孟繁杰，閻英，熊嬋，王麗麗，趙松，邢思寧，于卉影

110016 沈陽， 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(孟繁杰、王麗麗、趙松、邢思寧、于卉影)，放療科(閻英)；110016 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué) 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地(熊嬋)

宮頸癌是目前全球女性常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥高死亡率的原因之一[1-2]。近年來,隨著宮頸癌發(fā)病率不斷上升，放射治療已經(jīng)成為中晚期宮頸癌的主要治療手段。但是患者個體對放射治療敏感性的差異，導(dǎo)致其預(yù)后差別明顯。即使分期相同、腫瘤體積類似的宮頸癌患者，在接受同等劑量的放射治療后仍有部分患者復(fù)發(fā)。因此，如何提高宮頸癌放射治療的療效成為臨床亟待解決的問題[3]。在一些放射處理的腫瘤細(xì)胞中常見到多倍體巨細(xì)胞[4]，Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞中多倍體巨細(xì)胞侵襲和遷移能力更強(qiáng)，并且對常見的化療藥物(包括順鉑、多柔比星和5-氟尿嘧啶)高度耐藥。此外，有報道稱這些多倍體細(xì)胞可能經(jīng)歷不對稱分裂(產(chǎn)生二倍體細(xì)胞)在體內(nèi)進(jìn)行自我更新，提示細(xì)胞的自噬與更新現(xiàn)象可能在腫瘤的放射抵抗中發(fā)揮著作用，然而其作用機(jī)制尚不明確[6-7]。本研究旨在分析放射誘發(fā)多倍體宮頸癌細(xì)胞的衰老與自噬現(xiàn)象，以探討多倍體宮頸癌細(xì)胞在放射誘導(dǎo)復(fù)發(fā)和抵抗中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 宮頸癌Hela細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清購自天津康源生物技術(shù)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司；兔抗人E2F-1、E2F-2抗體購自美國Santa cruz公司，兔抗人PLK1抗體、兔抗人PARP抗體、兔抗人LC3A/B抗體、鼠抗人SQSTM1/P62抗體、抗兔IgG(H+L)、F(ab′)2片段(Alexa Fluor 488 Conjugate)抗體、β-半乳糖苷酶檢測試劑盒均購自美國Cell Signaling Technology公司，Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Calcein/PI Cell Viability/Cytotoxicity Assay Kit)購自碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗人GAPDH抗體購自美國Sigma公司，Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購自美國Pierce Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞在含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 放射處理Hela細(xì)胞 將Hela細(xì)胞以2×104個/cm2的密度接種于T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，使用Elekta Infinity直線加速器在6MV-X射線模式下給予7 Gy的劑量，照射完畢孵育24 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至第3天、5天、7天、11天和19天，分別記為Control、Day 3組、Day 5組、Day 7組、Day 11組和Day 19組。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用ImageJ測量細(xì)胞的長直徑。

1.2.3 Live/Dead細(xì)胞檢測試驗(yàn) 將各組細(xì)胞接種于24孔板中，每孔加入250 μL Calcein AM/PI檢測工作液，37℃避光孵育30 min。在熒光顯微鏡下觀察染色效果(Calcein AM為綠色熒光，PI為紅色熒光)并拍照。

1.2.4 細(xì)胞倍性檢測 使用80%冰甲醇于-20℃固定24 h，PBS溶液洗滌，PI室溫避光染色30 min，使用FACS Canto?Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)進(jìn)行檢測。

1.2.5 Western blot檢測 使用超聲波破碎儀裂解各組細(xì)胞，經(jīng)過離心提取細(xì)胞蛋白，應(yīng)用BCA法測定各組蛋白的濃度，應(yīng)用SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印，使用脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃搖床過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL試劑發(fā)光，X線片夾中顯影。

1.2.6 β-半乳糖苷酶檢測 收集各組細(xì)胞用固定液室溫固定10 min，加入10 μL β-半乳糖苷酶染色液A、10 μL β-半乳糖苷酶染色液B、930 μL β-半乳糖苷酶染色液C和50 μL X-gal，37℃孵育4 h，普通光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 PLK1是一種蛋白激酶，與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)，常提示細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)，在一些癌組織中過度表達(dá)[8]，本研究利用 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)對PLK1在正常宮頸組織和宮頸癌組織的表達(dá)差異進(jìn)行分析。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 放射誘導(dǎo)的多倍體宮頸癌細(xì)胞的形態(tài)和DNA含量的變化

Hela細(xì)胞經(jīng)7 Gy放射處理，Day 3組和Day 5組細(xì)胞體積明顯增大，Day 5組的大細(xì)胞周圍有小細(xì)胞的存在(圖1A)，Day 3組、Day 5組、Day 7組和Day 11組細(xì)胞平均直徑高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;圖1B)，且Day 3組和Day 5組大細(xì)胞均為活細(xì)胞(圖1C)。與對照組相比，Day 3組、Day 5組、Day 7組和Day 11組多倍體細(xì)胞亞群(DNA含量>4N)比例均明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在Day 5組中多倍體細(xì)胞亞群比例達(dá)到高峰，隨后多倍體細(xì)胞亞群比例下降(圖2)。Day 19組中多倍體細(xì)胞減少至正常水平，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 經(jīng)7 Gy照射后Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及活性(×200)

圖2 經(jīng)7 Gy照射后Hela細(xì)胞倍性變化

2.2 放射誘導(dǎo)的多倍體宮頸癌細(xì)胞發(fā)生衰老現(xiàn)象

β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測衰老標(biāo)志物β-半乳糖苷酶的表達(dá)。經(jīng)7 Gy處理后，Day 3組、Day 5組和Day 7組中多數(shù)細(xì)胞的β-半乳糖苷酶表達(dá)呈陽性，并與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明放射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生衰老現(xiàn)象(圖3A、B)。Western blot檢測衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對照組相比,Day 3組和Day 5組細(xì)胞DNA損傷修復(fù)蛋白PARP表達(dá)下調(diào)，DNA合成相關(guān)蛋白E2F-1、E2F-2表達(dá)下調(diào)，DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白PLK1表達(dá)上調(diào)。然而，Day 19組這些蛋白都恢復(fù)到正常水平，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05;圖3C、D)。

圖3 經(jīng)7 Gy照射后Hela細(xì)胞衰老變化

2.3 放射誘導(dǎo)的多倍體宮頸癌細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象

Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示與對照組相比,Day 3組、Day 5組和Day 7組自噬相關(guān)蛋白 LC3-II/LC3-I 比值表達(dá)上調(diào)，自噬特異性底物P62蛋白表達(dá)下調(diào)，Day 19組P62表達(dá)下調(diào)(圖4)。

圖4 經(jīng)7 Gy照射后Hela細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4 PLK1在宮頸癌組織中的表達(dá)水平

利用GEPIA網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織(n=13)相比，PLK1在宮頸癌組織(n=306)中高表達(dá)(P<0.05;圖5)。

圖5 GEPIA網(wǎng)站驗(yàn)證PLK1在宮頸癌組織中的表達(dá)(*P<0.05)

3 討 論

近年來，放射治療已經(jīng)成為局部中晚期宮頸癌的主要治療手段[9]。然而，經(jīng)放射治療后仍有約30%～40%的宮頸癌患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、惡性加重等情況，這可能與腫瘤在放射治療期間產(chǎn)生的放射抵抗性有關(guān)[10]。放射抵抗性的產(chǎn)生成為臨床腫瘤放射治療的主要障礙。有研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的衰老是可逆的，并且其可逆性可能與治療誘導(dǎo)的細(xì)胞多倍體化有關(guān)[11]。因此，多倍體化可能代表一種逃避化療和放射治療毒性的機(jī)制，從而促進(jìn)癌癥的復(fù)發(fā)。自噬在癌細(xì)胞的進(jìn)展和生存中起著非常復(fù)雜的作用，正如Erenpreisa等[12]所預(yù)測的那樣，自噬可能參與衰老/多倍體癌細(xì)胞發(fā)生去倍增殖。這些研究結(jié)果提示，自噬和衰老現(xiàn)象可能是促進(jìn)多倍體腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的自我更新，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤放射抵抗和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。

在本研究中，我們觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)放射誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞在Day 3組、Day 5組中體積增大且呈多倍體狀態(tài)，并且Day 5組的大細(xì)胞周圍開始出現(xiàn)體積正常的小細(xì)胞。隨著時間延長，多倍體細(xì)胞比例下降，取而代之的是大量體積正常的細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果也證實(shí)了Hela細(xì)胞經(jīng)7 Gy劑量放射誘導(dǎo)出現(xiàn)DNA含量大于四倍體的多倍體細(xì)胞，并且隨著時間延長多倍體細(xì)胞比例逐漸下降。上述結(jié)果表明，放射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞過渡性地產(chǎn)生大量多倍體細(xì)胞，隨后逐漸恢復(fù)到二倍體狀態(tài)。本研究還發(fā)現(xiàn)，多倍體細(xì)胞的形成伴隨著衰老現(xiàn)象，在Day 3組、Day 5組多倍體細(xì)胞中衰老特征性檢測指標(biāo)β-半乳糖苷酶呈陽性。同時，伴隨著DNA損傷修復(fù)蛋白PARP、參與DNA合成的E2F-1、E2F-2蛋白表達(dá)下調(diào)，DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白PLK1表達(dá)上調(diào)，表明細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。在Day 11組和Day 19組多倍體細(xì)胞逐漸恢復(fù)到二倍體狀態(tài)之時，DNA損傷修復(fù)蛋白PARP逐漸升高，同時細(xì)胞衰老特征性檢測指標(biāo)β-半乳糖苷酶和衰老相關(guān)蛋白恢復(fù)到正常水平，提示多倍體細(xì)胞雖然發(fā)生衰老現(xiàn)象，但并沒有使宮頸癌細(xì)胞趨向死亡，而是對損傷DNA進(jìn)行修復(fù)，并且?guī)椭啾扼w宮頸癌細(xì)胞擺脫細(xì)胞分裂阻滯，進(jìn)入增殖狀態(tài)[12]。衰老對于癌細(xì)胞可能不是障礙，而是癌癥發(fā)展的驅(qū)動力，并且多倍體的形成以及不對稱分裂可能在這個過程中起著至關(guān)重要的作用[13]。

通過GEPIA網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，PLK1在宮頸癌中呈高表達(dá)狀態(tài)。有研究表明PLK1高表達(dá)可以降低乳腺癌細(xì)胞對體外和體內(nèi)的放射敏感性導(dǎo)致放射治療后腫瘤的復(fù)發(fā)[14]。我們的結(jié)果顯示，經(jīng)放射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞Day 3組、Day 5組PLK1表達(dá)水平和自噬相關(guān)蛋白 LC3-II/LC3-I比值上調(diào)，自噬特異性底物P62蛋白表達(dá)下調(diào)，提示細(xì)胞可能通過發(fā)生自噬，并與PLK1協(xié)同作用降低宮頸癌細(xì)胞對放射治療敏感性，導(dǎo)致放射治療后腫瘤復(fù)發(fā)。自噬在癌癥中起著重要的作用，有研究表明自噬可能通過誘發(fā)細(xì)胞衰老來維持細(xì)胞周期阻滯狀態(tài)，保護(hù)細(xì)胞[15-18]。然而，自噬和細(xì)胞衰老之間的作用機(jī)制尚不明確[19-20]。

綜上所述，放射誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞出現(xiàn)衰老和自噬現(xiàn)象可能有助于維持細(xì)胞周期阻滯狀態(tài)并產(chǎn)生多倍體細(xì)胞，來幫助宮頸癌細(xì)胞從放射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中進(jìn)行自我修復(fù)。然而，目前放射誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞衰老、自噬和多倍體化的機(jī)制尚不明確，我們后續(xù)會進(jìn)一步研究自噬和衰老之間的關(guān)系及其產(chǎn)生多倍體細(xì)胞的作用機(jī)制。我們推測,Hela細(xì)胞經(jīng)過放射處理后發(fā)生DNA損傷并形成多倍體細(xì)胞，為了避免DNA損傷導(dǎo)致的宮頸癌細(xì)胞死亡，細(xì)胞啟動衰老并對受損的多倍體細(xì)胞DNA進(jìn)行修復(fù)。伴隨著多倍體細(xì)胞的去倍化，宮頸癌細(xì)胞擺脫衰老進(jìn)入增殖狀態(tài)。多倍體細(xì)胞是巨大的、多核的、同時包含受損的DNA碎片和一些受損的細(xì)胞廢物，所以需要功能性自噬來維持其活性。我們推測多倍體細(xì)胞的去倍增殖需要激活自噬，自噬調(diào)節(jié)可能是癌細(xì)胞抵抗化療/放射治療的重要機(jī)制。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步觀察調(diào)控自噬水平是否能影響Hela細(xì)胞的放射敏感性，可能為提高宮頸癌對放射治療的敏感性并改善放射治療效果提供新的潛在靶點(diǎn)。

作者聲明：本文全部作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測。

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權(quán)：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書等協(xié)議。