郭宏勇 朱俊杰 沈伊潔 王茜 金鵬 夏建榮

(廣州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣州 515006)

葛仙米(擬球狀念珠藻,Nostoc sphaeroidesKutzing)是一種淡水絲狀多細(xì)胞固氮藍(lán)藻,其主要產(chǎn)地為我國(guó)湖北省鶴峰縣,主要生長(zhǎng)于水稻田中[1]。葛仙米是我國(guó)珍貴的野生食藥兩用藍(lán)藻,其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,食用歷史悠久,同時(shí)它在保健食品、食品添加劑、動(dòng)物飼料、醫(yī)藥、美容及精細(xì)化加工等領(lǐng)域具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景[2—5]。近年來(lái),由于化肥農(nóng)藥的過(guò)度使用,導(dǎo)致野生葛仙米的產(chǎn)量逐年減少[6],合理地開(kāi)發(fā)利用葛仙米資源,構(gòu)建葛仙米人工高密度培養(yǎng)技術(shù)變得迫在眉睫。葛仙米人工培養(yǎng)需要解決其碳源(CO2)和營(yíng)養(yǎng)鹽(氮、磷)供應(yīng)等問(wèn)題。高濃度CO2培養(yǎng)不僅可以為藻類(lèi)光合作用提供更加充足的原料,它還能提高 1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化酶的活性并抑制RuBP加氧酶的活性,降低光呼吸強(qiáng)度,有利于光合產(chǎn)物的積累。高濃度CO2對(duì)藻類(lèi)光合作用的影響具有明顯的種間差異性。Chu等[7]的研究表明15% CO2濃度連續(xù)培養(yǎng)小球藻,其ATP酶活性、光合固碳、甘油和脂質(zhì)合成酶活性也會(huì)增強(qiáng)。盧璐[8]研究中發(fā)現(xiàn)高濃度的CO2使葛仙米的光合能力大大地提高,但葛仙米彈性、干鮮重比增大,蛋白質(zhì)和多糖含量明顯增加。周智[9]在研究大氣CO2濃度對(duì)地木耳生長(zhǎng)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)在高濃度CO2導(dǎo)致其生長(zhǎng)速度速率和干重都明顯地增加。

由于葛仙米自身具有一定的固氮能力,所以對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的需求主要集中在磷的供應(yīng)上。磷元素參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的各種代謝活動(dòng),在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、物質(zhì)代謝及信號(hào)傳導(dǎo)、光合作用等方面都起著極為重要的作用[10,11],也直接參與了光的吸收與同化、Calvin-cycle 及對(duì)一些酶的活性起著調(diào)節(jié)作用等[12]。Chen等[13]在研究葛仙米對(duì)環(huán)境中磷的響應(yīng)機(jī)制時(shí),發(fā)現(xiàn)磷濃度越高,葛仙米生長(zhǎng)越迅速,其光合效率越高。在磷濃度較低時(shí),葛仙米從絲狀成球及小球變到大球的生長(zhǎng)過(guò)程會(huì)受到限制,且光合作用對(duì)無(wú)機(jī)碳的親和力增強(qiáng)[14]。汪豐海[15]研究表明葛仙米多糖、色素含量與培養(yǎng)基磷濃度呈正相關(guān),但是磷濃度較高時(shí)會(huì)抑制葛仙米球體的破裂。可見(jiàn)磷在葛仙米生長(zhǎng)和成球過(guò)程中起了非常重要的作用。

但目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究主要側(cè)重于CO2濃度或磷濃度單因子變化對(duì)葛仙米的生理學(xué)影響上,有關(guān)兩個(gè)因子的耦合效應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)設(shè)置不同CO2濃度和磷濃度培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),探討兩者的耦合作用對(duì)葛仙米生長(zhǎng)和光合作用的效應(yīng),為葛仙米人工高密度培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葛仙米藻種取自湖北師范大學(xué)陳雄文教授實(shí)驗(yàn)室,葛仙米小球用玻璃勻漿器勻漿,然后用無(wú)菌BG110培養(yǎng)液稀釋用于擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為(20±1)℃,光強(qiáng)為100 μmol·photons/(m2·s),通入無(wú)菌空氣,通氣量為500 mL/min。經(jīng)過(guò)20d左右培養(yǎng)得到粒徑為1—2 mm的葛仙米,用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選10 g生長(zhǎng)狀態(tài)良好的葛仙米小球,置于1 L玻璃管中,調(diào)整BG110培養(yǎng)液中磷濃度分別為0.088(LP),0.175(MP),0.350 mmol/L(HP),其中MP為BG110中無(wú)機(jī)磷濃度。分別通入大氣濃度CO2(LC)和2000 ppm CO2(HC),通氣速率為500 mL/min。每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)溫度(20±1)℃,光照強(qiáng)度為100 μmol/(m2·s),光照周期12h∶12h。培養(yǎng)7d后收獲用以測(cè)定。

1.3 相對(duì)生長(zhǎng)速率測(cè)定

將收獲的葛仙米小球用濾紙吸干樣品表面水分,將樣品置于冰箱中冷凍,然后放置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥,相對(duì)生長(zhǎng)速率(Relative growth rate,RGR)用以下公式計(jì)算[16]:

式中,t1、t2為開(kāi)始和結(jié)束的時(shí)間,W1、W2分別代表實(shí)驗(yàn)開(kāi)始與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的干重。

1.4 直徑分布和粒數(shù)測(cè)定

將收獲的葛仙米小球用網(wǎng)孔直徑不同的篩網(wǎng)進(jìn)行篩選,分別獲得直徑大小為1—2 mm、2—4 mm、大于4 mm的葛仙米個(gè)體,并計(jì)數(shù),計(jì)算不同直徑的葛仙米群體所占的比例。

1.5 葉綠素a含量測(cè)定

將冷凍干燥的葛仙米加入100%的甲醇,然后在60℃下水浴30min,反復(fù)提取2—3次,直至提取液變?yōu)闊o(wú)色為止,冷卻至室溫后用紫外分光光度計(jì)測(cè)其在665 nm處的OD值,葉綠素a的含量用以下公式計(jì)算[17]:

式中,ε為光系數(shù)74/cm,l是比色杯的內(nèi)徑為1 cm。

1.6 藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白的測(cè)定

取1 g的葛仙米鮮藻,反復(fù)融凍5次,加入磷酸緩沖溶液研磨,然后用細(xì)胞破碎儀破碎5次,將其進(jìn)行離心,轉(zhuǎn)速為4000 r/min,時(shí)間為30min。取上清液,用分光光度計(jì)分別測(cè)定上清液在562、615和652 nm波長(zhǎng)的吸光度A562、A615和A652。計(jì)算藻藍(lán)蛋白(Pycocyanin,PC)、別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin,APC)和藻紅蛋白(Phycoerythrin,PE)的含量。根據(jù)Siegelman等的公式計(jì)算[18]:

1.7 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

利用調(diào)制脈沖葉綠素?zé)晒鈨x(PAM-2100,Walz,Effeltrich,Germany)測(cè)定葛仙米的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。弱測(cè)量光和光化光分別為0.01 μmol/(m2·s)和培養(yǎng)光強(qiáng),飽和脈沖光為 4000 μmol/(m2·s)(0.8s)。葉綠素的熒光參數(shù)PSII的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Maximal photochemical efficiency of PSII,Fv/Fm)、PSII的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Actual photochemical efficiency of PSII,Yield)用以下公式計(jì)算[19]:

式中,Fm′和Fm分別是光照和暗適應(yīng)(15min)后藻的最大熒光水平。F是激發(fā)狀態(tài)下的實(shí)時(shí)熒光,調(diào)制藍(lán)光和遠(yuǎn)紅光測(cè)量光束分別用于測(cè)量Fo和Fo′。

1.8 P-I曲線的測(cè)定

光合放氧速率利用YSI生物測(cè)氧儀測(cè)定,選定5—6個(gè)直徑為2—4 mm的葛仙米小球放入反應(yīng)槽中,在20℃下,測(cè)定不同光強(qiáng)下光合放氧速率。通過(guò)調(diào)節(jié)光源和反應(yīng)槽的距離來(lái)控制不同光強(qiáng)。通過(guò)P=Pm×tanh(α×I/Pm)+Rd方程對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性參數(shù)擬合[20-21],其中P是光強(qiáng)為I時(shí)的光合速率;Pm為光飽和光合速率[μmol O2mg/(Chl.a·h)];α是光合效率[μmol O2mg/(Chl.a·h)];I為光強(qiáng)[μmol/(m2·s)];Rd為暗呼吸速率[μmol O2mg/(Chl.a·h)]。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用軟件Excel和Origin 2015(Origin Lab Corp,Northampton,MA,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,運(yùn)用雙因子方差分析(Two-way ANOVA)和DunCan多重比較,分析數(shù)據(jù)間的差異性。

2 結(jié)果

2.1 相對(duì)生長(zhǎng)速率

如圖 1所示,培養(yǎng)液中P或CO2濃度變化對(duì)葛仙米生長(zhǎng)均有明顯的影響(P＜0.05)。在大氣CO2濃度下,HP、MP培養(yǎng)的葛仙米相對(duì)生長(zhǎng)速率比LP分別提高7.63% (P＜0.05)和7.40% (P＜0.05);而在高濃度CO2下,HP、MP培養(yǎng)分別提高10.81% (P＜0.05)和7.00% (P＜0.05)。而僅在MP濃度下,高濃度CO2培養(yǎng)的葛仙米相對(duì)生長(zhǎng)速率比大氣CO2濃度培養(yǎng)提高9.10% (P＜0.05),在LP和HP濃度下,高濃度CO2對(duì)葛仙米生長(zhǎng)的效應(yīng)不顯著(P＞0.05)。雙因子方差分析表明,CO2和P對(duì)葛仙米相對(duì)生長(zhǎng)速率的交互作用不顯著(P＞0.05)。

圖1 葛仙米在不同CO2和P濃度培養(yǎng)下相對(duì)生長(zhǎng)速率Fig.1 Relative growth rates of N.sphaeroides cultured at different concentrations of CO2 and P

2.2 粒徑和數(shù)量

如圖 2表示,CO2或P濃度均對(duì)葛仙米粒徑和數(shù)量具有顯著影響(P＜0.05)。而在大氣CO2濃度培養(yǎng)下(LC),HP濃度培養(yǎng)的小球(1—2 mm)明顯增加(P＜0.05),大球數(shù)量減少。但在HC培養(yǎng)下,HP濃度培養(yǎng)下大球(大于4 mm)的顯著增加(P＜0.05)。在相同P濃度時(shí),HC下粒徑大于4 mm的葛仙米小球占比顯著高于LC(P＜0.05)。雙因子方差分析表明CO2和P具有顯著的交互效應(yīng)(P＜0.05),高濃度CO2培養(yǎng)提升了P濃度對(duì)葛仙米球體增大和數(shù)量的促進(jìn)效應(yīng)。

圖2 不同CO2和P濃度培養(yǎng)下葛仙米球體所占比例(A.1—2 mm,B.＞4 mm)Fig.2 Proportion of N.sphaeroides cultured at different concentrations of CO2 and P (A.1—2 mm,B.＞4 mm)

2.3 葉綠素a含量

如圖 3所示,CO2濃度變化對(duì)葛仙米葉綠素a含量具有顯著影響(P＜0.05),但P濃度變化的影響不顯著(P＞0.05)。在大氣CO2濃度培養(yǎng)下,LP、MP中葉綠素a含量明顯高于HP (P＜0.05)。而在HC條件下,P濃度變化對(duì)葛仙米葉綠素a含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。在LP和MP濃度培養(yǎng)下,HC導(dǎo)致葛仙米葉綠素a含量顯著下降(P＜0.05),而在HP下,CO2濃度變化對(duì)葉綠素含量并沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)。雙因子方差分析表明,CO2和磷對(duì)葛仙米的葉綠素a含量有顯著的交互作用(P＜0.05),高濃度CO2降低了HP對(duì)葉綠素合成的抑制作用。

圖3 葛仙米在不同CO2和P濃度培養(yǎng)下Chl.a含量的變化Fig.3 Changes of Chl.a content in N.sphaeroides under different CO2 and P concentrations

2.4 藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白含量

如表 1所示,CO2濃度變化對(duì)葛仙米藻膽蛋白的含量具有顯著的影響 (P＜0.05),但P濃度變化影響并不明顯(P＞0.05)。在相同P濃度培養(yǎng)下,LC培養(yǎng)的葛仙米PC、APC和PE含量分別比HC葛仙米含量高46.62%、34.01%和40.89% (P＜0.05)。雙因子方差分析結(jié)果表明,CO2和P對(duì)葛仙米的PC、APC和PE含量交互作用不顯著(P＞0.05)。

表1 葛仙米對(duì)PC、APC和PE含量的影響Tab.1 PC,APC and PE (mg/g DW) contents of N.sphaeroides under different conditions of CO2 and P concentrations

2.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

圖4和圖 5表示不同CO2和P濃度下葛仙米光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)效率(Yield)的變化。CO2或P濃度單因子變化對(duì)Fv/Fm無(wú)顯著影響(P＞0.05),但CO2濃度變化對(duì)Yield具有顯著影響(P＜0.05)。不管LP、MP還是HP,在HC培養(yǎng)下的Yield顯著高于LC培養(yǎng)。雙因子方差分析結(jié)果表明CO2和P對(duì)葛仙米的Fv/Fm、Yield的交互作用不顯著(P＞0.05)。

圖4 不同CO2和P濃度培養(yǎng)下葛仙米最大光化學(xué)效率的變化Fig.4 Changes of maximum photochemical efficiency of N.sphaeroides under different concentrations of CO2 and P concentrations

圖5 不同CO2和P濃度對(duì)葛仙米實(shí)際光化學(xué)效率的影響Fig.5 Effects of different CO2 and P concentrations on the actual photochemical efficiency of N.sphaeroides

2.6 P-I曲線

如圖 6和表 2所示,結(jié)果顯示在大氣CO2濃度下(LC),HP的葛仙米Pm值比MP、LP分別高24.89%和27.65%(P＜0.05);在高CO2濃度下,HP比MP、LP培養(yǎng)分別提高18.05%和12.30%(P＜0.05),表明高磷濃度有利于提高葛仙米光飽和光合速率。而在LP和MP濃度下,高濃度CO2培養(yǎng)葛仙米Pm顯著升高(P＜0.05),但HP下影響不顯著(P＞0.05)。雙因子方差分析結(jié)果顯示CO2和磷對(duì)葛仙米Pm的交互作用不顯著(P＞0.05)。

表2 P-Ⅰ曲線光合參數(shù)Tab.2 Photosynthetic parameters of N.sphaeroides grown under different conditions of CO2 and P concentration

圖6 葛仙米在不同CO2和P濃度培養(yǎng)下的P-Ⅰ曲線Fig.6 P-I curves of N.sphaeroides cultured at different concentrations of CO2 and P

CO2濃度對(duì)葛仙米的Rd有顯著影響(P＜0.05)。在大氣CO2濃度培養(yǎng)下(LC),MP培養(yǎng)的葛仙米R(shí)d顯著低于LP和HP (P＜0.05)。而在高CO2濃度下,MP和HP培養(yǎng)的葛仙米R(shí)d顯著高于LP(P＜0.05);P對(duì)葛仙米的Rd也有顯著性影響 (P＜0.05),高CO2濃度培養(yǎng)導(dǎo)致LP的Rd值明顯下降(P＜0.05),而MP和HP則明顯提高(P＜0.05)。雙因子方差分析結(jié)果表明CO2和P對(duì)葛仙米R(shí)d具有顯著的交互作用(P＜0.05)。

在大氣CO2濃度培養(yǎng)下,P濃度的變化對(duì)光合效率沒(méi)有明顯影響;但高濃度CO2培養(yǎng)下,P濃度升高導(dǎo)致光合效率明顯升高(P＜0.05),與LP相比,MP和HP培養(yǎng)下α值分別升高40.7%和89.0%。兩因子方差分析結(jié)果表明CO2和P對(duì)葛仙米α有顯著的交互作用(P＜0.05),高濃度CO2明顯增強(qiáng)了P的效應(yīng)。

3 討論

CO2是藻類(lèi)進(jìn)行光合作用的原料,但在自然環(huán)境中CO2濃度遠(yuǎn)低于藻類(lèi)Rubisco的Km,所以有些藻類(lèi)可以通過(guò)形成CO2濃縮機(jī)制,以緩解CO2的限制[22]。Riebesell等[23]研究表明海洋浮游植物生長(zhǎng)常受CO2供應(yīng)速率的限制。在藻類(lèi)高密度培養(yǎng)過(guò)程中,無(wú)機(jī)碳濃度不足也會(huì)限制藻細(xì)胞的生長(zhǎng),添加無(wú)機(jī)碳可以促進(jìn)生物量的增加,但添加CO2的效果明顯優(yōu)于[24]。本研究結(jié)果也顯示高CO2濃度對(duì)葛仙米的生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用。葛仙米除了能直接通過(guò)擴(kuò)散作用利用CO2外,還具有一定的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)能力[25]。高濃度CO2培養(yǎng)下,藻類(lèi)光合作用可以通過(guò)降低對(duì)CO2親和力,增強(qiáng)CO2擴(kuò)散作用,在葉綠體周?chē)岣逤O2濃度,降低光呼吸;同時(shí)可以減少在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)中的能量消耗,將更多能量用于生長(zhǎng)所需[22]。在高濃度CO2培養(yǎng)下葛仙米Pm、Fv/Fm和α值的變化也印證了這一點(diǎn)。葛仙米細(xì)胞被膠質(zhì)外鞘包圍,而這些膠質(zhì)鞘的主要成分是多糖[26],高CO2濃度培養(yǎng)下光合速率的增加有利于有機(jī)物質(zhì)的積累,使葛仙米球體增大和數(shù)量增加。但在高濃度CO2培養(yǎng)下葛仙米色素含量(葉綠素和藻膽素)的降低表明高CO2濃度對(duì)色素合成具有明顯的抑制作用,這可能與色素合成酶在高濃度CO2下受到了抑制有關(guān)。

P元素作為葛仙米主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),參與葛仙米的生長(zhǎng)的多種代謝過(guò)程。磷限制會(huì)影響光合作用中的卡爾文循環(huán)和ATP的合成,同時(shí)P也參與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換和遺傳信息的傳遞,調(diào)節(jié)酶活性,進(jìn)而影響光合作用。Gao等[27]研究發(fā)現(xiàn)磷加富能增強(qiáng)中肋骨條藻的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)能力促進(jìn)無(wú)機(jī)碳的獲取,進(jìn)而增強(qiáng)光合速率。而Chen等[13]研究也反映了提高磷濃度有利于促進(jìn)葛仙米生長(zhǎng)和光合速率,我們的研究結(jié)果也與之相一致。Gantt等[28]研究表明藻膽蛋白作為藻類(lèi)捕獲光能天線系統(tǒng)的重要成分,其主要功能是捕獲光能,并將光能以95%以上的效率傳遞給光系Ⅱ(PSⅡ),但本研究顯示磷濃度變化對(duì)色素含量(葉綠素a和藻膽素)并沒(méi)有明顯影響,表明高磷培養(yǎng)下葛仙米光合速率的增加并不是通過(guò)增加光能的捕獲,而是可能通過(guò)提高光能的利用效率來(lái)實(shí)現(xiàn),同時(shí)高磷濃度可能通過(guò)增加ATP的合成提升無(wú)機(jī)碳的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)能力,增加在Rubisco周?chē)鶦O2濃度,導(dǎo)致光合速率增加,促進(jìn)葛仙米生長(zhǎng)。

CO2或P濃度單因子變化均可以影響葛仙米的生長(zhǎng)和光合作用,但兩者的交互作用呈現(xiàn)與單獨(dú)作用不同的效應(yīng)。如CO2×P對(duì)藻膽蛋白含量、Fv/Fm和Yield等并沒(méi)有顯著的交互效應(yīng),表明CO2和P濃度變化對(duì)藻膽素合成、最大光化學(xué)效率和實(shí)際光化學(xué)效率的效應(yīng)僅是獨(dú)立作用。Xu等[29]在大型海藻(Sargassum muticum)的研究中表明在大氣CO2濃度和高磷培養(yǎng)葉綠素含量明顯增加,但在高濃度CO2培養(yǎng)下,高磷對(duì)葉綠素含量并沒(méi)有明顯影響。我們的研究顯示在大氣CO2濃度培養(yǎng)下,磷濃度升高導(dǎo)致葉綠素a含量的下降,但高濃度下則未見(jiàn)此現(xiàn)象,表明高濃度CO2培養(yǎng)緩解了高磷濃度對(duì)葉綠素a合成的抑制效應(yīng),這可能與高濃度CO2培養(yǎng)下能量的分配相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示大氣CO2濃度培養(yǎng)下P濃度增加對(duì)光合效率的影響并不明顯,但在高濃度CO2培養(yǎng)下增強(qiáng)了磷對(duì)光合效率的效應(yīng),兩者存在明顯的交互作用,表明高濃度CO2和磷濃度對(duì)光合效率的提高具有明顯的協(xié)同作用,這與高濃度CO2和高磷濃度具有較高的相對(duì)生長(zhǎng)速率、較多的粒徑較大球體數(shù)量相一致,這也可能與高CO2濃度下和高磷濃度下能提供更多的ATP相關(guān)。

總之,在葛仙米大量培養(yǎng)中,添加高濃度CO2有利于葛仙米的生長(zhǎng),同時(shí)將BG110培養(yǎng)液中磷濃度加倍,兩者的協(xié)同效應(yīng)更有利于促進(jìn)葛仙米球體的增大和較大球體數(shù)量的增加。本研究為葛仙米大量培養(yǎng)過(guò)程中CO2和磷的添加提供了生理學(xué)理論基礎(chǔ)。