邵 馨，王 爽，宋 揚(yáng)，吳 凡，王麗穎*

(1西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710004；2西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科；3空軍第九八六醫(yī)院口腔科；4空軍第九八六醫(yī)院心臟外科；*通訊作者,E-mail:710808434@qq.com)

牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是由牙周組織分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，特定誘導(dǎo)條件下，可以分化為牙周膜組織、骨組織、血管組織和神經(jīng)組織等[1]。由于PDLSCs特定的組織來源，以及明確的向牙周組織分化的潛能，自2004年一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就被認(rèn)為是最有牙周再生潛質(zhì)的成體干細(xì)胞[2-4]，目前利用PDLSCs修復(fù)牙周組織缺損已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[5,6]。

研究表明炎癥、高糖等原因會(huì)造成PDLSCs骨向分化能力下降，進(jìn)一步損害PDLSCs牙周缺損修復(fù)功能[7,8]。研究中常利用無功能的智齒或正畸牙培養(yǎng)PDLSCs，但原代培養(yǎng)可獲取的細(xì)胞數(shù)量有限(平均1 250個(gè)細(xì)胞)，因此體外傳代PDLSCs是十分重要的[9]。采用傳代的方式可達(dá)到細(xì)胞數(shù)量的需求，但長(zhǎng)期體外傳代會(huì)引起間充質(zhì)干細(xì)胞干性降低，這可能導(dǎo)致細(xì)胞再生治療的療效下降[10]，因此本研究聚焦于多次傳代培養(yǎng)對(duì)PDLSCs成骨分化以及牙周修復(fù)潛能的影響。

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs, lncRNAs)是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的不編碼任何蛋白質(zhì)的RNA，在調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能方面發(fā)揮重要作用。很多研究都闡述了lncRNA在調(diào)控PDLSCs成骨分化方面的作用[11,12]。本課題組前期研究證實(shí)，牙周炎癥來源牙周膜干細(xì)胞成骨相關(guān)lncRNA(osteogenesis impairment-related of lncRNA periodontal mesenchymal stem cells from periodontitis patients, lncRNA POIR)與PDLSCs成骨分化有關(guān)，可以通過miR-182調(diào)控成骨相關(guān)靶基因FoxO1來修復(fù)炎癥PDLSCs受損的成骨分化能力，在體內(nèi)和體外均可促進(jìn)PDLSCs的骨形成[13]。但lncRNA POIR是否參與調(diào)控多次傳代后PDLSCs牙周再生潛能，尚無相關(guān)研究。本課題通過研究lncRNA POIR對(duì)多次傳代后PDLSCs成骨分化功能的影響，以期提高多次傳代PDLSCs牙周缺損修復(fù)能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素(Gibco，美國(guó))，0.25%胰蛋白酶、I型膠原酶(Sigma，美國(guó))，中性蛋白酶(Roche Diagnostics Gmbh，德國(guó))，Vario免疫磁珠分選器(MASC，德國(guó))，Stro-1抗體(Rnd，美國(guó))，成骨誘導(dǎo)液(Cyagen，美國(guó))，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ALP檢測(cè)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)，茜素紅染液(陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司)，sh-lncRNA POIR質(zhì)粒、sh-NC質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P基因有限公司)，Trizol試劑盒(Invitrogen，美國(guó))，SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)，抗人矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、ALP、骨鈣素(osteocalcin, OCN)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(Abcam，美國(guó))。

1.2 牙周膜干細(xì)胞(hPDLSCs)的分離和培養(yǎng)

取西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院15～25歲患者因正畸需要或阻生齒拔除的無齲病、慢性牙周疾病的正畸牙或第三磨牙，本研究經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2020398)，所有患者均知情同意。在超凈臺(tái)內(nèi)分離牙根中部的牙周膜組織，用3 mg/ml Ⅰ型膠原酶和4 mg/ml中性蛋白酶消化分離的組織1 h，離心后棄上清，加入含20% FBS、1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基重懸，接種于25T培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右融合率時(shí)用胰蛋白酶消化，按照1 ∶2或1 ∶3比例傳代培養(yǎng)，記為第1代細(xì)胞。選取第2代細(xì)胞與stro-1抗體在4 ℃環(huán)境下反應(yīng)20～30 min，PBS洗滌，二抗4 ℃環(huán)境下孵育20～30 min，PBS洗滌2遍。將LD管置于Vario免疫磁珠分選器中，在4 ℃條件下分離stro-1陽性細(xì)胞，即hPDLSCs細(xì)胞。取第3代、第15代、第30代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)成骨分化相關(guān)研究，包括ALP染色、ALP活性、茜素紅染色和RT-PCR，檢測(cè)細(xì)胞代數(shù)對(duì)細(xì)胞成骨分化能力的影響。

1.3 ALP染色、ALP活性、茜素紅染色共同檢測(cè)hPDLSCs成骨分化能力

1.3.1 ALP染色 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PDLSCs以5×104/孔的密度接種于12孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右融合率時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d換液1次。細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d去除原培養(yǎng)基，PBS漂洗后4%多聚甲醛固定30 min，再次漂洗后用ALP染色試劑盒染色，漂洗后鏡下觀察。通過Image J軟件檢測(cè)染色所占面積并計(jì)算面積百分比，染色面積占比越大說明細(xì)胞ALP表達(dá)量越高，細(xì)胞成骨分化能力越強(qiáng)。

1.3.2 ALP活性 按1×103/孔的比例將細(xì)胞接種到96孔板，24 h開始成骨誘導(dǎo)，7 d倒掉培養(yǎng)液，PBS清洗3次，配置ALP活性測(cè)定工作液，添加工作液至96孔板，37 ℃環(huán)境中孵育30 min，加入顯色液。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在560 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)。吸光度越高說明細(xì)胞ALP表達(dá)量越高，細(xì)胞成骨分化能力越強(qiáng)。

1.3.3 茜素紅染色 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PDLSCs以5×104/孔的密度接種于12孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右融合率時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d換液1次。細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d去除原培養(yǎng)基，PBS漂洗后4%多聚甲醛固定30 min，再次漂洗后用茜素紅染液染色，漂洗后鏡下觀察，礦化結(jié)節(jié)紅染。觀察后進(jìn)行茜素紅染色定量，將0.5 mol/L HCl、5% SDS加入12孔板，每孔0.5 ml，室溫作用30 min，吸取0.15 ml加入96孔板中，檢測(cè)吸光度(405 nm)。吸光度越高說明細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成越多，細(xì)胞成骨分化能力越強(qiáng)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)hPDLSCs中l(wèi)ncRNA POIR表達(dá)水平

用Trizol試劑盒提取第3代、第15代、第30代PDLSCs的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板鏈，采用RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,分析比較lncRNA POIR隨PDLSCs代數(shù)增加的變化趨勢(shì)。lncRNA POIR和β-actin引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將第30代PDLSCs以5×104/孔的密度接種于12孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%左右融合率時(shí)將細(xì)胞分為空白對(duì)照組(不經(jīng)任何處理)、無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組(轉(zhuǎn)染sh-NC質(zhì)粒)和lncRNA POIR下調(diào)組(轉(zhuǎn)染sh-lncRNA POIR質(zhì)粒)。將sh-NC質(zhì)粒、sh-lncRNA POIR質(zhì)粒分別和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)混勻，室溫靜置20 min分別加入無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞和lncRNA POIR下調(diào)組細(xì)胞中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h用于后續(xù)成骨分化相關(guān)研究，包括ALP染色、ALP活性、茜素紅染色和RT-PCR、Western blot，檢測(cè)lncRNA POIR對(duì)細(xì)胞成骨分化功能的影響，并用于RT-PCR檢測(cè)lncRNA POIR對(duì)miR-214的作用。sh-lncRNA POIR質(zhì)粒序列：5′-CTCCCTCCATGAAGGTTTAAT-3′；sh-NC質(zhì)粒序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.6 ALP染色、ALP活性和茜素紅染色共同檢測(cè)各組PDLSCs成骨分化能力

取空白對(duì)照組、無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組、lncRNA POIR下調(diào)組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PDLSCs進(jìn)行ALP染色、ALP活性和茜素紅染色試驗(yàn)，具體方法見1.3中所述。

1.7 RT-PCR和Western blot檢測(cè)Runx2、ALP、OCN的表達(dá)水平

用Trizol試劑盒提取lncRNA POIR下調(diào)組、空白對(duì)照組、無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組PDLSCs的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板鏈，采用RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,分析比較各組PDLSCs中Runx2、ALP、OCN表達(dá)水平。Runx2、ALP、OCN、β-actin引物序列見表1。

取下調(diào)組、空白對(duì)照組、無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組PDLSCs，加入蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。各取20 μg總蛋白加熱變性，依次將各個(gè)蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)膜封閉，加入一抗兔抗Runx2(稀釋比1 ∶1 000)、ALP(稀釋比1 ∶1 000)、OCN(稀釋比1 ∶1 500)、β-actin(稀釋比1 ∶2 000)，4 ℃環(huán)境下過夜培養(yǎng)，室溫環(huán)境下加入和辣根過氧化氫酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗(稀釋比1 ∶2 000)，孵育2 h，加入ECL進(jìn)行顯影曝光，β-actin作為對(duì)照。

1.8 生物信息學(xué)分析lncRNA POIR和miR-214的結(jié)合位點(diǎn)

應(yīng)用生物信息學(xué)工具對(duì)lncRNA POIR的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析lncRNA POIR和miR-214是否存在相似的結(jié)合位點(diǎn)。

1.9 RT-PCR檢測(cè)lncRNA POIR對(duì)miR-214的作用

用Trizol試劑盒提取lncRNA POIR下調(diào)組、空白對(duì)照組、無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組PDLSCs的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板鏈，采用RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，分析比較各組PDLSCs中miR-214表達(dá)水平。miR-214和β-actin引物序列見表1。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 多次傳代后PDLSCs成骨分化能力和lncRNA POIR水平變化

茜素紅染色檢驗(yàn)成骨分化的最終產(chǎn)物—礦化結(jié)節(jié)，是體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)成骨分化能力相對(duì)有力的證據(jù)。茜素紅染色結(jié)果顯示：第30代PDLSCs成骨結(jié)節(jié)形成量明顯少于第15代和第3代，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。ALP是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶，其在細(xì)胞中的表達(dá)量反映成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)。ALP染色結(jié)果顯示：第30代PDLSCs的ALP染色面積占比明顯低于第15代和第3代，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖1)。ALP活性結(jié)果顯示：第30代PDLSCs的ALP活性明顯低于第15代和第3代，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖1)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：lncRNA POIR的表達(dá)水平隨細(xì)胞代數(shù)增加呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖1)。

與第3代細(xì)胞比較，#P<0.05，##P<0.01；與第15代細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01圖1 多次傳代后PDLSCs成骨分化能力和lncRNA POIR表達(dá)水平Figure 1 The osteogenic differentiation ability and lncRNA POIR expression level of PDLSCs after multiple passages

2.2 lncRNA POIR下調(diào)后PDLSCs成骨分化能力下降

茜素紅染色結(jié)果顯示：用shRNA質(zhì)粒下調(diào)lncRNA POIR表達(dá)水平后，與空白對(duì)照組和無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，lncRNA POIR下調(diào)組PDLSCs成骨結(jié)節(jié)形成明顯減少(P<0.01，見圖2)。ALP染色結(jié)果顯示：lncRNA POIR下調(diào)組的ALP染色面積占比明顯低于空白對(duì)照組和無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P<0.01，見圖2)。ALP活性結(jié)果顯示：lncRNA POIR下調(diào)組的ALP活性明顯低于空白對(duì)照組和無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P<0.05，見圖2)。

與空白對(duì)照組和無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 lncRNA POIR下調(diào)后PDLSCs成骨分化能力Figure 2 The osteogenic differentiation ability of PDLSCs after down-regulation of lncRNA POIR

2.3 lncRNA POIR下調(diào)后PDLSCs中成骨相關(guān)基因、蛋白表達(dá)水平下降

RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：用shRNA質(zhì)粒下調(diào)lncRNA POIR表達(dá)水平后，與空白對(duì)照組和無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，lncRNA POIR下調(diào)組PDLSCs中Runx2、ALP、OCN表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

與空白對(duì)照組和無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 lncRNA POIR下調(diào)后PDLSCs中成骨相關(guān)基因、蛋白表達(dá)水平Figure 3 Expression of osteogenic genes and proteins in PDLSCs after down-regulation of lncRNA POIR

2.4 lncRNA POIR可抑制PDLSCs中miR-214的表達(dá)

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：lncRNA POIR與miR-214存在結(jié)合位點(diǎn)(見圖4)。為進(jìn)一步確定lncRNA POIR與miR-214之間調(diào)控關(guān)系，利用shRNA質(zhì)粒下調(diào)PDLSCs中l(wèi)ncRNA POIR的表達(dá)，RT-PCR結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組和無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，lncRNA POIR下調(diào)組的miR-214的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖4)。

與空白對(duì)照組和無義序列轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，**P<0.01圖4 lncRNA POIR下調(diào)后PDLSCs中miR-214表達(dá)水平Figure 4 Expression of miR-214 in PDLSCs after down-regulation of lncRNA POIR

3 討論

牙周炎是一種廣泛存在的疾病，其特征是炎癥引起的牙齒支持結(jié)構(gòu)的進(jìn)行性損傷，直到牙齒脫落，牙周組織中缺失或受損的支持組織(包括牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì))的再生是牙周再生治療的一個(gè)重要目標(biāo)[14]。在牙周再生的過程中，硬組織再生是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，而干細(xì)胞的成骨分化能力是評(píng)價(jià)其向牙周組織分化能力的主要指標(biāo)。

已有相關(guān)研究顯示干細(xì)胞的多次傳代對(duì)其分化功能的影響。Zaim等[15]探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)體外傳代對(duì)神經(jīng)向轉(zhuǎn)分化能力的影響，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期傳代是影響干細(xì)胞分化能力的關(guān)鍵系數(shù)，來自成年供體的hMSCs是在連續(xù)體外傳代過程中失去其干細(xì)胞特性。Tan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的體外傳代會(huì)導(dǎo)致PDLSCs衰老，可觀察到衰老相關(guān)蛋白在長(zhǎng)期傳代后增加，隨著傳代數(shù)量增加，細(xì)胞成骨分化功能降低。本研究結(jié)果顯示，相對(duì)于第3代PDLSCs，第15代和第30代PDLSCs成骨分化功能明顯下降，與上述研究結(jié)論一致。

lncRNA可以參與調(diào)控PDLSCs成骨分化。Gu等[17]對(duì)比了PDLSCs成骨分化前后差異表達(dá)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)共有960個(gè)lncRNA差異表達(dá)。He等[18]進(jìn)一步研究證實(shí)，lncRNA TUG1通過調(diào)節(jié)靶基因Lin28A進(jìn)而調(diào)控PDLSCs成骨分化。本課題組[13]前期研究顯示lncRNA POIR與PDLSCs成骨分化相關(guān)，該lncRNA可以在健康微環(huán)境下和炎癥微環(huán)境下正向調(diào)控PDLSCs的骨形成能力。本研究探討了lncRNA POIR與多次傳代后PDLSCs成骨分化的關(guān)系，利用質(zhì)粒下調(diào)lncRNA POIR的表達(dá)。茜素紅染色、ALP染色、RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，lncRNA POIR下調(diào)組PDLSCs成骨結(jié)節(jié)以及ALP活性均減少，骨形成標(biāo)志物RunX2、ALP、OCN表達(dá)水平下降，說明成骨分化能力確實(shí)存在進(jìn)一步下降。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，多次傳代會(huì)降低PDLSCs中l(wèi)ncRNA POIR表達(dá)水平，從而抑制PDLSCs成骨分化和牙周修復(fù)潛能，通過上調(diào)lncRNA POIR可以修復(fù)損傷的功能，但這一結(jié)果仍需動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

miR-214是一類序列高度保守的microRNA，在細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮十分重要的作用。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在生理和病理?xiàng)l件下，成骨細(xì)胞中的miR-214都是骨形成的重要抑制劑。該研究顯示，敲除miR-214基因后，去勢(shì)小鼠骨質(zhì)疏松癥狀明顯改善，骨形成能力提高。Cao等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-214在PDLSCs成骨分化過程中顯著下調(diào)，抑制miR-214可促進(jìn)PDLSCs的分化。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，lncRNA POIR與miR-214存在結(jié)合位點(diǎn)。利用質(zhì)粒下調(diào)lncRNA POIR的表達(dá)，miR-214在PDLSCs中的表達(dá)明顯升高，說明lncRNA POIR通過降低miR-214表達(dá)水平調(diào)控PDLSCs成骨分化，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，多次傳代會(huì)降低PDLSCs的成骨分化水平并抑制lncRNA POIR表達(dá)，lncRNA POIR調(diào)控PDLSCs傳代過程中的成骨分化功能，以上研究可以為臨床應(yīng)用多次傳代后PDLSCs修復(fù)牙周缺損提供參考。