輕彈混勻放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證，拍照并記錄結(jié)果。以基因擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，按PCR擴(kuò)增程序?qū)⒒驍U(kuò)增至200 μL，用純化試劑盒純化該產(chǎn)物[7]。

表1 引物序列

引物引物名稱序列號 上游引物（5′－3′）petNO1FCGCGGATCCATGAATCTGTATGAACAAGC 下游引物（5′－3′）petNO1RCCCAAGCTTGCCTTTCAATTCCTCTTTTACC

1.4.2 質(zhì)粒提取

取50 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基于錐形瓶中，加入含pet-28a質(zhì)粒的菌株搖床過夜培養(yǎng)，使用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。

1.4.3 基因與質(zhì)粒的雙酶切

為使基因與質(zhì)粒連接，對該基因進(jìn)行雙酶切，以產(chǎn)生黏性末端。總體系為200 μL，其中：酶（H I、Ⅲ）各2 μL、10×Fast Digest Green Buffer 10 μL、基因（質(zhì)粒）40 μL、去離子水138 μL。

將配制完成的反應(yīng)體系離心，充分混勻放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒對該基因（質(zhì)粒）進(jìn)行純化，并采用瓊脂糖凝膠電泳驗證，然后將該酶切產(chǎn)物儲存于-4 ℃冰箱中。

1.4.4 基因與載體的連接

利用RapiLigation Mix將質(zhì)粒與上述基因產(chǎn)物連接，總體系為10 μL，其中：RapiLigation Mix （2×）5 μL、目的基因4 μL、載體1 μL，輕彈混勻離心，取出，靜置反應(yīng)20 min。

1.4.5 大腸桿菌Top 10的轉(zhuǎn)化與驗證

Top 10主要用于重組質(zhì)粒的擴(kuò)增，它沒有表達(dá)外源蛋白的生物學(xué)功能，但能大量復(fù)制導(dǎo)入的外源質(zhì)粒，在正式轉(zhuǎn)入目的菌株前，要先轉(zhuǎn)入至大腸桿菌Top 10中。本試驗采用熱激轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。

（1）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μL Top 10感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴后置于42 ℃水浴鍋中，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，后立即放入冰水混合物3 min。

（2）吸取少量LB液體培養(yǎng)基（不含卡那霉素）于離心管中，160 r/min，37 ℃培養(yǎng)45 min，離心，吸出多余上清液，直至離心管中剩余少量液體，用移液槍將菌體沉淀吹起，涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

（3）取多個EP管分別加入1 mL含有卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基，挑取相對較大的單菌落于各EP管中，160 r/min，37 ℃ 培養(yǎng)過夜，然后進(jìn)行菌液PCR驗證轉(zhuǎn)化。將過夜培養(yǎng)的菌液與40％甘油按1∶1的比例加入到EP管里，標(biāo)明菌種及日期，-80 ℃冰箱保存。

1.4.6 大腸桿菌BL-21的轉(zhuǎn)化與驗證

大腸桿菌BL-21具有完整表達(dá)外源基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能，因此要將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL-21中，使目的基因得到表達(dá)。轉(zhuǎn)入前要先對Top 10中的重組質(zhì)粒進(jìn)行提取，然后采用熱激轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL-21中，方法參見1.4.5中Top10的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，選取相對較大的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，之后進(jìn)行菌液PCR驗證，方法參見1.4.5中Top10驗證。菌種保存方法同上。

1.4.7 目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)

將上述驗證過的大腸桿菌BL-21接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，之后加入IPTG低溫誘導(dǎo)使其產(chǎn)生蛋白。為優(yōu)化蛋白表達(dá)的最佳條件，本試驗設(shè)置了誘導(dǎo)時間與IPTG濃度兩個變量。

（1）第一組設(shè)置時間變量，第二組設(shè)置濃度變量。分別向兩組錐形瓶中各加入10 mL含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，時間梯度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，IPTG梯度濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mmol/L。

（2）將含有目的基因的BL-21菌株分別接 入這兩組錐形瓶中，時間組錐形瓶中添加相同濃度（0.1 mmol/L）的IPTG。

（3）28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，各管取16 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，選用12%分離膠與5%濃縮膠分離蛋白。將已轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)，加入IPTG低溫誘導(dǎo)，用組氨酸親和鎳柱蛋白提取試劑盒將蛋白純化，結(jié)束后將流穿液與洗脫峰用SDS-PAGE凝膠電泳驗證。

1.4.8 目標(biāo)蛋白活性的測定

（1）取大腸桿菌BL-21感受態(tài)細(xì)胞，加入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min過夜培養(yǎng)。

（2）挑取大腸桿菌BL-21非誘導(dǎo)的單菌落，分別加入到兩瓶100 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min過夜培養(yǎng)。

（3）取100 mL過夜培養(yǎng)的全菌BL-21，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

（4）將上述3瓶菌液離心后倒掉上清液，加入等體積的細(xì)菌裂解液，超聲裂菌后離心，倒掉上清液。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，作時間梯度，然后利用紫外分光光度儀測定其值。輕晃使其混勻，在530 nm波長下，雙蒸水調(diào)零，分別測定其吸光值。按公式（1）計算總NOS活性。

式中：Z——總NOS測定值；B——空白值；反——反應(yīng)液體積；取——取樣量；——比色光徑；——反應(yīng)時間；——呈色物納摩爾消光系數(shù)。

式中：——NOS濃度，mol/L；——比色池長度，cm。

式中：1——入射光強(qiáng)度；2——透射光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆產(chǎn)物的驗證

以帶有目的基因的質(zhì)粒為模版，petNO1F、petNO1R為引物，2×Master Mix為酶，進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，左邊第一泳道為DNA Marker，最亮條帶大小為1 200 bp，后面四條泳道均為目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。該DNA Marker產(chǎn)品共有7條DNA條帶，從下到上依次為200、500、800、1 200、2 000、3 000、4 500 bp，目的基因大小為1 077 bp。說明克隆相應(yīng)產(chǎn)物試驗成功，該基因GenBank號為CP001615.1。

圖1 基因克隆電泳圖

采用HⅠ和Ⅲ對基因和Pet-28a載體進(jìn)行雙酶切，使目的基因和載體產(chǎn)生相同的黏性末端，以便成功連接。如圖2所示，左邊Maker后第一條帶為質(zhì)粒，第二條帶為質(zhì)粒PCR，第三條帶為基因酶切，說明基因酶切成功。

圖2 基因酶切電泳圖

2.2 轉(zhuǎn)化至Top 10中的驗證

圖3為基因轉(zhuǎn)化至Top 10感受態(tài)細(xì)胞中的電泳結(jié)果圖，圖中可以明顯看到亮帶，說明轉(zhuǎn)化成功。選取其中條帶較亮的幾組菌液作擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖3 重組Top 10電泳圖

2.3 轉(zhuǎn)化至BL-21中的驗證

圖4為基因轉(zhuǎn)化至BL-21 中的驗證結(jié)果圖，圖中可明顯看出亮帶，說明轉(zhuǎn)化成功。選取其中條帶較亮的幾組菌液做擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖4 重組BL-21的電泳圖

2.4 不同濃度IPTG對目標(biāo)蛋白的影響

由圖5可以看出，隨著IPTG濃度的不斷增加，目標(biāo)蛋白的含量卻逐漸降低。當(dāng)IPTG濃度為0.1 mmoL/L時，目標(biāo)蛋白含量相比較高。說明當(dāng)IPTG濃度為0.1 mmol/L時，目標(biāo)蛋白被誘導(dǎo)的效果最好，因此后續(xù)試驗選擇IPTG濃度為0.1 mmol/L。

圖5 不同IPTG濃度誘導(dǎo)蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖

2.5 IPTG誘導(dǎo)時間對目標(biāo)蛋白的影響

由圖6可看出，隨著時間慢慢增加，目標(biāo)蛋白的含量逐漸增大，表明隨著誘導(dǎo)時間的延長，IPTG誘導(dǎo)該蛋白的作用不斷增強(qiáng)。

圖6 不同誘導(dǎo)時間的目標(biāo)蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖

2.6 目標(biāo)蛋白的鎳柱純化

由圖7可以看出，誘導(dǎo)菌液中的目標(biāo)蛋白含量比非誘導(dǎo)菌液的目標(biāo)蛋白含量高，除目標(biāo)蛋白外，流穿液中還含有較多雜蛋白，而洗脫峰中的目標(biāo)蛋白含量純度較高。

圖7 蛋白純化效果圖

注：1為全菌誘導(dǎo)；2為全菌非誘導(dǎo)；3為流穿液；4～9為洗脫液

2.7 目標(biāo)蛋白活性測定

由圖8可以看出，大腸桿菌BL-21感受態(tài)細(xì)胞活性隨時間增加而降低，在5～15 min內(nèi)急劇下降，15 min后下降速度變慢。BL-21非誘導(dǎo)的全菌蛋白在5～15 min內(nèi)下降稍快，而15 min后下降緩慢。BL-21誘導(dǎo)的蛋白在5～10 min有上升趨勢，10 min之后隨時間增加而降低。由此可見，NOS蛋白活性在5 min時最大。

圖8 一氧化氮合成酶活性測定圖

3 討論與結(jié)論

植物受到鹽脅迫時，由于光合作用效率下降，生長發(fā)育受到抑制，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，NO作為一種重要的小分子信號物質(zhì)，在植物抵抗NaCl脅迫過程中起到重要作用。樊懷福[4]對外源NO在黃瓜受到NaCl脅迫過程中起的作用進(jìn)行了深入研究，認(rèn)為NO通過提高抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的活性，減輕了鹽離子對細(xì)胞膜的傷害，提高了黃瓜耐受鹽脅迫的能力。本研究通過克隆NOS基因，對提高植物細(xì)胞NO水平，進(jìn)而提高植物耐受鹽脅迫的能力提供了一種備選基因。

本研究中設(shè)置了不同濃度的IPTG對目標(biāo)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，確定最佳濃度后，再以最佳濃度為基礎(chǔ)，篩選出最佳誘導(dǎo)時間，使目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)效果達(dá)到最佳。從電泳圖譜及試險數(shù)據(jù)可以看出，利用IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白，IPTG的最佳濃度為0.1 mmol/L，隨著誘導(dǎo)時間的不斷増加，誘導(dǎo)作用也會不斷增強(qiáng)。測定NOS蛋白活性時，發(fā)現(xiàn)NOS活性隨時間增加而降低，5 min時活性最大。分析NOS活性測定圖可以看出，非誘導(dǎo)情況下目標(biāo)蛋白的活性比誘導(dǎo)之后目標(biāo)蛋白的活性高。這是由于加入誘導(dǎo)劑后，誘導(dǎo)劑抑制了菌體的生長，誘導(dǎo)狀態(tài)下菌體濃度不如非誘導(dǎo)狀態(tài)下菌體濃度高，因此目標(biāo)蛋白的含量也比非誘導(dǎo)低，但誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)條件下目標(biāo)蛋白的活性都較高。

[1] 張新波，黃海鷺，張靈芝，等. 一氧化氮合成酶（NOS）活性的測定及其應(yīng)用[J]. 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1994，26（增刊）：173-174.

[2] 馬春偉，李禹志. 運(yùn)動與外周器官一氧化氮及其合成酶關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 文體用品與科技，2013（6）：144，154.

[3] 張勝根. 點帶石斑魚組織中一氧化氮合成酶活性及免疫反應(yīng)性研究[D]. 天津：天津農(nóng)學(xué)院，2011.

[4] 樊懷福. 外源NO緩解黃瓜幼苗鹽脅迫傷害的生理基礎(chǔ)研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[5] 邱建華，尹遜河. 一氧化氮及其合成酶的研究進(jìn)展[J]. 山東畜牧獸醫(yī)，2003，27（18）：37-38.

[6] 雷婭偉. 外源NO對野生早熟禾耐寒性的調(diào)控機(jī)制[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[7] 李典格. 大腸桿菌O114基因簇中β-1-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的功能表征[D]. 天津：南開大學(xué)，2013.

[8] SANTISREE P，BHATNAGAR-MATHUR P，SHARMA K. NO to drough-multifunctional role of nitric oxide in plant drought：Do we have all the answers? [J]. Plant Science，2015，239：44-45.

[9] 孟威，何晨陽，文景芝. 一氧化氮合成酶（NOS）研究方法及其在植物中的應(yīng)用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，38（2）：247-252.

[10] KITHAS A C，BROXTERMAN R M，TRINITY J D，et al. Nitric oxide synthase inhibition with N（G）-monomethyl- L-arginine：Determining the window of effect in the human vasculature[J]. Nitric Oxide，2020，104/105：51-60.

[11] 劉巍. 一氧化氮、一氧化氮合成酶及其抑制劑在缺血性腦損傷研究中的進(jìn)展[J]. 實驗動物科學(xué)與管理，2006，23（3）：42-46.

[12] 蔡維. 一氧化氮在水稻開花及非生物脅迫應(yīng)答中的功能研究[D]. 武漢：武漢大學(xué)，2015.

Gene cloning and functional identification of nitric oxide synthase

Luo Xifan, Zhou Lingmei, Xie Xiaodong, Chen Shuaijun, Yang Hongpeng, Wu JiangCorresponding Author

（College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

As an extremely important biological information molecule, the synthesis of nitric oxide depends on nitric oxide synthase, so nitric oxide synthase plays an irreplaceable role in animals and plants, especially in the growth and development of plants. In this study, the nitric oxide synthase gene of marine bacteriumJM-2 was cloned, the target gene and vector were digested and ligated byHⅠandⅢ, and then by heat shock transformation method the target gene was transferred toTop 10 and BL-21, which was successfully expressed to obtain transformed strains. Then IPTG was used to induce protein expression and purify the protein, and finally the activity of the protein was determined and analyzed. The results showed that when the optimum concentration of IPTG in the medium was 0.1 mmol/L and the induction time was 5 min, the activity of nitric oxide synthase was the highest.

gene cloning; purification of protein; nitric oxide synthase; activity determination

1008-5394（2022）02-0013-05

10.19640/j.cnki.jtau.2022.02.003

Q786

A

2020-11-05

天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（202010061098）；天津市科技計劃項目（20ZYCGSN00390）

羅希帆（1999—），男，本科在讀，主要從事植物轉(zhuǎn)基因方面的研究。E-mail：luoxifan9902@163.com。

吳疆（1976—），男，副教授，博士，主要從事植物分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：wujiangjack@tjau.edu.cn。

責(zé)任編輯：宗淑萍