賀 妍，吉曉霞，李曉娟，欒中華，余紅梅

(1山西醫(yī)科大學衛(wèi)生統計學教研室，太原 030001；2山西省運城市中心醫(yī)院病理科；*通訊作者,E-mail:yu@sxmu.edu.cn)

細胞蠟塊(cell block, CB)是指從細胞學標本(漿膜腔積液、細針穿刺等)中收集沉淀物、血凝塊或肉眼可見的組織塊，這些組織塊被加工成石蠟塊，通常用蘇木精-伊紅染色(HE染色)[1]。目前，細胞蠟塊已經廣泛用于細胞學診斷工作中，是細胞學的重要組成部分，主要用于腫瘤的溯源和分類[2]。在細胞學標本量足夠、惡性腫瘤細胞量充足的情況下，本實驗室通常采用離心沉淀法制備細胞蠟塊。實際工作中偶爾會遇見一些極端情況，由于各種原因(如腫瘤患者高齡、惡液質等)無法獲取足量細胞學標本，患者更不可能耐受活檢等創(chuàng)傷更大的檢查。有限的標本完成液基細胞學制片后，剩余標本不能通過直接離心包埋成蠟塊，導致后續(xù)對腫瘤定性分型、指導治療相關檢查(如免疫細胞化學、分子檢測等)無法開展。因此，針對量少細胞學標本，迫切需要尋找一種實用的細胞蠟塊制備方法。針對此種情況，本實驗室將液基細胞學與血漿-凝血酶法結合起來，探尋出一種簡單快速、成本低且制片效果良好，同時能滿足后續(xù)相關檢查保證精準診斷的細胞蠟塊制備法。此種方法可避免病人重復有創(chuàng)性檢查的痛苦，實現標本利用最大化，經實踐證明，在惡性腫瘤的診療中發(fā)揮積極作用。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集運城市中心醫(yī)院病理科2021年1—7月液基細胞學制片后剩余標本87例。其中包括漿膜腔積液24例，肺泡灌洗液21例，甲狀腺細針穿刺16例，腹腔沖洗液15例，尿液8例，痰液3例。

1.2 主要試劑

PreservCyt?細胞清洗液(新柏氏公司細胞清洗液，用于去除體液標本中紅細胞、黏液等)；PreservCyt?細胞保存液(新柏氏公司細胞保存液，用于體液標本離心后細胞長期保存)；凝血酶時間(TT)測定試劑盒(上海太陽生物技術有限公司、8/10×2.5 ml規(guī)格)；新鮮冰凍血漿(來源于無償獻血枸櫞酸鈉抗凝新鮮血漿)；4%中性緩沖福爾馬林；免疫細胞化學試劑CK7、TTF-1、p63等一抗抗體購于福州邁新生物技術有限公司；二抗抗體購于中杉金橋公司(Ultra PATH Plus DAB染色液)。

1.3 主要材料

20 ml離心管、一次性滴管、塑料包埋盒。

1.4 主要儀器

高速離心機、脫水機、包埋機、切片機、自動染色機。免疫細胞化學采用中杉金橋Ultra PATH自動免疫組織化學染色機(設備型號：Ultra 60)。

1.5 方法

本試驗采用雙盲法，即技術員和診斷醫(yī)師均不知曉標本液基細胞學診斷結果。

1.5.1 血漿-凝血酶法細胞蠟塊制備 制備細胞蠟塊操作如下：①凝血酶試劑配置：按試劑盒說明書要求，每瓶凝血酶凍干粉加入2.5 ml緩沖液，靜置5～10 min，輕搖溶解。②將液基細胞樣本瓶中剩余液體倒入20 ml離心管中，3 000 r/min離心5 min后，倒掉上清液，剩余細胞沉渣備用。③離心管中加入與細胞沉渣相適量的新鮮血漿，充分混勻后，加入等體積配置好的凝血酶。靜置數秒，可見固體細胞團塊形成后，將團塊輕輕倒在包埋紙上，包好放入密孔型包埋盒內，立即投入4%中性緩沖福爾馬林固定4 h。④充分固定后，將包埋盒放入脫水機進行常規(guī)脫水。

1.5.2 HE切片制備和免疫細胞化學染色 細胞蠟塊常規(guī)脫水后，第2天進行石蠟包埋、切片、HE染色、鏡檢。針對陽性及可疑陽性標本，根據診斷需要選擇免疫細胞化學抗體。免疫細胞化學染色在中杉金橋Ultra PATH自動免疫組化機上完成。鏡下觀察。

1.5.3 統計學方法 以病理活檢為“金標準”，采用SPSS 25軟件對檢測結果進行配對四格表χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

87例標本中成功制備細胞蠟塊83例，成功率95.4%(83/87)。83例細胞蠟塊中有活檢病理結果75例。二者診斷結果對比后，69例一致，6例不符，診斷正確率為92.0%(69/75)。

2.1 常規(guī)HE染色結果

83例標本細胞蠟塊制片后，切片染色清晰，對比度明顯(見圖1)。

A.胸腔積液細胞蠟塊中乳腺癌細胞(HE,×100)；B.腹腔沖洗液細胞蠟塊中惡性腫瘤細胞(HE,×200)，經術后病理及外出會診確診為惡性混合性苗勒腫瘤；C.胸腔積液細胞蠟塊中血管肉瘤細胞(HE,×200)；D.甲狀腺細針穿刺細胞蠟塊中甲狀腺乳頭狀癌細胞(HE,×200)；E.肺泡灌洗液細胞蠟塊中肺小細胞癌細胞團(HE,×200)；F.尿液細胞蠟塊中乳頭狀結構(HE,×200)；G.痰液細胞蠟塊中小細胞肺癌細胞團(HE,×200)圖1 不同來源標本細胞蠟塊切片HE染色效果Figure 1 HE staining of cell blocks from different samples

2.2 免疫細胞化學染色結果

染色背景清晰，陽性表達信號定位準確，均勻分布，對比度明顯(見圖2)。

A.肺腺癌心包積液細胞蠟塊常規(guī)染色(HE,×400)；B.肺腺癌免疫細胞化學染色CK7(+)(ICC,×400)；C.肺腺癌免疫細胞化學染色TTF-1(+)(ICC,×400)；D.肺腺癌免疫細胞化學染色p63(-)(ICC,×400)；E.小細胞肺癌胸腔積液細胞蠟塊常規(guī)染色(HE,×100)；F.小細胞肺癌免疫細胞化學染色TTF-1(+)(ICC,×200)；G.小細胞肺癌免疫細胞化學染色CD56(+)(ICC,×200)；H.小細胞肺癌免疫細胞化學染色Syn(+)(ICC,×200)；I.小細胞肺癌免疫細胞化學染色Ki-67(70%+)(ICC,×200)圖2 肺腺癌心包積液和小細胞肺癌胸腔積液細胞蠟塊的HE及免疫細胞化學染色Figure 2 HE and ICC staining of cell blocks from pericardial effusion of lung adenocarcinoma and pleural effusion of small cell lung cancer

2.3 病理診斷結果

87例標本中有活檢病理結果共75例。細胞蠟塊與活檢結果采用SPSS 25進行配對四格表χ2檢驗分析，結果顯示兩組間差異無統計學意義(P=0.219，見表1)。

表1 細胞蠟塊與活檢病理診斷結果 (例)

3 討論

惡性腫瘤的細胞病理學診斷中，細胞蠟塊有效彌補了液基細胞制片的缺點。細胞蠟塊清晰度高，細胞量大，保存了細胞原有的排列方式和結構，免疫細胞化學及分子檢測陽性率高且標本可以長期保存[3-5]。因此，目前采用液基細胞學制片和細胞蠟塊聯合使用以提高惡性腫瘤診斷準確性[6]。細胞蠟塊可以充分利用送檢材料完成更多的檢查工作，對患者的創(chuàng)傷性更低，特別適用于因各種原因無法獲取活檢標本的惡性腫瘤病人[7]。細胞蠟塊制備方法有多種，如玻片法、離心沉淀法、添加填充劑法等，每種方法各有其優(yōu)缺點[8,9]。國內外各實驗室針對不同類型標本也在不斷摸索新的方法，以解決現有方法的不足[10-13]。但現有文獻少有針對液基細胞學剩余標本細胞蠟塊制備方法的研究，本實驗室經過長期探索，尋找到一種適合的細胞蠟塊制備方法:血漿-凝血酶法。

凝血酶與血漿混合可以促進纖維蛋白形成支架，將注入血漿中的細胞網羅其中。對比其他方法，本次研究發(fā)現血漿-凝血酶法制備液基細胞學剩余標本細胞蠟塊在惡性腫瘤的診斷中具有以下優(yōu)勢：①解決了患者因標本量少、無法通過直接離心法制備細胞蠟塊的困境，可得到細胞量充足的蠟塊，為更多的惡性腫瘤患者爭取診斷和治療機會。本次研究87例標本中，成功制備細胞蠟塊83例，成功率95.4%。②采用液基細胞學剩余標本，前期處理去除了標本內紅細胞、黏液等干擾成分，高度集中保留了惡性腫瘤細胞。③血漿、凝血酶混合后形成纖維蛋白，隨后不斷收縮，網羅在其中的細胞在脫水包埋過程中不易松散破碎，有效避免了細胞丟失，實現惡性腫瘤患者細胞學標本利用最大化。④蠟塊制備在離心管內完成，整個過程標本未暴露于空氣中，有效避免蠟塊本身被污染，同時生物安全性高。⑤不需購置額外設備，節(jié)約科室成本，從而節(jié)約患者診斷費用。⑥可立即包埋成塊，無需等待，為技術員節(jié)省時間。此方法制備1例細胞蠟塊大約僅需10～15 min。⑦細胞分布集中、不松散，切片中細胞密度高，便于診斷醫(yī)師鏡下觀察，利于惡性腫瘤的診斷。⑧細胞結構清晰、完整，免疫細胞化學表達良好、定位準確。75例標本診斷結果與活檢結果對比后，診斷正確率92.0%，診斷準確度高。

6例標本診斷結果與活檢不符。其中誤診1例，術前診斷為可疑甲狀腺乳頭狀癌，術后病理結果為橋本氏甲狀腺炎，且細胞增生活躍異型性明顯。漏診5例，分別為腹腔沖洗3例，甲狀腺細針穿刺1例，肺泡灌洗液1例。其中2例腹腔沖洗液漏診原因為患者處于腫瘤早期，腹腔尚未發(fā)生轉移。另外1例腹腔沖洗液和肺泡灌洗液漏診原因為送檢標本中惡性細胞量少，尚不足以明確診斷為惡性腫瘤細胞。1例甲狀腺細針穿刺術后病理證實為甲狀腺乳頭狀癌濾泡亞型，漏診原因為細胞蠟塊切片中細胞形態(tài)不夠典型，尚不足以診斷為惡性。所有誤診與漏診病例與送檢標本質量、腫瘤類型及組織學形態(tài)特征有關，與本方法無關。

每種方法均有優(yōu)缺點，在應用過程中，發(fā)現此法存在以下不足。首先，當液基細胞學剩余標本量過少(低于5 ml)時，細胞蠟塊無法獲得滿意細胞量，這也是87例標本中6例標本細胞蠟塊制備失敗原因所在。此情況在相關文獻也有報道[14]。其次，本方法用到PreservCyt?細胞保存液，有文獻報道其固定效果不如福爾馬林和95%酒精[15]。最后，Sung等[16]的研究表明，人類血漿可能是潛在的DNA污染源，盡管污染可能性很低，但不能排除導致錯誤結果的可能性。針對上述缺點還需后續(xù)不斷研究探討，以改良方法。

綜上所述，使用血漿-凝血酶法制備液基細胞學剩余標本細胞蠟塊，在細胞量、細胞密度、節(jié)約成本和時間、蠟塊制備成功率、惡性腫瘤診斷準確率等方面均有優(yōu)勢，可在惡性腫瘤患者診斷及治療中發(fā)揮積極作用。在無法獲取更多滿意標本的情況下，可考慮推廣開展。