梁先長 鄧艷芹 田晟 程甲 吳天驕

（湘西自治州疾病預(yù)防控制中心 湖南 吉首 416000）

1 前言

肌酐是一種低分子量的含氮化合物，是磷酸肌酸通過脫磷酸基閉合成環(huán)的內(nèi)脫水物[1]，臨床上主要檢測血肌酐和尿肌酐。血中肌酐濃度主要與腎小球?yàn)V過率相關(guān)，故血清肌酐的測定是常規(guī)腎功能試驗(yàn)之一，對于嚴(yán)重腎小球病變引起的腎功能不全、腎炎、尿毒癥等的診斷具有重要意義[2]。尿肌酐的排出量能反映身體肌肉質(zhì)量[3]，粗略判斷24 h尿液收集的完整性[4]，還能夠評估人群的蛋白質(zhì)營養(yǎng)情況[5]。由于尿肌酐的排泄量穩(wěn)定，有研究人員推薦采用尿肌酐濃度校正其他檢測值[6]，郭曉慧[7]提出將24 h尿碘排出量的肌酐校正值作為評價學(xué)齡兒童個體和人群碘攝入量的指標(biāo)。在尿液污染物、重金屬研究[8]及估算尿液中農(nóng)藥等環(huán)境有害物質(zhì)[9-10]，以及職業(yè)性汞中毒[11]和鎘中毒[12]診斷標(biāo)準(zhǔn)中，都用到尿肌酐含量校正。

目前，測定尿肌酐的方法有苦味酸分光光度法[13]和反相高效液相法[14]。苦味酸分光光度法成本低廉、操作簡便，最常用的現(xiàn)場測定方法，但是線性范圍較?。?～1.0 g/L），而《職業(yè)性鎘中毒的診斷》中明確規(guī)定對肌酐濃度小于0.3 g/L或大于3.0 g/L的尿樣應(yīng)重新留取尿樣檢測[12]，故需對部分樣品進(jìn)行稀釋和二次測定，導(dǎo)致工作量增加。本文通過考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、苦味酸加入量對尿中肌酐檢測的影響，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種檢測范圍廣、快速準(zhǔn)確的尿中肌酐檢測方法，以期為標(biāo)準(zhǔn)方法的更新提供參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

尿樣（湘西州職防所）；鹽酸、氫氧化鈉、2，4，6-三硝基苯酚、肌酐（分析純）。試劑配置參考WS/T97-1996尿中肌酐分光光度測定方法[13]。

2.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（UVmini-1280，配5 mm比色皿，日本島津）；電子分析天平（HZY-AZZO，華志電子科技）；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-11A，天津市表斯特儀器）。

2.3 方法

2.3.1 反應(yīng)時間的選擇

選擇肌酐濃度為1.00 g/L，加入2.0 mL苦味酸，在20℃條件下，從反應(yīng)時間15 min開始，每隔2 min測量反應(yīng)溶液的吸光度值，考察反應(yīng)時間對測量吸光度值的影響。

2.3.2 反應(yīng)溫度的選擇

選擇肌酐濃度為1.00 g/L，加入2.0 mL苦味酸，分別在15、20、25、30、35、40、45℃條件下，反應(yīng)30 min，考察反應(yīng)溫度對測量吸光度值的影響。

2.3.3 苦味酸加入量的選擇

選擇肌酐濃度為1.00 g/L，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL苦味酸，在20℃條件下，反應(yīng)30 min，考察苦味酸加入量對測量吸光度值的影響。

配制6套肌酐濃度為0.00、0.10、0.20、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)系列，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL苦味酸，在20℃條件下，反應(yīng)30min，以吸光度為縱坐標(biāo)，肌酐濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察肌酐加入量對肌酐反應(yīng)的影響。

2.3.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)

選擇肌酐濃度為1.00 g/L測量吸光度值，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和苦味酸加入量3個因素，設(shè)計(jì)3因素3水平正交分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

2.3.5 方法學(xué)考察

對方法的檢出限、加標(biāo)回收率和精密度進(jìn)行考察。

2.4 分析評價

2.4.1 尿中肌酐的測定

肌酐標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10 g/L：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g肌酐（經(jīng)110℃干燥2 h），溶于鹽酸溶液；定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，此溶液為1.0 g/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用水稀釋成0.1 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液（置于冰箱內(nèi)可保存1個月）。取10支10 mL的具塞比色管，按表2配制標(biāo)準(zhǔn)系列。

表2 肌酐標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

同時，取尿樣0.10 mL，置于10 mL具塞比色管中，加入純水至3.0 mL；向各管中加入一定量堿性苦味酸溶液，純水定容后充分搖勻，在一定溫度下反應(yīng)一定時間；以0管作參比，在490 nm波長處，用0.5 mm比色皿上機(jī)測定吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)，肌酐濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 結(jié)果計(jì)算

C=c×f

式中：C——尿中肌酐的濃度（g/L）；c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的肌酐的濃度（g/L）；f——尿樣稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 反應(yīng)時間的選擇

由圖1可知，吸光度值隨著反應(yīng)時間的延長而升高，約30 min時吸光度值趨于平衡，故選取30 min為最佳反應(yīng)時間。

圖1 反應(yīng)時間對吸光度值的影響

3.2 反應(yīng)溫度的選擇

由圖2可知，在15℃～40℃之間，吸光度值隨著反應(yīng)溫度的升高而升高，溫度超過40℃時，吸光度值隨著反應(yīng)溫度的升高而降低，原因可能是溫度過高時，苦味酸和肌酐的結(jié)合不穩(wěn)定。在15℃～25℃之間，顯色穩(wěn)定，故選取20℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖2 反應(yīng)溫度對吸光度值的影響

3.3 苦味酸加入量的選擇

由圖3可知，吸光度值隨著苦味酸加入量的增加而升高，在苦味酸加入量為2.0 mL時，吸光度值趨于平衡?？辔端峒尤肓吭?.5～3.0 mL時，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)較好?？辔端峒尤肓吭?.5 mL時，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率較小，較為平緩；苦味酸加入量2.0 mL與2.5 mL、3.0 mL相比，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率相差不大，故選取苦味酸加入量為2.0 mL。

圖3 苦味酸對吸光度值的影響

3.4 尿中肌酐檢測條件優(yōu)化

反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和苦味酸加入量的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理結(jié)果

由表3可知，影響尿中肌酐測定的主要因素主次順序?yàn)镃＞A＞B，即苦味酸加入量對尿中肌酐測定的影響最大，反應(yīng)溫度影響最小。最優(yōu)化工藝組合條件為A2（A3）B3C3，即反應(yīng)時間30 min（35min）、反應(yīng)溫度25℃、苦味酸加入量2.5 mL。由于試驗(yàn)中反應(yīng)溫度的影響最小，綜合經(jīng)濟(jì)性和實(shí)際條件考慮，選取反應(yīng)時間30 min、反應(yīng)溫度20℃、苦味酸加入量2.0 mL為最佳反應(yīng)條件，此條件下制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 不同苦味酸加入量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1 檢出限

加入一定體積的0.10 g/L肌酐標(biāo)準(zhǔn)溶液，扣除空白值后，將吸光度為0.015所對應(yīng)的濃度作為檢出限，經(jīng)換算得出該方法的檢出限為0.01 g/L（取樣體積為0.10 mL），結(jié)果見表4。

表4 檢出限試驗(yàn)

3.5.2 方法精密度

取0.1 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L這3個濃度水平的樣品，重復(fù)測定10次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%～2.98%。結(jié)果見表5。

表5 精密度試驗(yàn)（n=10）

3.5.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

由表6可知，低點(diǎn)加標(biāo)的平均回收率為101.7%；中點(diǎn)加標(biāo)的平均回收率為97.8%；高點(diǎn)加標(biāo)的平均回收率為100.6%?？梢姷汀⒅?、高點(diǎn)的加標(biāo)回收率均在95%～105%之間。

表6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

4 結(jié)論

綜上所述，苦味酸法檢測尿中肌酐的最優(yōu)條件為：加入苦味酸2.0 mL，定容后在20℃反應(yīng)30 min；以零管為參比，采用5 mm比色皿，于波長490 nn下測定。結(jié)果顯示，尿肌酐在0.1 g/L～3.0 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，檢出限為0.01 g/L，RSD為0.85%～2.98%，加標(biāo)回收率在95%～105%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。與WS/T 97-1996《尿中肌酐分光光度測定方法》相比，降低了檢出限，擴(kuò)展了檢測范圍，提升了檢測質(zhì)量和檢測效率，可為標(biāo)準(zhǔn)方法的更新提供參考依據(jù)。