吳可欣， 唐詩雨， 朱奕儒， 郭梓豫， 莫重輝， 趙寶玉， 路 浩*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016)

斜莖黃芪(Astragalusadsurgens)又叫沙打旺、麻豆秧、苦草、地丁等,是一種多年生草本植物，屬于豆科(Leguminosae)黃芪屬(Astragalus)[1]，主要分布我國東北、華北、西北、西南等地區(qū)。黃芪屬植物主要包含藥用黃芪和有毒黃芪兩類，藥用黃芪有提高機(jī)體免疫力、利尿、保肝、延緩細(xì)胞衰老和較廣泛的抗菌等作用，可用于治療氣虛乏力、癰疽難潰、慢性腎炎蛋白尿、糖尿病等[2]；有毒黃芪因其主要毒性成分為苦馬豆素(Swainsonine,SW)而歸為瘋草類有毒植物，動物采食后會引起以頭部震顫、步態(tài)蹣跚、后肢麻痹等神經(jīng)癥狀為主的瘋草中毒病，給我國西部草原畜牧業(yè)健康發(fā)展造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

目前有關(guān)斜莖黃芪是否屬于瘋草類有毒植物尚存在爭議。Cook等[5]認(rèn)為美國的斜莖黃芪因含有SW而歸屬于瘋草類有毒植物。余永濤等[6]從甘肅環(huán)縣和天祝藏族自治縣采集人工種植的斜莖黃芪中分離鑒定出產(chǎn)苦馬豆素的真菌。溫偉利[7]采用薄層色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對采自內(nèi)蒙古的斜莖黃芪開展了系統(tǒng)地化學(xué)成分分析，結(jié)果表明斜莖黃芪含原阿片堿、別隱品堿、坎那定、小檗堿、四氫黃連堿等，是斜莖黃芪的主要生物堿成分，但未檢測到苦馬豆素。以上試驗結(jié)果表明，不同生長環(huán)境的斜莖黃芪其化學(xué)成分可能存在差異，而不同生長環(huán)境會導(dǎo)致植物內(nèi)生真菌的多樣性[8-9]，進(jìn)而決定宿主植物的化學(xué)成分的差異。

鑒于青海的野生型斜莖黃芪資源非常豐富，本試驗旨在通過對采自青海的野生型斜莖黃芪進(jìn)行內(nèi)生真菌分離鑒定，對分離獲得的優(yōu)勢菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用薄層色譜定性檢測發(fā)酵液是否含苦馬豆素，明確青海的野生型斜莖黃芪是否屬于瘋草類有毒植物，為后續(xù)該植物的資源化利用提供重要理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 2021年7月從青海共和縣(北緯36°42′16″，東經(jīng)100°47′25″)、青海貴南縣(北緯35°26′31″，東經(jīng)101°36′15″)、青海門源縣(北緯37°46′25″，東經(jīng)101°41′34″)各隨機(jī)采集3株盛花期野生型斜莖黃芪，共9株。除去樣品根部的泥土，對整株植物進(jìn)行干燥處理后帶回實驗室進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。采集的植物組織包括根、莖、葉、花4個組織部位。

1.1.2培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar medium，PDA):土豆(200 g·L-1)，葡萄糖(20 g·L-1)，瓊脂粉(20 g·L-1)，去離子水1 L，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(Potato dextrose broth，PDB)：土豆(200 g·L-1)、葡萄糖(20 g·L-1)、去離子水1 L，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 主要儀器和試劑

PCR基因擴(kuò)增儀(美國Biorad)、TG16A臺式高速離心機(jī)(上海盧湘)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮)、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城工貿(mào))、2006-11(Db-2)型電熱板(常州國華)。75%酒精、2%次氯酸鈉、吸附柱型植物基因組DNA提取試劑盒(天根)、真菌通用引物ITS1和ITS4(西安擎科)、2×EsTaqMsater Mix、甲醇、苦馬豆素標(biāo)品(實驗室自主提取)、三氯甲烷、氨水等。

1.3 方法

1.3.1植物樣品的表面消毒 用去離子水將干燥的斜莖黃芪植物樣品各組織部位清洗干凈，將根、莖、葉分別剪成2 cm小段，放入培養(yǎng)皿中。其中，根組織樣品用去離子水浸泡2 h，其他部位不浸泡。將處理好的組織樣品放入超凈工作臺中進(jìn)行表面消毒。具體表面消毒步驟參考朱燕麗等[10]的方法進(jìn)行。由于次氯酸鈉溶液對于不同植物組織消毒滲透作用有差異，需在最后一次漂洗后，用鑷子蘸取少量漂洗液均勻涂于PDA培養(yǎng)基上，作為對照組，培養(yǎng)3～4 d后，觀察是否有細(xì)菌污染，以此確定適宜的表面消毒時間。

1.3.2內(nèi)生真菌的分離與純化 用滅菌的濾紙片將已消毒好的組織樣品表面的殘留液體吸干，用剪刀和鑷子將根、莖、葉、花分別剪成4 mm、3 mm的小段和2 mm×2 mm的方塊，將新鮮剪切面一側(cè)插入PDA培養(yǎng)基。已接種好的培養(yǎng)皿用封口膜密封，并培養(yǎng)于20℃霉菌培養(yǎng)箱中，每日觀察真菌的生長情況。培養(yǎng)3～4 d后，挑取不同形態(tài)特征的菌落，將其接種到新的培養(yǎng)皿中，直至分離純化出形態(tài)相同的單一菌落。每個組織部位反復(fù)接種3～4次，直至沒有新形態(tài)菌落的出現(xiàn)。

1.3.3內(nèi)生真菌的形態(tài)觀察與初步分類 每日觀察并記錄已純化的單一菌落的生長情況，包括菌落的大小、形態(tài)和顏色。將肉眼觀察為單一菌落的菌絲接種到含有PDA的培養(yǎng)皿中，待菌落長到直徑約1 cm時，用滅菌蓋玻片進(jìn)行菌絲插片，當(dāng)菌絲覆蓋玻片的3/4時可取出，用中性樹膠固定，制作菌絲切片。在顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)，依據(jù)《真菌鑒定手冊》、《真菌分類學(xué)》[11-12]等資料對菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.3.4內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析 按照植物基因DNA提取試劑盒操作步驟提取分離真菌DNA。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，采用真菌通用引物ITS1和ITS4對真菌DNA的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：模板2 μL,ITS1和ITS4各4 μL,2×EsTaq Master Mix 10 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1.5 min；94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸1 min，循環(huán)33次；72℃終延伸5 min；4℃保溫5 min。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往西安擎科生物公司進(jìn)行測序，將測序得到的真菌ITS序列與NCBI的DNA信息庫進(jìn)行比對。整理可信度最高的序列信息，將其導(dǎo)入至MEGA6.0軟件中,采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap評估為1 000次。根據(jù)所建立的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析菌株的親緣關(guān)系。

1.3.5斜莖黃芪植物組織浸膏的制備 把植物樣品粉碎至粉末狀，放到球形燒瓶中，倒入工業(yè)酒精直至淹沒草粉，浸泡24 h后，將球形燒瓶放入水浴鍋中，采用普通蒸餾裝置，在60～65℃條件下進(jìn)行冷凝回流，每次蒸餾2 h，共蒸餾4次，每次蒸餾后收集上層液體，并重新添加工業(yè)酒精。將收集的液體分次加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在75℃條件下進(jìn)行濃縮，把濃縮好的液體倒入蒸發(fā)皿中，并放入60℃水浴鍋中，揮發(fā)殘余的水分與工業(yè)酒精，直至變?yōu)槌頎罱鄻印?/p>

1.3.6優(yōu)勢菌株的發(fā)酵及其浸膏的制備 根據(jù)菌株測序的結(jié)果，挑選出5種優(yōu)勢菌株運用“菌餅法”在PDB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，具體操作步驟為：挑取菌株菌絲分別接種到含PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，待菌落生長到直徑約為2 cm左右時，將菌餅接種到PDB培養(yǎng)基中，放置于恒溫?fù)u床中發(fā)酵7 d，搖床條件設(shè)置為：28℃，175 r·min-1。將發(fā)酵7 d的菌株發(fā)酵液用循環(huán)水式多用真空泵進(jìn)行減壓抽濾。所得濾液倒入蒸發(fā)皿，將其放在60℃水浴鍋中濃縮成浸膏。

1.3.7植物組織浸膏與發(fā)酵液浸膏的薄層色譜分析 取浸膏少許，用甲醇溶解于青霉素瓶中，靜置10 min。用0.3 mm毛細(xì)管吸取上清液，點樣于已劃線的硅膠薄層板。將已點樣的硅膠薄層板倒置于含有展開劑的層析缸中(展開劑配比為氯仿∶甲醇∶氨水∶水=70∶26∶2∶2)，飽和15 min。然后，采用上行法展開，展開劑距硅膠薄層板約1 cm取出，吹風(fēng)機(jī)吹干展開劑。采用30%過氧化氫、10%醋酐溶液、Ehrlich試劑進(jìn)行三步顯色反應(yīng)，觀察各樣品顏色并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜莖黃芪不同組織部位內(nèi)生真菌分離結(jié)果

由于斜莖黃芪不同組織部位結(jié)構(gòu)不同和2%次氯酸鈉對不同組織部位消毒滲透作用的差異，根據(jù)對照組PDA培養(yǎng)基是否有細(xì)菌污染以及不同消毒時間分離的菌落數(shù)量，篩選出最適消毒時間如表1所示，根、莖、葉、花，分別在消毒時間為3 min,1 min 50 s,1 min 15 s,1 min 10 s時，所得菌落數(shù)最多且對照組沒有細(xì)菌污染，為該組織部位最適消毒時間。在四個組織部位中，根組織內(nèi)生真菌分離率最高，葉、花次之，莖最少。

表1 2%次氯酸鈉不同消毒時間斜莖黃芪不同組織的內(nèi)生真菌分離結(jié)果Table 1 Statistics of endophytic fungi isolated from different tissues of Astragalus adsurgens under different disinfection time of 2% sodium hypochlorite

2.2 斜莖黃芪內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)特征

將所觀察記錄的菌落特征及菌絲插片的觀測結(jié)果與《真菌鑒定手冊》等資料加以比對,初步確定了所分離的內(nèi)生真菌的種屬。主要菌種屬代表菌落和菌絲形態(tài)學(xué)特征如表2所示，圖1為部分優(yōu)勢菌種的菌落和菌絲形態(tài)。

表2 斜莖黃芪優(yōu)勢內(nèi)生真菌菌株的菌落和菌絲形態(tài)特征Table 2 Colony and hyphae characteristics of the dominant endophytic fungi of Astragalus adsurgens

圖1 斜莖黃芪部分優(yōu)勢內(nèi)生真菌菌落和菌絲的形態(tài)Fig.1 Morphology of some dominant endophytic fungal colonies and mycelia of Astragalus adsurgens注：a.G1.2菌落；b.G2.2菌落；c.H2菌落；d.H3菌落A.G1.2菌絲；B.G2.2菌絲；C.H2菌絲；D.H3菌絲Note:a.The colony of G1.2;b. The colony of G2.2;c.The colony of H2;d.The colony of H3A. The hyphae of G1.2;B.The hyphae of G2.2;C.The hyphae of H2;D.The hyphae of H3

2.3 斜莖黃芪內(nèi)生真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

將PCR擴(kuò)增后測序所得序列信息，在NCBI的DNA信息庫中加以比對，選取可信度最高的結(jié)果，運用《真菌鑒定手冊》等資料，確定菌株的種屬，鑒定結(jié)果如表3所示。共分離純化得到26種內(nèi)生真菌，分屬于5綱、5目、7科、7屬，其中4株未定屬。

表3 斜莖黃芪內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of endophytic fungi isolated from Astragalus adsurgens

2.4 斜莖黃芪不同組織內(nèi)生真菌的分布情況

計算斜莖黃芪不同組織部位內(nèi)生真菌的相對分離率及不同種屬菌株的相對分離率，結(jié)果如表4所示。從表4中可以看出，斜莖黃芪不同組織部位的菌株相對分離率有一定差異，根分離率最大為57.69%，莖最小為3.85%；從不同種屬菌株的相對分離率來看，鏈格孢菌屬(Alternariasp.)為斜莖黃芪的優(yōu)勢菌屬，分離率最高為23.08%，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)和毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)次之，分離率為19.23%；結(jié)合菌株種屬的分布情況可得知，根和葉中所分離的內(nèi)生真菌種類數(shù)較高，皆分離出3種不同屬的菌株(不包括未定屬)。圖2為不同植物組織部位菌株分離率的柱形圖比較，從圖中可以清晰的看出根組織菌株的分離率遠(yuǎn)大于其他組織，是內(nèi)生真菌主要富集的部位。圖3為不同種屬菌株的分離率的柱形圖比較，由圖可知曲霉屬(Aspergillussp.)、節(jié)孢霉屬(Arthriniumsp.)、莢孢腔屬(Sporormiellasp.)是分離率最低的三個種屬，分離率皆為3.85%。

表4 斜莖黃芪不同組織部位內(nèi)生真菌的分布情況及相對分離率Table 4 Distribution and relative isolation rate of endophytic fungi in different tissue parts of Astragalus adsurgens

圖2 不同植物組織部位菌株的分離率Fig.2 Isolation rate of strains from different plant tissues

2.5 斜莖黃芪內(nèi)生真菌的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測序所獲得真菌ITS序列導(dǎo)入MEGA軟件中，完成NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的建立，結(jié)果見圖4所示。根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可將26株菌株除曲霉屬(Aspergillussp.)外分為種群I和種群II，自檢支持率分別為74%和99%。種群Ⅰ分為種群A、種群B和節(jié)孢霉屬(Arthriniumsp.)，種群II分為種群C、座囊菌綱(Dothideomycetessp.)和節(jié)孢霉屬(Arthriniumsp.)。在種群Ⅰ中，紅貝菌屬(Earliellasp.)、毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)之前親緣關(guān)系并不接近。在種群Ⅱ中，莢胞腔屬(Sporormiellasp.)和鏈格孢菌屬(Alternariasp.)親緣關(guān)系較近。

圖3 不同種屬菌株的分離率Fig.3 Isolation rate of strains of different species

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 NJ phylogenetic tree constructed based on ITS sequence

2.6 植物組織浸膏及發(fā)酵液浸膏薄層層析結(jié)果

對植物組織浸膏和G2.5，G2.6，G6，H3，Y2共5種優(yōu)勢菌株發(fā)酵液浸膏中苦馬豆素進(jìn)行薄層層析法定性檢測。觀察結(jié)果，并與苦馬豆素標(biāo)品顏色和比移植(Rf值)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5所示，苦馬豆素標(biāo)品呈現(xiàn)紫紅色斑點，Rf值為0.55±0.10(苦馬豆素薄層色譜Rf參考值為0.398～0.58[13-15])，標(biāo)品Rf在參考值的范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)可信。各樣品均未出現(xiàn)紫色斑點，說明斜莖黃芪植物組織和優(yōu)勢菌種發(fā)酵液中均不含苦馬豆素。

圖5 薄層層析結(jié)果Fig.5 The results of TLC注：a.SW標(biāo)品；b.植物組織；c.G2.5；d.G2.6；e.G6；f.H3；g.Y2Note:a.SW standard;b. plant tissue;c.G2.5;d.G2.6;e.G6;f.H3;g.Y2

3 討論

本試驗采用表面消毒法和PDA培養(yǎng)基對斜莖黃芪進(jìn)行內(nèi)生真菌分離純化培養(yǎng)。大多數(shù)消毒劑通過滲透作用進(jìn)入植物組織，消毒時間的長短與滲透作用有著直接聯(lián)系。消毒時間過長，消毒劑過度滲入植物組織，導(dǎo)致植物組織內(nèi)生真菌被殺滅。消毒時間過短，表面消毒不夠徹底，會導(dǎo)致后續(xù)真菌純化實驗有雜菌污染，故進(jìn)行表面消毒時，消毒時間的選擇十分重要[16-17]。根、莖、葉、花最適宜消毒時間分別為3 min,1 min 50 s,1 min 15 s，1 min 10 s。根組織和其他組織最適宜消毒時間差異較大，可能與不同組織結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，根組織較其他組織而言結(jié)構(gòu)較致密。余永濤等[6]進(jìn)行斜莖黃芪內(nèi)生真菌分離時，其所采用消毒時間各組織皆為1%次氯酸鈉3 min，與本試驗選取的消毒時間除根組織外具有較大不同。這可能與次氯酸鈉濃度、乙醇濃度以及植物組織樣本的新鮮程度不同有關(guān)。此外，培養(yǎng)基中加入抗生素可能也對消毒時間篩選造成一定的影響。

本試驗從斜莖黃芪根、莖、葉、花植物組織中共分離出26株內(nèi)生真菌。其中，根組織的內(nèi)生真菌分離率最高，為57.69%，莖最少為3.85%。這可能與不同組織部位結(jié)構(gòu)不同和接種組織塊數(shù)有關(guān)，根組織與其他組織相比較為粗壯致密，更利于真菌的生長繁殖。莖組織較為纖細(xì)且接種組織塊數(shù)較少，這可能是其內(nèi)生真菌分離率較低的原因。從斜莖黃芪內(nèi)生真菌種屬分布來看，根和葉為斜莖黃芪種屬分布較多的組織部分，3類種屬的真菌均有分布。結(jié)合內(nèi)生真菌的分離率和種屬分布可知，根組織為斜莖黃芪內(nèi)生真菌富集的部位。將分離純化出的26株內(nèi)生真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列鑒定，得知26株內(nèi)生真菌分屬于5綱、5目、7科、7屬，其中4株未定屬。真菌種屬鑒定結(jié)果與余永濤等[6]鑒定結(jié)果相似，皆分離出了鏈格孢菌屬(Alternariasp.)、鐮刀菌屬(Fusariumsp.)真菌。而曲霉屬(Aspergillussp.)和毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)余永濤等[6]并未分出，可能與其并未采集花組織部位樣品有關(guān)。從根中分出的鏈格孢菌屬(Alternariasp.)是斜莖黃芪的優(yōu)勢菌屬，分離率為23.08%。相關(guān)報道顯示，鏈格孢菌屬(Alternariasp.)真菌在膜莢黃芪[18]、莖直黃芪[19]中皆有分布。毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)分布較廣，在葉和花中分布。此外，本試驗中所分離出的鏈格孢菌屬真菌(Alternariasp.)，不同于余永濤等[6]在斜莖黃芪中分離出能產(chǎn)苦馬豆素的內(nèi)生真菌甘肅波狀芽管孢(AlternariaSectionUndifilumgansuense)及白曉南等[20]在變異黃芪中分離到產(chǎn)苦馬豆素的內(nèi)生真菌U.oxytropis。這可能是因為地理環(huán)境不同而導(dǎo)致地區(qū)溫度及土壤酸堿度不同，從而引起內(nèi)生真菌的生長差異[21]。

吲哚哩嗞啶生物堿——苦馬豆素是引起動物瘋草中毒病的主要毒素，因此可將苦馬豆素作為判定該植物是否屬于瘋草類有毒植物的標(biāo)準(zhǔn)[22]，常用于檢測苦馬豆素的方法有薄層色譜法、氣相色譜法等。薄層色譜法因其經(jīng)濟(jì)、高效、操作簡單而被廣泛應(yīng)用[23]。本試驗采用Molyneux等[24]建立的苦馬豆素Ehrlich’s試劑顯色法，該法具有較高的特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確檢測出樣品中是否含有苦馬豆素[25]。余永濤等[26]、馬堯等[15]先后采用該方法對幾種主要瘋草類植物及其內(nèi)生真菌發(fā)酵液的苦馬豆素含量進(jìn)行了檢測。基于此，本試驗采用薄層色譜法對斜莖黃芪及其優(yōu)勢菌發(fā)酵液中的苦馬豆素進(jìn)行檢測，由薄層色譜結(jié)果可以看出，苦馬豆素標(biāo)品呈紫紅色斑點，Rf值為0.55，而斜莖黃芪及其優(yōu)勢菌株發(fā)酵液樣品中均未觀察到紫紅色斑點，這說明從青海采集的野生型斜莖黃芪不含苦馬豆素，因此可以確定青海的野生斜莖黃芪不屬于瘋草類有毒植物。

此外，有研究表明，同一種植物，因其生長環(huán)境及生長條件的不同，其內(nèi)生真菌種類及分布特性也會存在一定差異[9,21,27]，本試驗結(jié)果提示我們，不同地域生長的斜莖黃芪其內(nèi)生真菌不盡相同，這可能是造成不同地域斜莖黃芪化學(xué)成分不完全相同的主要原因。

4 結(jié)論

從采自青海的野生型斜莖黃芪中共分離26株菌株，經(jīng)過ITS序列分析鑒定，分屬于5綱、5目、7科、7屬，4株未定屬。在斜莖黃芪各組織中，根組織的菌株分離率最高，根和葉所分離的內(nèi)生真菌種類較多，鏈格孢菌屬(Alternariasp.)為其優(yōu)勢菌屬。植物組織和優(yōu)勢菌株發(fā)酵液中均未檢測到苦馬豆素，即青海的野生型斜莖黃芪不屬于瘋草類有毒植物，可以作為優(yōu)良牧草使用。