郝蠫 胡二向 李丹丹

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心 北京 100123）

1 前言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱，在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性，屬于人體腸道的正常菌群，具有維持腸道微生物平衡、降低膽固醇、抗變異原、抗腫瘤、增強免疫力等重要功能[9]。乳酸菌中的多數(shù)種為耐氧性厭氧菌（Aerotolerant anaerobes）和兼性厭氧菌（Facultative anaerobes），少數(shù)為嚴(yán)格厭氧菌（Strict anaerobes）。在耐氧性厭氧菌和兼性厭氧菌的能量代謝系統(tǒng)中，由于缺乏電子傳遞鏈和氧化磷酸化產(chǎn)能酶系，故只能借糖類的不完全氧化即發(fā)酵來獲得能量。

乳酸菌作為食用型的微生物，可以調(diào)節(jié)食品風(fēng)味，提高食物的生物價，加快人體的消化和吸收[1]。部分結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量較大的蛋白質(zhì)，在乳酸菌酶的特定作用下，一部分可以降解為游離氨基酸和小分子肽，其中的蛋白質(zhì)還可以進一步增加氨基酸含量。乳酸菌能夠降解少量的脂肪，在其代謝過程中消耗部分維生素，合成葉酸等維生素B族[10]。

因抗生素的使用不當(dāng)，乳酸菌出現(xiàn)了耐藥性，Danielsen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌在大多數(shù)時候，對諾氟沙星、頭孢西丁、替考拉丁、慶大霉素、鏈霉素和卡那霉素等抗生素有耐藥性；Muhammad Nawaz等[7]通過耐藥性實驗對發(fā)酵食品中的乳酸菌進行研究，在分離中發(fā)現(xiàn)了耐紅霉素的基因ermB和耐四環(huán)素的基因tetS和tetM。本文以內(nèi)蒙古錫盟地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶油制品中分離出的10株乳酸菌為試驗菌株，測定其對常見抗生素的耐受能力，以期為相關(guān)研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌種來源

分離自內(nèi)蒙古錫盟不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶油制品中的10株乳酸菌，鑲黃旗酸油3株（XHS1、XHS2、XHS3）；黃旗黃油2株（XHH1、XHH）；鑲藍(lán)旗奶油3株（ZX1、ZX2、ZX3）；阿巴嘎旗的酸油2株（BG1、BG2）。

2.1.2 試劑來源

脫脂乳粉（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司）；蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、瓊脂粉（生化試劑）；吐溫-80、氯化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、乙酸鈉（化學(xué)純）；四環(huán)素、乙酰螺旋素、青霉素（杭州微生物試劑有限公司）。

2.1.3 培養(yǎng)基制備和培養(yǎng)環(huán)境

2.1.3.1 脫脂乳培養(yǎng)基的制備

稱取脫脂乳粉10.00 g，加入蒸餾水量100 mL；攪拌加熱溶解后調(diào)節(jié)pH至6.8；110℃滅菌15 min，迅速冷卻[8]。

2.1.3.2 MRS培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配制：蛋白胨10 g；酵母膏5 g；牛肉膏10 g；葡萄糖20 g；檸檬酸氫二銨2 g；乙酸鈉（3H2O）5 g；Tween 80 1 g。緩沖液5 mL，pH 6.2～6.4，121℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基需加入瓊脂1.5 g。

2.1.4 儀器與設(shè)備

電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；全自動高壓蒸汽滅菌鍋（OLYMPOS公司）；超凈臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；生化培養(yǎng)箱（303-OA型，天津市通利信達(dá)儀器公司）；酸度計（上海佑科儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（S11-Ni2，北京長安科學(xué)儀器公司）；生化培養(yǎng)箱（303-OA型，天津市通利信達(dá)儀器廠）。

2.2 試驗方法

2.2.1 菌種活化

將供試菌株轉(zhuǎn)接至脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h；活化2次，轉(zhuǎn)接至脫脂乳中進行第3次活化；將5%接種量轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，使菌株的活力得到恢復(fù)，將菌懸液調(diào)制為108CFU/mL。

2.2.2 耐藥性的測定

用紙片瓊脂擴散法測定乳酸菌對抗生素的耐受能力。將供試菌株涂于瓊脂培養(yǎng)基上，將浸染后的抗生素藥敏紙片貼于平板上，37℃培養(yǎng)48 h，觀測抑菌圈直徑（mm）大小。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株對四環(huán)素的耐受性能力分析

由圖1和圖2看出，BG1菌的抑菌圈最大，直徑為18.9 mm，表明其對四環(huán)素的耐受性最弱；ZX3的抑菌圈最小，直徑為11 mm，表明其對四環(huán)素的耐受性最強；XHS1菌、XHH2菌和ZX2菌對四環(huán)素的耐受程度相近，抑菌圈直徑分別為16.29 mm、16.23 mm和16.49 mm；XHS3菌的抑菌圈直徑為18.13 mm，表明其耐受性強于BG1菌；XHS2、XHH1和ZX1菌的抑菌圈直徑分別為14.21 mm、15 mm和14.9 mm，表明其耐受性相對較強；BG2菌的抑菌圈直徑比BG1菌小，表明其對四環(huán)素的耐受性比BG1菌強。

圖1 乳酸菌對四環(huán)素的耐受能力

圖2 乳酸菌對四環(huán)素的抑菌圈圖

3.2 乳酸菌對乙酰螺旋素的耐受能力分析

由圖3和圖4可以看出，ZX2、ZX3菌的抑菌圈直徑分別為17.54 mm、18.21 mm，表明其對乙酰螺旋霉素的耐受性最弱；BG1菌的抑菌圈最小直徑為7.03mm，表明其對乙酰螺旋霉素的耐受性最強；XHS1，XHH1和XHH2菌的抑菌圈直徑分別為13.43 mm、13.43 mm和13.21 mm，表明這3種菌株對乙酰螺旋霉素的耐受性無較大差異；XHS3、ZX1和BG2的抑菌圈直徑均大于菌株BG1，表明其對乙酰螺旋霉素 的耐受性也弱于菌株BG1。

圖3 乳酸菌對乙酰螺旋霉素的耐受能力

圖4 乳酸菌對乙酰螺旋霉素的抑菌圈圖

3.3 乳酸菌對青霉素的耐受性的測定結(jié)果

由圖5和圖6可以看出，XHS的2抑菌圈直徑最小為12.49mm，表明其對青霉素的抑制力最強；XHH2的抑菌圈直徑最大為19.96mm，表明其對青霉素的耐受性最弱；XHS1、XHS3的抑菌圈直徑分別為13.80mm、13.28mm，表明其對青霉素的抑制性無較大差異；ZX2、ZX3、BG1的抑菌圈分別為16.85mm、17.23mm和17.21mm，表明其對青霉素的抑制性無較大差異。

圖5 乳酸菌對青霉素耐受能力

圖6 乳酸菌對青霉素抑菌圈圖

3.4 乳酸菌耐藥性結(jié)果分析

由表4可知，分離的鑲黃旗黃油乳酸菌對四環(huán)素耐受實驗中，XHH2抑菌圈最大，抑菌圈為16.10 mm，說明XHH2對四環(huán)素的耐受性最弱；分離的鑲黃旗黃油乳酸菌對乙酰螺旋素耐受實驗中XHH2在乙酰螺旋素中抑菌圈最大，抑菌圈為15.11 mm，說明XHH2對乙酰螺旋素耐藥性最弱；分離的鑲黃旗黃油乳酸菌對青霉素耐受實驗中，XHH2在青霉素中抑菌最大，抑菌圈為19.87 mm，可知XHH2對青霉素耐藥性最弱。

分離的正鑲藍(lán)旗稀奶油乳酸菌對四環(huán)素耐受實驗中，ZX2抑菌圈最大，抑菌圈為18.92 mm，說明ZX2對四環(huán)素的耐受性最弱；分離的正鑲藍(lán)旗稀奶油乳酸菌對乙酰螺旋素耐受實驗中ZX3在乙酰螺旋素中抑菌圈最大，抑菌圈為18.12 mm，說明ZX3對乙酰螺旋素的耐藥性最弱；分離的正鑲藍(lán)旗稀奶油乳酸菌對青霉素耐受實驗中ZX3在青霉素中抑菌最大，抑菌圈為17.01 mm，可知ZX3對青霉素的耐藥性最弱。

表1 乳酸菌對抗生素的抑菌圈直徑

分離的阿巴嘎旗乳酸菌對四環(huán)素耐受實驗中，BG1抑菌圈最大，抑菌圈為18.92 mm，說明BG1對四環(huán)素的耐受性最弱；分離的阿巴嘎旗乳酸菌對乙酰螺旋素耐受實驗中BG2在乙酰螺旋素中抑菌圈最大，抑菌圈為10.98 mm，說明BG2對乙酰螺旋素耐藥性最弱；分離的阿巴嘎旗乳酸菌對青霉素耐受實驗中，BG1在青霉素中抑菌最大，抑菌圈為16.97 mm，可知BG1對青霉素的耐受性最弱。

4 結(jié)論

本文采用內(nèi)蒙古錫盟不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵奶油制品中的10株乳酸菌，結(jié)果表明，在四環(huán)素耐受試驗中，ZX3對四環(huán)素的耐受性最強，抑菌圈為11.01 mm；BG1對四環(huán)素的耐性最弱，抑菌圈最大為18.92 mm；ZX2、ZX3對乙酰螺旋霉素的耐受能力最弱，抑菌圈直徑分別為17.56 mm、18.12 mm；BG1對乙酰螺旋霉素的耐受性最強，抑菌圈直徑最小為7.23 mm。在青霉素耐受試驗中，XHH2對青霉素的耐受性最弱，抑菌圈直徑最大為19.87 mm；XHS2對青霉素的抑制力最強，抑菌圈直徑最小為12.38 mm。