姜?；?張化為 姜祎 宋小妹 黃文麗 許洪波 鄧翀

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046)

山茱萸是山茱萸科植物CornusOfficinalisSieb.et Zucc.的成熟果肉[1]。山茱萸味酸，微溫，具有補(bǔ)益肝腎、收斂固脫、澀精止汗的作用。主治眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴?，F(xiàn)代藥理研究表明，山茱萸具有保肝、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、心肌保護(hù)等功效[2-3]。近年來，有研究表明山茱萸環(huán)烯醚萜總苷、熊果酸、多糖、沒食子酸等成分均有抗肝損傷的作用[4-6]。目前市場(chǎng)上治療肝炎、肝癌的藥物存在療效低和毒副作用大的問題而限制其臨床應(yīng)用[7-9]，因此抗肝損傷藥物的研制是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，也是全球研究的熱點(diǎn)。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)和多途徑等特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點(diǎn)，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)及計(jì)算機(jī)分析技術(shù)，能過多層次的闡明藥物作用機(jī)制[10]。與中醫(yī)藥學(xué)的基本特點(diǎn)相吻合，符合中醫(yī)藥對(duì)疾病本質(zhì)的認(rèn)識(shí)，近年來已經(jīng)成為了中藥研究的一種有效的技術(shù)手段[11]。本研究將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)山茱萸抗肝損傷的潛在作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，并通過分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證山茱萸活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)山茱萸抗肝損傷有潛在優(yōu)勢(shì)，以期為山茱萸的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1活性成分的篩選 以山茱萸為關(guān)鍵詞，利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP http://tcmspw.com/ tcmsp.php)，化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn)，中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID http://119.3.41.228:8000/tcmid/)，PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)和中國(guó)國(guó)家知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(CNKI,http://www.cnki.net/)搜索山茱萸的化學(xué)成分。將OB≥30%和DL≥0.18的化學(xué)成分選作進(jìn)一步分析的候選成分[12-14]。

1.2活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 從TCMSP和Swiss檢索預(yù)測(cè)山茱萸中所有成分的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。刪除了多余的信息，使用UniProt(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，將數(shù)據(jù)合并獲得靶蛋白規(guī)范名稱。

1.3山茱萸抗肝損傷相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 通過GeneCards v4.9.0(www.genecards.org/)和OMIM(www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫中整理肝損傷相關(guān)疾病靶點(diǎn)。輸入關(guān)鍵字“hepatic injury”搜索現(xiàn)在研究已經(jīng)報(bào)道的與肝損傷相關(guān)的靶點(diǎn)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)去重整理。

通過venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，分別輸入山茱萸活性成分的靶點(diǎn)與肝損傷相關(guān)的靶點(diǎn)，整理即得活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集，將其定義為山茱萸抗肝損傷的潛在靶點(diǎn)。

1.4網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 使用Cytoscape v3.7.1(www.cytoscape.org/)對(duì)山茱萸的成分、相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)的繪制。

1.5GO與KEGG分析 在R軟件[15]中運(yùn)行代碼對(duì)山茱萸抗肝損傷的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。并根據(jù)P值進(jìn)行排序，保留優(yōu)選結(jié)果。

1.6蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 根據(jù)String v11.0(https://stringdb.org/cgi/input.pl)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析[16]，獲取蛋白相互作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制靶蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，利用Network Analyzer模塊對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，以確定在山茱萸治療中肝損傷潛在靶標(biāo)之間的關(guān)系。

1.7活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接 從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB(http://www.rcsb.org/pdb/)獲得了相應(yīng)靶點(diǎn)的PDB-ID。采用Discovery Studio 2016軟件中LibDock模塊進(jìn)行分子對(duì)接，用以評(píng)價(jià)山茱萸活性成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

2.1活性成分的篩選 通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得山茱萸化學(xué)成分333個(gè)，使用OB和DL進(jìn)行篩選，盡管有些成分不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)它們有明顯的藥理活性，例如馬錢苷、莫若苷等成分[17]，為了更全面、客觀地分析這一問題，仍將其納入到活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫里，具體成分見表1。

表1 山茱萸的活性成分

2.2成分靶點(diǎn)篩選 經(jīng)過TCMSP和Swiss數(shù)據(jù)庫收集的靶點(diǎn)，收錄的山茱萸中成分的作用靶點(diǎn)共1639個(gè)。將獲得的靶點(diǎn)進(jìn)一步映射到Uniprot數(shù)據(jù)庫歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化命名，刪除無效與重復(fù)靶點(diǎn)，共獲取山茱萸有效活性成分作用靶點(diǎn)484個(gè)。

2.3山茱萸抗肝損傷相關(guān)靶點(diǎn)的收集 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫與OMIM數(shù)據(jù)庫檢索得到3493個(gè)與肝損傷相關(guān)的基因，通過venny 2.1.0制作韋恩圖(見圖1)，取得山茱萸活性成分抗肝損傷的相關(guān)靶點(diǎn)333個(gè)。

圖1 山茱萸作用靶點(diǎn)與肝損傷相關(guān)靶點(diǎn)交集

2.4網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示，藍(lán)色為活性成分，灰色為相關(guān)靶點(diǎn)。圖中共364個(gè)節(jié)點(diǎn)和1107條邊。每個(gè)活性成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，該網(wǎng)絡(luò)的平均鄰近節(jié)點(diǎn)數(shù)為5.984，說明山茱萸抗肝損傷的多成分多靶點(diǎn)的特性，圖中也可以看出許多靶點(diǎn)也與多種化合物相關(guān)，這表明山茱萸在發(fā)揮藥效過程中不同化合物也具有協(xié)同作用。

圖2 成分-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5GO分析 將333個(gè)潛在靶點(diǎn)通過R軟件對(duì)其進(jìn)行GO的富集分析(P<0.05)，系統(tǒng)地分析其生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)。共富集到 2728個(gè)生物過程(圖3)，104個(gè)細(xì)胞組分(圖4)，218個(gè)分子功能(圖5)。根據(jù)P值從小到大截取排名較高的選項(xiàng)，圖3中，顏色越紅，表示P值越小，排名越高，圖3B展示了表示不同生物過程的相關(guān)度，相關(guān)度越高，邊越粗，富集靶點(diǎn)越多，形狀越大。圖3C展示了根據(jù)P值排名前五的生物過程所涉及的靶點(diǎn)。圖4和圖5同上。結(jié)果表明，在生物過程與對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)和循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程等項(xiàng)相關(guān)性較高；在分子功能中與膜筏和膜微區(qū)等相關(guān)性較高；在細(xì)胞組分中與蛋白酪氨酸激酶活性和核受體活性等相關(guān)性較高。反映了肝損傷涉及體內(nèi)多個(gè)生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的異常，同時(shí)表明山茱萸可能是通過調(diào)節(jié)這些過程可以發(fā)揮其抗肝損傷的作用。

A.GO富集生物過程氣泡圖；B.GO富集生物過程與潛在靶點(diǎn)關(guān)系圖

A.GO富集細(xì)胞組分氣泡圖；B.GO富集細(xì)胞組分與潛在靶點(diǎn)關(guān)系圖

A.GO富集分子功能氣泡圖；B.GO富集分子功能與潛在靶點(diǎn)關(guān)系圖

2.6KEGG通路分析 KEGG途徑的富集分析使用R軟件(P<0.05)進(jìn)行(圖7)。KEGG途徑富集后，將333個(gè)潛在靶基因映射到115個(gè)途徑。根據(jù)圖6所示，表明這些靶點(diǎn)與AGE-RAGE信號(hào)通路，PI3K-Akt信號(hào)通路，神經(jīng)活性配體-受體相互作用、HIF-1信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、內(nèi)分泌抵抗等信號(hào)通路密切相關(guān)。通過KEGG Map繪制AGE-RAGE信號(hào)通路，PI3K-Akt信號(hào)通路，神經(jīng)活性配體-受體相互作用，HIF-1信號(hào)通路的pathway通路圖(圖7C-F)，同時(shí)將涉及到的交集靶點(diǎn)標(biāo)紅。這些途徑可能是負(fù)責(zé)肝損傷治療的關(guān)鍵途徑，提供了研究肝損傷治療的新方法。

A.KEGG分析條形圖;B.KEGG分析柱狀圖;C.AGE-RAGE信號(hào)通路；D.PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)徑

2.7蛋白相互作用分析 將潛在靶點(diǎn)上傳至String軟件，得到了交集蛋白的相互作用關(guān)系，通過Cytoscape3.7.1軟件繪制一個(gè)由285個(gè)節(jié)點(diǎn)和1530個(gè)邊緣組成的靶蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)的平均鄰近節(jié)點(diǎn)數(shù)為6.648。(圖7)。

圖7 PPI網(wǎng)絡(luò)

將節(jié)點(diǎn)顏色設(shè)置用于反映DC(Degree Centrality)的高低，DC值越大，節(jié)點(diǎn)顏色越紅；顏色的深淺用于反映BC(Betweenness Centrality)的高低，值越高，節(jié)點(diǎn)越大；字體的大小反應(yīng)于CC(Closeness Centrality)值的高低，CC值越大，字體越大；邊的顏色反應(yīng)于Combined Score的大小，值越大，顏色越紅；獲得最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)中的DC平均值為10.8754，CC平均值為0.3096，BC平均值為0.0087。經(jīng)過篩選，45個(gè)潛在靶點(diǎn)的三個(gè)中心值都高于相關(guān)平均值。

2.8分子對(duì)接 上述PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)中三個(gè)中心值越高，說明在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要的地位，這些節(jié)點(diǎn)被稱為“中樞節(jié)點(diǎn)”，在山茱萸抗肝損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。因此我們對(duì)上述三個(gè)中心值排名均在前十位的核心靶點(diǎn)通過venny獲取交集基因，得到PIK3R1、MAPK1、TP53、HSP90AA1四個(gè)核心靶點(diǎn)，將其與本研究篩選出來多的32個(gè)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。從PubChem數(shù)據(jù)庫和ChemDraw中獲得山茱萸32個(gè)活性成分的smiles字符串；從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中獲得4個(gè)重要靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，PIK3R1晶體結(jié)構(gòu)的PDB ID為4OVV，MAPK1晶體結(jié)構(gòu)的PDB ID為6G54，TP53晶體結(jié)構(gòu)的PDB ID為6MY0，HSP90AA1的PDB ID為1YC3。通過Discovery Studio 2016軟件將活性成分和靶蛋白進(jìn)行準(zhǔn)備，加氫、去水、去配體，通過LibDock模塊[18]進(jìn)行批量分子對(duì)接，對(duì)接分?jǐn)?shù)越高，對(duì)接的結(jié)合活性越好。刪掉沒有對(duì)接上的成分，保留28個(gè)成分的對(duì)接分?jǐn)?shù)，制作熱圖(圖8)。結(jié)果表明山茱萸新苷、獐牙菜苷、馬錢苷、莫諾苷、3,6-二沒食子酰基葡萄糖、路邊青鞣質(zhì)D都有良好的結(jié)合活性。圖9展示了部分活性成分與4個(gè)核心靶點(diǎn)對(duì)接示意圖。根據(jù)這些數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)了山茱萸化學(xué)成分-蛋白質(zhì)結(jié)合親和力。

圖8 分子對(duì)接結(jié)果-熱圖

A.HSP90AA1與3,6-二沒食子?；咸烟菍?duì)接;B.TP53與路邊青鞣質(zhì)D對(duì)接;C.MAPK1與山茱萸新苷對(duì)接;D.PIK3R1與莫諾苷對(duì)接

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析的方法發(fā)現(xiàn)山茱萸32個(gè)有效活性成分與333個(gè)潛在靶點(diǎn)可能存在相互作用關(guān)系。對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析得到山茱萸抗肝損傷作用機(jī)制的相關(guān)通路有AGE-RAGE信號(hào)通路，PI3K-Akt信號(hào)通路，神經(jīng)活性配體-受體相互作用、HIF-1信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、內(nèi)分泌抵抗等信號(hào)通路密切相關(guān)，通過PPI分析得到PIK3R1、MAPK1、MAPK3、SRC、APP、TP53、AKT1、HRAS、HSP90AA1、MAPK8、JUN、EGFR、LYN、F2、MAPK14等潛在靶點(diǎn)。為了更好研究山茱萸抗肝損傷的藥效成分與靶點(diǎn)之間的作用，通過分子對(duì)接驗(yàn)證，分子對(duì)接結(jié)果表明山茱萸新苷、3,6-二沒食子酰基葡萄糖、路邊青鞣質(zhì)D、馬錢苷、莫諾苷、熊果酸等成分都是山茱萸保肝的關(guān)鍵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)山茱萸中山茱萸新苷、3,6-二沒食子酰基葡萄糖、路邊青鞣質(zhì)D、馬錢苷、莫諾苷、熊果酸等32種潛在活性成分對(duì)肝臟損傷具有保護(hù)作用和治療作用，其機(jī)制可能與減少炎癥因子的生成、抑制酶的活化、抗氧化、清除自由基的能力的提升以及免疫調(diào)節(jié)等多種途徑有關(guān)[19]。有研究表明山茱萸多酚和黃酮類成分具有抗菌抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基、亞硝酸鹽自由基、羥基自由基均具有清除作用，且還原能力強(qiáng)，表明了山茱萸較強(qiáng)的抗氧化活性[20-21]。山茱萸總苷等對(duì)于CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化化模型，在通過降低細(xì)胞色素P4502E1的表達(dá)，從而抑制了炎癥反應(yīng)，抗氧化應(yīng)激損傷等作用保護(hù)CCl4誘導(dǎo)[22]。山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)免疫反應(yīng)有雙向調(diào)節(jié)的作用，對(duì)濃度高時(shí)有抑制作用，濃度適宜時(shí)會(huì)促進(jìn)白細(xì)胞介素-2(IL-2)的產(chǎn)生，且馬錢苷通過抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3、Caspase-9活化從而對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，并可誘導(dǎo)其凋亡。莫諾苷通過抗氧化應(yīng)激降低Nrf2，HO-1的表達(dá)從而抑制兩人HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，改善肝細(xì)胞的凋亡率、細(xì)胞形態(tài)[17,23]。

根據(jù)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，可以清晰的看出山茱萸抗肝損傷涉及的PIK3R1、MAPK1、MAPK3等15個(gè)潛在活性靶點(diǎn)大多都分布在排名較高的信號(hào)通路中，說明這15個(gè)靶蛋白為山茱萸抗肝損傷的核心靶點(diǎn)?，F(xiàn)已有研究表明，大部分的靶點(diǎn)均與抗肝損傷密切相關(guān)，其中，PIK3R1(磷脂酰肌醇3-激酶)多種因子激活，從而參與調(diào)節(jié)代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、凋亡等生物學(xué)過程，對(duì)治療炎癥、代謝等疾病作用機(jī)制具有顯著的作用[24]。絲裂原活化蛋白激酶MAPK1、MAPK3等蛋白影響著VEGF、PPAR等多種信號(hào)通路，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)和保護(hù)有促進(jìn)作用，山茱萸活性成分可能通過影響MAPK1等酶，從而保護(hù)血管內(nèi)皮和促進(jìn)血管生成的藥效[24]。TP53(腫瘤蛋白P53)能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和避免細(xì)胞異變發(fā)生，抑制TP53的活性可減輕肝細(xì)胞凋亡帶來的肝損傷[26]。JUN(氨基端激酶)是促分裂原活化的蛋白激酶，包括JNK1、JNK2、JNK3，JUN對(duì)肝細(xì)胞增殖以及發(fā)育異常的發(fā)展具有重要功能，從而影響細(xì)胞凋亡、炎癥和腫瘤的發(fā)生[27]。

山茱萸抗肝損傷相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG富集分析結(jié)果中，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications通路AGE結(jié)合其受體(RAGE)發(fā)揮作用，并可以誘導(dǎo)成肌纖維細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致細(xì)胞遷移加，調(diào)控AGE-RAGE信號(hào)通路，可以減輕的肝氧化應(yīng)激，炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)及其上游介導(dǎo)核因子κB[28]，且AGE-RAGE信號(hào)通路與Calcium信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路均有關(guān)聯(lián)。PI3K通過合成磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸(PI-3,4-P2)和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PI-3,4,5-P3)，從含有PH結(jié)構(gòu)域的蛋白如3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)或其下游靶標(biāo)Akt，反過來激活mTORC1[29]，抑制細(xì)胞自噬，發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)自噬過程的作用，從而影響細(xì)胞分子的活化，促進(jìn)細(xì)胞遷移、血管生成和炎癥因子的表達(dá)[30]。

綜上所述，使用系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來分析山茱萸抗肝損傷的多成分，多靶點(diǎn)，多通路的作用機(jī)制，包括化合物數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，靶標(biāo)的捕撈，網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析。獲得了山茱萸的32個(gè)活性成分，333個(gè)潛在靶點(diǎn)和115個(gè)信號(hào)通路。此外，通過進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證了化合物與靶標(biāo)相互作用的可靠性。山茱萸通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)抗肝損傷作用機(jī)制研究路線如圖10所示。本文建立的山茱萸通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討抗肝損傷的研究模式，為山茱萸活性成分的篩選和抗肝損傷作用機(jī)理的探討提供了一個(gè)研究思路。

圖10 山茱萸通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)抗肝損傷作用機(jī)制研究路線圖