周濟(jì)源，李海軍, ，張英華，徐波，鄭德強(qiáng), ，唐雙焱

1. 山東福瑞達(dá)生物科技有限公司（臨沂 276700）；2. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司（濟(jì)南 250000）；3. 山東省藥學(xué)科學(xué)院（濟(jì)南 250000）；4. 中國(guó)科學(xué)院微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所（北京 100101）

納他霉素是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯，是一種高效的抗真菌化合物，其作用機(jī)理是納他霉素分子中的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)與真菌細(xì)胞膜中的麥角固醇發(fā)生反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致菌體死亡[1]。與化學(xué)防腐劑相比，濃度較低的納他霉素可以抑制霉菌、酵母的生長(zhǎng)，能夠減少真菌毒素的產(chǎn)生，并且對(duì)產(chǎn)品口感特性沒有任何影響[2]。1982年納他霉素正式被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為食品防腐劑[3]，1997年我國(guó)原衛(wèi)生部將納他霉素納入防腐劑，納他霉素在乳制品、肉類、糕點(diǎn)、水果、飲料等食品工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用[4]，在糧儲(chǔ)、醫(yī)藥方面有著廣闊的前景，隨著人們對(duì)化學(xué)合成食品防腐劑安全性認(rèn)識(shí)的提高，低毒、高效、廣譜及經(jīng)濟(jì)實(shí)用的生物食品防腐劑的研究和開發(fā)，將愈來愈受到人們的關(guān)注。納他霉素是一種廣譜高效的天然生物防腐劑，已被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)療等領(lǐng)域。但是納他霉素的工業(yè)化生產(chǎn)水平不高，成本較高，限制了納他霉素的使用范圍。為了降低納他霉素的生產(chǎn)成本，推廣納他霉素在食品工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用，人們從很多方面做了努力。目前，通過菌株選育和改造[5]，培養(yǎng)基優(yōu)化，發(fā)酵工藝的改進(jìn)，都能夠提高納他霉素的產(chǎn)量，對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，多數(shù)以氮源、碳源、接種量、pH為研究因素，進(jìn)行優(yōu)化，也有一些前體物質(zhì)和誘導(dǎo)子對(duì)納他霉素產(chǎn)量影響的研究[6]。

納他霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的生物合成中，納他霉素中內(nèi)酯環(huán)的形成是以多個(gè)乙酸單位和丙酸單位通過聚合形成的聚酮體，內(nèi)酯環(huán)的結(jié)構(gòu)是通過聚酮體途徑縮合而成，中間需要的一些前體物質(zhì)的主要來源，與氨基酸代謝、脂肪酸循環(huán)和TCA循環(huán)息息相關(guān)[7]，在物質(zhì)的合成和代謝調(diào)控中，是聯(lián)系初級(jí)代謝與次級(jí)代謝的樞紐。真菌的生長(zhǎng)通常需要一些少量的有機(jī)物質(zhì)，其作用一般都是輔酶的成分，對(duì)微生物糖類或者脂肪代謝起到一定的作用[8]，如：葉酸參與脂肪代謝，可降低雞前體脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)沉積[9]；維生素參與氨基酸、胸腺嘧啶等的合成，促進(jìn)蛋白質(zhì)的生成，有研究表明維生素的添加顯著提高了螺旋霉素的產(chǎn)量[10]，維生素和硫辛酸提高了乙酸等前體物質(zhì)的濃度，提高了發(fā)酵過程中乙酰激酶、乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶與乙酰CoA合成酶的酶活性[10]。劉春來等[11]研究發(fā)現(xiàn)微量元素Mn和Ni、維生素、葉酸和煙酸對(duì)蠟蚧輪枝菌分生孢子的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用。試驗(yàn)通過對(duì)抗生素類化合物、維生素類化合物等影響納他霉素產(chǎn)量的一些因素進(jìn)行研究，為提高納他霉素的產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 菌種

褐黃孢鏈霉菌，實(shí)驗(yàn)室活化保藏。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：酵母抽提物6 g/L，蛋白胨6 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.4，115 ℃滅菌30 min備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖70 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母抽提物4.5 g/L，硫酸鎂1 g/L，檸檬酸1 g/L，氯化鈉2 g/L，調(diào)節(jié)pH 7.5，115 ℃滅菌30 min備用。

1.3 儀器與設(shè)備

ME204電子分析天平（METTLER TOLEDO）；ZHJH-C1115B垂直流超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）；ZHWY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；LDZF-75KB-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；500 mL三角瓶（四川蜀玻有限責(zé)任公司）；1200 Series高效液相色譜儀（Agilent Technologies）。

2 方法與結(jié)果

2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：取一管凍存的種子（約1 mL）接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基500 mL三角瓶中，于29 ℃、250 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到1.8～2.2。

發(fā)酵培養(yǎng)：以2%的接種量接種活化好的種子，溫度29 ℃，250 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間96 h，pH不控制，獲得納他霉素發(fā)酵液。

2.2 納他霉素含量的測(cè)定

取發(fā)酵液加入甲醇中，振蕩搖勻，靜置30 min后，離心，取上清液，用HPLC測(cè)定納他霉素的含量。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 抗生素化合物對(duì)納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

分別添加5 mg/L安普霉素、青霉素、氯霉素、萘啶酮酸至原始發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)過發(fā)酵96 h，測(cè)定納他霉素的含量，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照。

抗生素類化合物對(duì)納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響如圖1所示。從圖1可以看出，添加安普霉素、青霉素、萘啶酮酸，可以提高納他霉素的產(chǎn)量，對(duì)納他霉素產(chǎn)量影響最大的是安普霉素，其次是青霉素，再次是萘啶酮酸，添加5 mg/L氯霉素對(duì)納他霉素產(chǎn)量起到了抑制作用，因此選擇添加5 mg/L安普霉素作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 添加不同抗生素對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

添加5，10，15和20 mg/L安普霉素至原始培養(yǎng)基中，經(jīng)過96 h發(fā)酵，測(cè)定納他霉素的含量，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照。

安普霉素對(duì)納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響如圖2所示。從圖2可以看出，添加5，10，15和20 mg/L安普霉素都可以提高納他霉素的產(chǎn)量，添加5 mg/L安普霉素使納他霉素產(chǎn)量提高最大，使納他霉素產(chǎn)量提高了13.24%，因此選擇添加5 mg/L安普霉素作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.2 維生素化合物對(duì)納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入50 mg/L維生素B2、維生素A、葉酸、煙酸，經(jīng)過96 h發(fā)酵，測(cè)定納他霉素的含量，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照。

維生素類化合物對(duì)納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響如圖3所示。從圖3可以看出，添加50 mg/L維生素B2、維生素A、葉酸、煙酸均可以提高納他霉素的產(chǎn)量，煙酸對(duì)納他霉素產(chǎn)量影響最大，其次是維生素B2，葉酸、維生素A對(duì)納他霉素產(chǎn)量影響不大，添加50 mg/L煙酸使納他霉素產(chǎn)量提高了15.23%，達(dá)到了8.85 g/L，因此選擇添加煙酸作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 添加不同維生素對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

添加10，20，30，40，50和60 mg/L煙酸至原始培養(yǎng)基中，經(jīng)過96 h發(fā)酵，測(cè)定納他霉素的含量，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照。

不同質(zhì)量濃度的煙酸對(duì)納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響如圖4所示。從圖4可以看出，添加10，20，30，40，50和60 mg/L煙酸均可以提高納他霉素的產(chǎn)量，添加20 mg/L煙酸使納他霉素產(chǎn)量提高了20.74%，達(dá)到最高，因此選擇添加20 mg/L煙酸作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 添加不同質(zhì)量濃度煙酸對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

添加20，60，100和140 mg/L維生素B2至原始培養(yǎng)基中，經(jīng)過96 h發(fā)酵，測(cè)定納他霉素的含量，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照。

維生素B2對(duì)納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響如圖5所示。從圖5可以看出，添加20，60，100和140 mg/L維生素B2均可以提高納他霉素的產(chǎn)量，添加100 mg/L維生素B2使納他霉素產(chǎn)量提高了17.6%，因此選擇添加100 mg/L維生素B2作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖5 添加不同質(zhì)量濃度維生素B2對(duì)納他霉素產(chǎn)量的影響

2.3.3 維生素和抗生素組合對(duì)納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量的影響

根據(jù)初篩結(jié)果，最終選擇以安普霉素、煙酸、維生素B2為基本組合進(jìn)行進(jìn)一步篩選，以安普霉素、煙酸、維生素B2為篩選因子，每個(gè)因子設(shè)置三個(gè)水平，安普霉素設(shè)2，5和8 mg/L三個(gè)水平，煙酸設(shè)15，20和25 mg/L三個(gè)水平，維生素B2設(shè)80，100和120 mg/L三個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

篩選結(jié)果如表1所示，未添加抗生素維生素組合的對(duì)照組納他霉素產(chǎn)量為7.69 g/L，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，安普霉素對(duì)納他霉素產(chǎn)量影響最大，維生素B2影響次之，煙酸對(duì)納他霉素產(chǎn)量影響最小，理論最優(yōu)水平組合為5 mg/L安普霉素、15 mg/L煙酸和120 mg/L維生素B2，實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果為添加5 mg/L安普霉素、15 mg/L煙酸和100 mg/L維生素B2納他霉素產(chǎn)量最高，理論最優(yōu)水平與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)水平不一致，可能是正交試驗(yàn)條件限制，水平較少，或者各影響因素有明顯交互作用，因此此次以實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果作為依據(jù)，選擇5 mg/L安普霉素、15 mg/L煙酸和100 mg/L維生素B2作為最優(yōu)水平，即選擇5 mg/L安普霉素，15 mg/L煙酸，100 mg/L維生素B2作為培養(yǎng)基組分。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3 結(jié)論

納他霉素是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，納他霉素是通過醋酸-丙二酸途徑生物合成的，其合成途徑可以分解為大環(huán)內(nèi)酯的生物合成、芳香部分的來源和氨基糖的形成。添加維生素和抗生素組合會(huì)增加有機(jī)酸的濃度，進(jìn)而增加乙酸和丙酸的濃度，有利于內(nèi)酯環(huán)的形成，進(jìn)一步促進(jìn)了菌體的代謝，加大了三羧酸循環(huán)通量，菌體生長(zhǎng)加快，增加了大環(huán)內(nèi)酯合成的前體量，從而提高了產(chǎn)物的產(chǎn)量。維生素提升乙酰激酶體系酶活也有利于增加納他霉素產(chǎn)量。研究以納他霉素?fù)u瓶發(fā)酵為基礎(chǔ)，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)過篩選，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5 mg/L安普霉素，可使納他霉素產(chǎn)量提高13.24%，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20 mg/L煙酸可使納他霉素產(chǎn)量提高20.74%，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100 mg/L維生素B2可使納他霉素產(chǎn)量提高17.6%。以安普霉素、煙酸、維生素B2為基本組合進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選結(jié)果選擇5 mg/L安普霉素、15 mg/L煙酸、100 mg/L維生素B2組合作為培養(yǎng)基組分。此研究結(jié)果為納他霉素的產(chǎn)量提高提出了有效的途徑。