徐柏郁, 池紅井, 劉金霞

(1.承德醫(yī)學院, 河北 承德 067000 2.河北省承德市衛(wèi)健委信息中心, 河北 承德 067000 3.廣東省深圳市南山區(qū)婦幼保健院, 廣東 深圳 518000)

干擾素-α和干擾素β常常用于抗病毒、抗腫瘤甚至多發(fā)性硬化等常見疾病，治療效果顯著，但不良反應也比較多，特別是長期應用，可導致神經精神異常，發(fā)生焦慮、抑郁甚至有自殺傾向，常常被迫停藥，用藥中斷，影響療效。因此，探討IFN-α誘發(fā)抑郁癥發(fā)生機制是臨床亟需解決問題。本文選擇IFN-α皮下注射，制備抑郁癥模型，并與傳統(tǒng)的孤養(yǎng)兼不可預測因素誘導大鼠抑郁癥模型(CUMS)方法制備的模型進行比對，探討干擾素誘發(fā)抑郁癥發(fā)生機制和病理學基礎，為臨床抑郁癥的防治提供一條新策略。

1 材料與方法

1.1動物分組和給藥:選擇健康雌性成年大鼠30只，體重(200±20)g，(8±10)周齡(河北醫(yī)科大學實驗動物中心)。在SPF級動物實驗室適應性飼養(yǎng)1周。開始實驗前所有大鼠測量體指數，首先經過曠場實驗、糖水偏好實驗結果、新環(huán)境進食抑制時間測定等行為學實驗進行篩選。剔除糖水偏好率小于50%、曠場實驗積分值小于30或大于120、新環(huán)境抑制進食時間積分大于1min或者小于5min大鼠。每籠3只飼養(yǎng)，1周內不進行任何干預。對符合上述條件的大鼠采取隨機數字法分為干擾素組、模型組和正常對照組，各10只。干擾素組應用IFN-α皮下注射，劑量為36μg/kg，每周一次，給藥時間12周[1]。模型組給予各種慢性不可預知溫和應激(CUMS)，即孤養(yǎng)聯合CUMS造模。以7d為1個周期，每天接受1不同種刺激，主要包括：夾尾1min，間隔10min，連續(xù)10次；禁水24h；晃尾1次/s，晃尾15min；4℃冰水游泳5min；禁食24h；晝夜顛倒12h；1mA電擊足底10s，間隔1min，30次；循環(huán)往復，至第12周[2]。對照組皮下注射等體積生理鹽水，方法、劑量和時間同干擾素組。

1.2行為學檢測

1.2.1體重檢測:給藥前、給藥后第4周、8周和12周不同時間點測定各組大鼠體重指數。

1.2.2曠場實驗:在給藥前、給藥后第4周、8周和12周分別進行曠場實驗測試，時間為5min[3]。

1.2.3糖水偏好實驗:在給藥前、給藥后第4周、8周和12周，大鼠禁水24h后，分別同時給予1%蔗糖水和純凈水200mL，各一瓶，觀察時間24h后，記錄并按下列公式計算動物的糖水偏好率。糖水偏好率(%)=糖水消耗總量/(純凈水消耗總量+糖水消耗總量)×100%[4]。

1.2.4新環(huán)境抑制進食實驗:每次測試前，禁食24h，然后在曠場中心放置少量食物。曠場上方安裝視頻攝像頭，分別將大鼠從任意的角度放在曠場中，記錄大鼠整個進食過程，特別是大鼠接近并進食第一口食物的時間[5]。分別在給藥前和給藥后第4周、8周和12周完成測試。

1.3腦組織標本取材:利用腹腔注射10%的水合氯醛，40mg/kg，進行大鼠麻醉，將其仰臥位固定在大鼠解剖臺，剪開胸腔，心臟充分暴露后，剪開右心耳，將灌注針迅速插入并固定在左心室。0.9%滅菌鹽水快速灌流約10min以上，將血液盡可能沖洗干凈。檢查待大鼠肝臟，發(fā)現血色褪去且發(fā)黃后，再用4%多聚甲醛溶液完成灌流和固定。注意先快速灌注2min，然后緩慢灌持續(xù)30min，停止灌注后，斷頭并快速剝離腦組織海馬區(qū)，標記后小心放入事先存放4%多聚甲醛溶液的包埋盒內固定48h。

1.4HE染色:將上述大鼠海馬區(qū)組織進行石蠟包埋，組織切片，厚度不超過5μm。經過二甲苯透明和酒精洗脫等系列步驟，蘇木素-伊紅染色后封片，顯微鏡下觀察結果。

1.5硫瑾染色:上述標本經過二甲苯透明和酒精洗脫等系列步驟，采用0.2%硫瑾60℃水浴染色，持續(xù)30～60min后，封片，顯微鏡下觀察結果。

1.6免疫組化檢測大鼠海馬組織5-HTA2R的變化:將大鼠海馬組織在4%多聚甲醛液中固定后，制備成病理石蠟塊，連續(xù)切成厚度約為4μm的組織切片，進行免疫組織化學染色。切片經二甲苯與梯度乙醇脫蠟復水，加入3% H2O2置于室溫下孵育10min，然后，放入4℃枸櫞酸鹽緩沖液，使用微波爐通過高溫完成抗原修復，待其自然冷卻。然后，在切片上加入鼠抗LGR5單克隆抗體(1∶200)，在4℃下孵育過夜。第2天棄去一抗，PBS清洗后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)，室溫下孵育1h，PBS沖洗，加入DAB顯色液進行顯色。純凈水沖洗，蘇木精復染，鹽酸乙醇溶液分化，再經過脫水與透明，用蓋玻片和中性樹膠封片。在顯微鏡放大400倍，光學下觀察實驗結果，發(fā)現胞質著色成棕黃色至褐色即為陽性細胞，隨機選擇鏡下5個視野，記錄并計算陽性細胞數占視野內所有細胞數的百分比。

2 結 果

2.1兩組大鼠體重和行為學情況:隨著喂養(yǎng)時間的延長，對照組大鼠體重逐漸增加；糖鹽水偏好實驗、曠場試驗以及新環(huán)境抑制進食時間無明顯改變，各時間點比較，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；模型組和干擾素組，隨著干預措施持續(xù)時間延長，大鼠體重、糖水偏愛性實驗以及曠場實驗評分積分逐漸減少，新環(huán)境抑制進食時間逐漸延長，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與對照組比較，干擾素組和模型組在大鼠體重和各項行為學實驗積分等有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與模型組比較，干擾素組新環(huán)境抑制進食時間逐漸延長更顯著，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但大鼠體重變化、曠場試驗積分以及糖水偏愛性實驗結果無統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠體重和行為學變化

2.2兩組大鼠大腦海馬組織形態(tài)學變化

2.2.1HE染色:正常組大鼠海馬細胞數量多，密度較大，細胞層數多，排列較整齊和緊密，細胞結構完整，胞漿飽滿，核仁清晰可見。模型組有明顯損傷征象，其細胞數量減少，細胞間隙變大，細胞層數少，稀疏且排列紊亂和結構不完整，多呈萎縮狀態(tài)，部分細胞出現空泡化，細胞核變小、固縮，少數細胞有核腫脹、淡染、碎裂，甚至脫失，呈現出嗜酸性染色；干擾素組域模型組類似，見圖2。

圖2 大鼠海馬組織HE染色結果

2.2.2硫瑾染色:硫瑾染色后，觀察海馬CAl區(qū)遲發(fā)性神經元存活情況，其中核大而圓且核仁明顯者為存活神經元。在光學顯微鏡下，海馬CAl區(qū)組織學改變正常組無神經元死亡，核仁清晰可見，排列整齊；模型組神經元散在排列，細胞邊界不清，核仁淡染，活細胞數量減少，干擾素組的變化較模型組更顯著，見圖3。

圖3 大鼠海馬組織硫瑾染色

2.3兩組大鼠海馬組織5-HTA2R表達情況:免疫組織化學檢測發(fā)現，5-HTA2R陽性細胞主要集中在海馬CAl區(qū)。5-HTA2R陽性表達部位細胞質，胞核為陰性。與正常組比較，干擾素組海馬CAl區(qū)5-HTA2R陽性表達的神經元減少，光密度減低，差異有顯著性(71.6%vs56.3%,χ2=4.85 P<0.05)，與模型對照組比較，海馬CAl區(qū)5-HTA2R陽性表達的神經元略有減少，但無統(tǒng)計學差異(52.6%vs56.3%,χ2=0.32 P>0.05)，見圖4。

圖4 大鼠海馬組織5-HTA2R免疫組化染色結果

3 討 論

在臨床上，慢性病毒性肝炎、腫瘤以及多發(fā)性硬化等慢性病，需要長期使用干擾素，作為主要治療手段，發(fā)揮免疫調節(jié)和抗病毒作用。然而，常常因為干擾素誘發(fā)的神經精神類不良反應，出現情緒低落、焦慮、睡眠不好、厭食、記憶力減退等抑郁樣癥狀甚至有自殺傾向等抑郁癥表現，被迫停藥[6,7]。干擾素作為炎癥因子，可能Th1/Th2細胞因子失衡[8]，神經內分泌異常、最終引起單胺類神經遞質攝入和受體表達水平降低或敏感性降低[9]，出現抑郁癥狀，單胺類神經遞質攝入和受體表達水平降低或敏感性降低是抑郁癥發(fā)病主要機制[10]。本文通過檢測干擾素導致抑郁癥大鼠行為學和A1區(qū)形態(tài)學以及單胺類遞質受體表達水平的免疫組織化學指標，并與傳統(tǒng)抑郁癥模型，即孤養(yǎng)兼不可預測因素誘導大鼠抑郁癥模型(CUMS)進行對照研究，發(fā)現兩種方法制備的大鼠抑郁癥模型在大鼠體重變化、曠場實驗積分、糖鹽水實驗和新環(huán)境抑制進食時間等行為學指標以及海馬A1區(qū)組織學變化就有一致性，且與正常對照組比較，海馬CAl區(qū)5-HTA2R受體表達水平均出現顯著降低，二者之間沒有統(tǒng)計學差異。因此，利用干擾素皮下注射導致抑郁癥，能夠成為抑郁癥模型制備的新策略，并為抑郁癥在炎癥、內分泌和神經遞質之間的相互關系的研究提供理論指導。