李 杰 趙夢(mèng)洋 賴夢(mèng)雨 宋銀娟 張茜茜 梁正敏 楊東明 王元智 李志萍 屈孟錦 董玉慧 王浩然 劉一朵 關(guān)芷玲 姚 嬌 孫芷馨 陳玉蘭 葛 昕王冬冬 高虹麗 陳 森 趙化芬 李 雯 趙德明 周向梅 楊利峰
(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 國(guó)家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)
科學(xué)技術(shù)是第一生產(chǎn)力,隨著國(guó)家大力發(fā)展科學(xué)技術(shù),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)作為科學(xué)技術(shù)的重要組成部分取得了高速發(fā)展。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的抽查檢驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主管部門綜合應(yīng)用抽查和檢驗(yàn)兩種方式評(píng)價(jià)、判斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的行政行為。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特殊性決定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抽查檢驗(yàn)的專業(yè)性、技術(shù)性和法定性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)制度對(duì)全面了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量總體水平做出科學(xué)的評(píng)估,及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量存在的問(wèn)題,采取有效措施,強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理與安全意識(shí),保障和維護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)穩(wěn)定進(jìn)行發(fā)揮了重要作用[1]。
病理學(xué)診斷一直被認(rèn)為是準(zhǔn)確率高于其他檢查手段的“金標(biāo)準(zhǔn)”。應(yīng)用傳統(tǒng)病理學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)與檢測(cè),不但為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量評(píng)價(jià)提出可靠準(zhǔn)確的依據(jù),還有助于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)科研究領(lǐng)域和生產(chǎn)實(shí)踐的合理、良好、科學(xué)的發(fā)展,也是對(duì)病理學(xué)全面發(fā)展的詮釋。兩門學(xué)科可互相促進(jìn),共同進(jìn)步[2]。本研究擬對(duì)北京20多家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育機(jī)構(gòu)2020 年兩次送檢的750 只嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié),一方面對(duì)北京市嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量總體水平做出科學(xué)評(píng)估,及時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量存在的問(wèn)題,從而為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生產(chǎn)、管理和改進(jìn)提供參考。另一方面強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理與安全意識(shí),保障和維護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)穩(wěn)定。
2020 年5月份和10月份,由中國(guó)食品藥品檢定研究院從北京市20多家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位總共抽取750只SPF 級(jí)、清潔級(jí)的小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和普通級(jí)豚鼠4種實(shí)驗(yàn)用鼠進(jìn)行調(diào)查和分析,具體情況見(jiàn)表1。
表1 2020年抽查的750只嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采樣情況Table 1 Classification of 750 rodent samples in 2020
1.2.1組織切片的制備和觀察:CO2安樂(lè)死動(dòng)物,迅速采集動(dòng)物的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、小腸和大腸。經(jīng)甲醛鈣液(10%甲醛+ 1%氯化鈣)固定后按常規(guī)方法制作石蠟切片,HE染色,OLYMPUSU-SRG數(shù)碼顯微鏡觀察,采集圖像,記錄結(jié)果。
1.2.2肝臟油紅O染色:對(duì)HE染色觀察中有中度及以上細(xì)胞腫脹的肝臟樣品,抽取部分樣品進(jìn)行油紅O染色。主要步驟為: 組織塊用甲醛鈣液(10%甲醛+ 1% 氯化鈣) 固定一周,肝臟組織制作冰凍切片,油紅O染色,甘油明膠封片后顯微鏡下觀察并采圖。
1.2.3肝臟PAS染色:同時(shí)對(duì)HE染色觀察出現(xiàn)中度及以上細(xì)胞腫脹的肝臟樣品進(jìn)行PAS染色。主要步驟為: 甲醛鈣液固定,制作肝組織石蠟切片,高碘酸氧化,Schiff氏試劑染色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,甘油明膠封片后顯微鏡下觀察并采圖。
共取樣360只,其中SPF級(jí)320只,清潔級(jí)40只。結(jié)果顯示,5例SPF級(jí)NPG小鼠、4例SPF級(jí)C57小鼠和10例SPF級(jí)ICR小鼠脾臟表現(xiàn)出彌漫性白髓細(xì)胞減少,髓外造血增加;2例SPF級(jí)C57小鼠表現(xiàn)出脾臟輕度出血,含鐵血黃素沉著;1例SPF級(jí)BALB/c小鼠心臟表現(xiàn)出心外膜鈣化;1例SPF級(jí)BALB/c小鼠心臟表現(xiàn)出心外膜炎;1例SPF級(jí)ICR小鼠在大腸腸腔中發(fā)現(xiàn)了寄生蟲(chóng)感染;1例清潔級(jí)C57小鼠小腸表現(xiàn)出慢性增生性腸炎;1例SPF級(jí)NIH小鼠腎臟表現(xiàn)出局灶性間質(zhì)性腎炎;2例SPF級(jí)KM小鼠肝臟表現(xiàn)出肝細(xì)胞腫脹,其中1例經(jīng)特殊染色證實(shí)為肝細(xì)胞脂肪變性;1例清潔級(jí)ICR小鼠肝臟表現(xiàn)出肝細(xì)胞腫脹,經(jīng)特殊染色證實(shí)油紅O染色與PAS染色均為陰性。其余各組織臟器未見(jiàn)明顯病理變化。
2.1.1脾臟病變:與正常脾臟(圖1A)相比,脾臟輕度出血在紅髓中可見(jiàn)棕褐色含鐵血黃素沉積(圖1B); 脾臟彌漫性白髓細(xì)胞減少,髓外造血增加,紅髓與白髓界限不清,白髓顯著減少,巨噬細(xì)胞呈彌漫性增多(圖1C)。
圖1 小鼠脾臟組織病變情況注: A.正常脾臟; B. 脾臟輕度出血; C. 脾臟彌漫性白髓細(xì)胞減少,髓外造血增加;A、B、C為HE染色(× 400) Fig.1 Pathological changes in mouse spleens tissueNote: A. Normal spleen; B. Spleen slight bleeding; C. Spleen diffuse white medullary cell decrease and extramedullary hematopoietic increase; A, B, and C were HE staining (× 400)
2.1.2心臟病變:與正常心臟相比(圖2A),心外膜炎可見(jiàn)心外膜增厚,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2B);心外膜鈣化可見(jiàn)心外膜增厚,其內(nèi)可見(jiàn)大量嗜堿性藍(lán)染顆粒狀成分,為大量鈣鹽沉著(圖2C)。
圖2 小鼠心臟組織病變情況注: A.正常心臟;B.心外膜炎;C.心外膜鈣化;A、B、C為HE染色(× 400)Fig.2 Pathological changes in mouse heart tissuesNote: A. Normal heart; B. Epicardial inflammation; C. Epicardial calcification; A, B, C were HE staining (× 400)
2.1.3腸道病變:與正常腸道(圖3A、C)相比,病變大腸腸腔中可見(jiàn)寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體(圖3B); 慢性增生性腸炎可見(jiàn)黏膜下層增厚,較多漿細(xì)胞浸潤(rùn),腸腺萎縮(圖3D)。
圖3 小鼠腸道組織病變情況注: A.正常直腸;B.大腸寄生蟲(chóng)感染;C.正常小腸;D.小腸慢性增生性腸炎;A、B、C、D為HE染色(×400)Fig.3 Pathological changes in mouse intestinal tissuesNote: A. Normal rectal; B. Rectal parasitic infection; C. Normal duodenum; D. Chronic proliferative; A, B, C and D were HE staining(×400)
2.1.4腎臟病變:與正常腎臟(圖4A)相比 ,腎臟間質(zhì)出現(xiàn)局灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4B)。
圖4 小鼠腎臟組織病變情況注: A.正常腎臟;B.間質(zhì)性腎炎;A、B為HE染色(× 100) Fig.4 Pathological changes in mouse kidney tissuesNote: A. Normal kidney; B. Interstitial nephritis;A and B were HE staining (×100)
2.1.5肝臟病變:與正常肝臟(圖5A)相比,肝細(xì)胞腫脹可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰,未見(jiàn)明顯肝索結(jié)構(gòu),肝細(xì)胞體積變大,胞質(zhì)中有不同程度的空泡出現(xiàn)(圖5B) ; 對(duì)肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行PAS染色(圖5C)和油紅O 染色(圖5D),顯示肝臟脂肪變性,可見(jiàn)較多紅色大小不一的圓形小滴分布在肝細(xì)胞胞漿中,有的圍繞在細(xì)胞核周圍,有的聚集呈大脂滴(圖5D) 。
圖5 小鼠肝臟組織病變情況注: A.正常肝臟;B.肝細(xì)胞腫脹; C.肝臟PAS染色陰性; D.肝臟脂肪變性;A、B為HE染色(× 400);C為PAS染色(× 400);D 為油紅O 染色陽(yáng)性(×1 000)Fig.5 Pathological changes in mouse liver tissuesNote: A. Normal liver; B. Hepatocellular swelling; C. Liver PAS staining was negative;D. Hepatic steatosis; A, B were HE staining (× 400);C was PAS staining (×400); D was Oil Red-O staining positive (× 1 000)
共取樣160只,其中SPF級(jí)140只,清潔級(jí)20只。有15例脾臟表現(xiàn)為彌漫性白髓細(xì)胞減少,髓外造血增加;3例肝臟表現(xiàn)出肝細(xì)胞腫脹,經(jīng)特殊染色確定1例為肝細(xì)胞糖原沉積。其余各組織臟器未見(jiàn)明顯病理變化。
2.2.1脾臟病變:與正常脾臟相比(圖6A),脾臟彌漫性白髓細(xì)胞減少,髓外造血增加,紅髓與白髓界限不清,白髓顯著減少,巨噬細(xì)胞呈彌漫性增多(圖6B)。
圖6 大鼠脾臟組織病變情況注: A.正常脾臟;B.脾臟彌漫性白髓細(xì)胞減少,髓外造血增加;A、B為HE染色(×400)Fig.6 Pathological changes of in rats spleens tissuesNote: A. Normal spleen; B. Spleen diffuse white medullary cell decrease and extramedullary hematopoietic increase;A, B were HE staining (×400)
2.2.2肝臟病變:與正常肝臟(圖7A)相比, 肝細(xì)胞腫脹可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰,未見(jiàn)明顯肝索結(jié)構(gòu),肝細(xì)胞體積變大,胞質(zhì)中有不同程度的空泡出現(xiàn)(圖7B);對(duì)肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行油紅O 染色(圖7C)和 PAS染色(圖7D) ,顯示肝細(xì)胞胞漿呈均質(zhì)淡粉色,其中可見(jiàn)紫紅染色的糖原顆粒(圖7D) 。
圖7 大鼠肝臟組織病變情況注: A. 正常肝臟;B. 肝細(xì)胞腫脹;C. 油紅O 染色陰性;D. 肝臟PAS染色陽(yáng)性;A、B為HE染色(×400);C為油紅O 染色陰性(×1 000);D為PAS染色陽(yáng)性(×400);Fig.7 Pathological changes in rats liver tissuesNote: A. Normal liver; B. Hepatocellular swelling; C. Liver Oil red O staining was negative; D. Liver PAS staining was positive;A, B were HE staining (× 400);C was Oil Red-O staining negative (× 1 000);D was PAS staining positive(×400)
共取樣210只,其中SPF級(jí)30只,清潔級(jí)20只,普通級(jí)160只。異常主要集中在普通級(jí)豚鼠的肺臟,肝臟和小腸。15例間質(zhì)性肺炎,其中兩只豚鼠同時(shí)表現(xiàn)出肝臟膽管上皮增生;13例肝臟細(xì)胞胞質(zhì)中有大小不一的空泡,進(jìn)行油紅O及PAS染色,結(jié)果為6例油O染色陽(yáng)性,2例PAS染色陽(yáng)性;5例小腸固有層含鐵血黃素沉積。在SPF級(jí)豚鼠中發(fā)現(xiàn)1例肉芽腫性肺炎。其余各組織臟器未見(jiàn)明顯病理變化。
2.3.1肺臟病變:與正常肺相比(圖8A), 間質(zhì)性肺炎的肺泡壁局部增寬,增寬區(qū)域肺泡結(jié)構(gòu)消失,在增生的區(qū)域及支氣管、血管周圍可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),鄰近區(qū)域可見(jiàn)局部肺泡代償性增大(圖8B)。肉芽腫性肺炎可見(jiàn)肺臟局部出現(xiàn)增生的區(qū)域有大量淋巴細(xì)胞,巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并可見(jiàn)少量的多核巨細(xì)胞(圖8C,D)。
2.3.2肝臟病變:與正常肝臟(圖9A)相比,肝細(xì)胞腫脹可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰,未見(jiàn)明顯肝索結(jié)構(gòu),肝細(xì)胞體積變大,胞質(zhì)中有不同程度的空泡出現(xiàn)(圖9B);對(duì)肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行油紅O 染色(圖9C)和 PAS染色(圖9D),可見(jiàn)胞漿中大小不一的圓形紅染脂滴(圖9C),肝細(xì)胞胞質(zhì)呈均質(zhì)淡粉色,其中可見(jiàn)紫紅染色的糖原顆粒(圖9D)。膽管上皮增生可見(jiàn)肝小葉間及匯管區(qū)膽管上皮增生,上皮呈團(tuán)塊狀生長(zhǎng),不形成管腔(圖9E)。
圖9 豚鼠肝臟組織病變情況注: A. 正常肝臟;B. 肝細(xì)胞腫脹;C. 油紅O 染色陽(yáng)性;D. 肝臟PAS染色陽(yáng)性;E. 膽管上皮增生;A、B、E為HE染色(× 400);C為油紅O染色陽(yáng)性(× 1 000);D為PAS染色陽(yáng)性(× 400)Fig.9 Pathological changes of livers in guinea pigsNote: A. Normal liver; B. Hepatocellular swelling; C. Liver Oil red O staining was positive; D. Liver PAS staining was positive;E. Hyperplasia of bile duct epithelium; A, B, E were HE staining (×400); C was Oil Red-O staining positive (×1 000) ;D was PAS staining positive (×400)
2.3.3腸道病變:與正常小腸(圖10A)相比,小腸陳舊性出血可見(jiàn)腸絨毛固有層有數(shù)量不等的呈棕紅色的含鐵血黃素沉積(圖10B)。
圖10 豚鼠腸道組織病變情況注: A.正常十二指腸;B.十二指腸陳舊性出血;A、B為HE染色(×400)Fig.10 Pathological changes in guinea pig intestinal tissuesNote: A. Normal rectal; B. Chronic duodenal hemorrhag (× 400);A, B were HE staining (×400)
共取樣清潔級(jí)地鼠20只。被檢地鼠中可見(jiàn)3例肝細(xì)胞腫脹,經(jīng)特殊染色確定其中1例為糖原沉積,其余各組織臟器未見(jiàn)明顯病理變化。地鼠基本合格。
與正常肝臟(圖11A)相比,肝細(xì)胞腫脹可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰,未見(jiàn)明顯肝索結(jié)構(gòu),肝細(xì)胞體積變大,胞質(zhì)中有不同程度的空泡出現(xiàn)(圖11B);對(duì)肝細(xì)胞腫脹的樣本進(jìn)行油紅O 染色(圖11C)和 PAS染色(圖11 D),其中可見(jiàn)紫紅染色的糖原顆粒(圖11D)。
圖11 地鼠肝臟組織病變情況注: A.正常肝臟;B. 肝細(xì)胞腫脹;C. 油紅O 染色陰性;D. 肝臟PAS染色陽(yáng)性;A、B為HE染色(× 400);C為油紅O 染色陰性(×1 000);D為PAS染色陽(yáng)性(× 400)Fig.11 Pathological changes in hamster liver tissuesNote: A. Normal liver; B. Hepatocellular swelling; C. Liver Oil red O staining was negative; D. Liver PAS staining was positive;A, B was HE staining (× 400); C was Oil Red-O staining negative (×1 000); D was PAS staining positive (× 400)
本次抽查檢驗(yàn)北京市嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理變化顯示,大多數(shù)送檢的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本健康。但來(lái)自于不同公司的SPF級(jí)小鼠和大鼠的脾臟均表現(xiàn)出彌漫性白髓細(xì)胞減少、髓外造血增加;普通級(jí)豚鼠普遍表現(xiàn)出間質(zhì)性肺炎。所有品種及不同級(jí)別的鼠肝臟出現(xiàn)個(gè)別腫脹、空泡化,但經(jīng)特殊染色觀察,僅有少數(shù)為脂肪變性、糖原沉積。其余不同級(jí)別鼠的臟器僅個(gè)別出現(xiàn)病理變化。如:心外膜炎、心外膜鈣化;直腸寄生蟲(chóng)感染;十二指腸慢性增生性腸炎,陳舊性出血;腎臟間質(zhì)性腎炎。
在取樣小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠中均出現(xiàn)個(gè)別肝細(xì)胞腫脹、空泡化。近10年肝細(xì)胞脂肪變性,肝細(xì)胞腫脹,炎性反應(yīng),壞死比較明顯[3-12],但呈現(xiàn)逐年下降趨勢(shì)[10],說(shuō)明北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制逐漸標(biāo)準(zhǔn)化。2020年嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟并沒(méi)有表現(xiàn)出其他病理變化,如炎性反應(yīng)、壞死、變性等,排除了肝臟毒性損傷。進(jìn)行特殊染色處理,僅有極少數(shù)為脂肪變性、糖原沉積,可能造成的原因?yàn)椋孩龠\(yùn)輸、處死過(guò)程中的應(yīng)激以及部分組織臟器的自溶;②與飼料、飼喂管理方式(飲食、維生素A過(guò)量等)以及動(dòng)物個(gè)體差異有關(guān),導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)紊亂[13]。因此,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的繁育過(guò)程中,飼料應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)的原料、合理恒定的配方及適宜的滅菌方法,動(dòng)物飲水也應(yīng)使用滅菌的自來(lái)水[14]。
分別來(lái)自不同單位的34例SPF級(jí)小鼠和大鼠脾臟表現(xiàn)出彌漫性白髓細(xì)胞減少、髓外造血增加。白髓細(xì)胞數(shù)量減少可能是由于衰老、應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)不良、毒素、自身免疫、放射、感染或其他部位的腫瘤引起的??赡苁且?yàn)楸粰z測(cè)鼠長(zhǎng)期接觸某些毒物或者病原微生物(細(xì)菌或病毒)引起脾臟濾泡萎縮,濾泡內(nèi)淋巴細(xì)胞凋亡、壞死,淋巴細(xì)胞生成減少。隨著時(shí)間推移,生發(fā)中心和濾泡消失,最終導(dǎo)致脾臟全部淋巴組織數(shù)量減少。這些因素還會(huì)引起脾臟紅髓巨噬細(xì)胞增多,髓外造血增加。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育公司可以排查飼料、墊料中是否有毒素的存在。
普通級(jí)豚鼠肺臟普遍表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎,其中2例同時(shí)表現(xiàn)出肝臟膽管上皮增生,可能與寄生蟲(chóng)感染或者其他刺激因素有關(guān)。肺臟病變可能與墊料質(zhì)量不達(dá)標(biāo)或飼養(yǎng)密度過(guò)大有關(guān),劣質(zhì)的墊料碎屑及塵埃較多,極易造成異物刺激引發(fā)動(dòng)物肺部炎癥;飼養(yǎng)密度過(guò)大、溫濕度不適、通風(fēng)不良和飼養(yǎng)員清理不及時(shí),室內(nèi)臭味和氨濃度升高容易誘發(fā)氣管炎、肺炎等。因而,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)過(guò)程中需要注意飼養(yǎng)環(huán)境的空氣情況、飼養(yǎng)密度以及通風(fēng)情況等。選用符合標(biāo)準(zhǔn)的墊料,盡量減少室內(nèi)墊料碎屑、臭味和氨味等對(duì)動(dòng)物呼吸道的刺激。
其余臟器(如心臟、腎臟、大腸、小腸)僅有1例或極少數(shù)出現(xiàn)病變。SPF級(jí)小鼠大腸出現(xiàn)寄生蟲(chóng)感染,說(shuō)明飼養(yǎng)環(huán)境需要進(jìn)一步檢查完善。其他臟器的病變可能與飼料、飼喂管理方式以及動(dòng)物個(gè)體差異有關(guān)。另外,運(yùn)輸、處死過(guò)程中的應(yīng)激以及部分組織臟器的自溶可能對(duì)病理學(xué)檢查結(jié)果都會(huì)產(chǎn)生一定影響。
基于以上結(jié)果認(rèn)為,雖然大多數(shù)送檢實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本健康,但嚙齒類不同級(jí)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同臟器出現(xiàn)不同程度的組織病理學(xué)損傷。雖然有的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合國(guó)家微生物學(xué)等標(biāo)準(zhǔn),但仍有部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于亞健康狀態(tài)。因此,病理學(xué)監(jiān)測(cè)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量評(píng)價(jià)中有著不可替代的重要作用。通過(guò)病理學(xué)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況對(duì)于更好地保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利和保證科學(xué)研究結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性具有重要的意義。