白寧，劉春燕，李穎，張曉樂，侯德強

214000江蘇 無錫，江南大學附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科(白寧、劉春燕、李穎、張曉樂)，口腔科(侯德強)

甲狀腺癌是一種起源于甲狀腺濾泡上皮細胞的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。盡管經(jīng)手術(shù)、放射性碘和促甲狀腺激素抑制等序貫治療后甲狀腺癌患者臨床預后良好，但仍有5%～10%患者發(fā)生甲狀腺或頸部淋巴結(jié)以外的轉(zhuǎn)移，預后較差[1]。因此，探索可靠的預后標志物和轉(zhuǎn)移機制對甲狀腺癌患者的診療具有重要意義。核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域1(nucleotide-binding oligomerization domain 1，NOD1)，又稱CARD4和NLRC1，是一種胞漿內(nèi)模式識別受體，廣泛表達于所有細胞類型，在免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。近年來，NOD1已被證明可以調(diào)節(jié)癌癥的進展，包括乳腺癌、肝細胞癌和結(jié)腸癌[2-4]。然而NOD1對甲狀腺癌細胞的影響尚不清楚。本研究通過siRNA干擾甲狀腺癌細胞中NOD1表達，進而確定NOD1對甲狀腺癌的調(diào)控作用及分子機制，為甲狀腺癌治療策略的制定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

人甲狀腺癌細胞株BPCPA購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。NOD1 siRNA購自上海吉瑪制藥公司。Lipofectamine 2000試劑、TRIzol試劑、RIPA裂解液、Maxima H Minus第一鏈 cDNA合成試劑盒購自美國Thermo公司。TB Green預混試劑日本Takara公司。EdU試劑盒購自廣州銳博生物公司。蛋白上樣緩沖液、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天生物公司。細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。兔抗人NOD1單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體、兔抗人p-P38單克隆抗體、兔抗人P38單克隆抗體、兔抗人p-ERK單克隆抗體、兔抗人ERK單克隆抗體和山羊抗兔IgG H&L(HRP)購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

常規(guī)復蘇人甲狀腺癌細胞株BCPAP，培養(yǎng)基為含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細胞置于37℃、5% CO2的恒溫生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

將1×106個細胞種植于6孔板，待細胞密度達到70%左右進行轉(zhuǎn)染。取10 μL Lipofectamine 2000試劑與250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基混合，取10 μL siRNA混合于250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，室溫孵育5 min。將兩混合液混勻，室溫孵育20 min。將siRNA-Lipofectamine 2000混合液加入含細胞及500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基的孔中，搖晃孔板混勻。37℃、5% CO2的恒溫生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒NC-siRNA的細胞為siNC組，轉(zhuǎn)染NOD1干擾質(zhì)粒NOD1-siRNA的細胞為siNOD1組。

1.4 實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)

使用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA，隨后通過Maxima H Minus第一鏈 cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TB Green預混試劑在Stepone熒光定量PCR儀上進行定量擴增。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。NOD1：5’-CCTAGACAACAACAATCTCAACGACTA-3’(上游)，5’-TTTACCCCACCGTCAGTGATC-3’(下游)。GAPDH：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(上游)，5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(下游)。以GAPDH為參照基因，通過2-ΔΔCt計算NOD1相對表達量。

1.5 Western blot檢測NOD1表達

使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，與蛋白上樣緩沖液混合后95℃加熱10 min。將等量蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶常溫封閉1 h后，加入兔抗人NOD1單克隆抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日PBST洗膜后加入羊抗兔IgG H&L(1∶2 000)，常溫孵育1 h。PBST洗膜后使用Tanon 5200發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并采集圖像。

1.6 細胞增殖檢測

將1×103個細胞種植于24孔板，進行siRNA轉(zhuǎn)染。將37℃預熱的EdU工作液加入24孔板中，37℃孵育2 h。去除培養(yǎng)液，加入1 mL多聚甲醛固定液，室溫固定15 min。去除固定液，每孔用1 mL洗滌液洗滌細胞3次，每次5 min。去除洗滌液，每孔加入1 mL通透液(含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10 min。去除通透液，清水洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 細胞周期檢測

常規(guī)消化細胞，將原培養(yǎng)基和細胞均收集到離心管中，1 000 g離心5 min，沉淀細胞。使用1 mL預冷PBS重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，吸除上清，加入1 mL預冷70%乙醇，輕輕吹打混勻，4℃固定30 min。1 000 g離心5 min，吸除上清。每管細胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，輕柔并充分重懸細胞沉淀， 37℃避光孵育30 min。流式細胞儀上機檢測。

1.8 細胞凋亡檢測

用不含EDTA的胰酶常規(guī)消化細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。取1×105個重懸的細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，流式細胞儀上機檢測。

1.9 細胞劃痕實驗

用記號筆在6孔板背后用直尺均勻地劃橫線，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。在6孔板中種植1×106個細胞，培養(yǎng)細胞至匯合度達到90%以上。用200 μL槍頭沿著直尺，垂直于背后的橫線劃痕。PBS漂洗3次后，加入無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。分別于0 h和24 h后顯微鏡下觀察并拍照。

1.10 Transwell侵襲實驗

在4℃條件下將Matrigel基質(zhì)膠與DMEM培養(yǎng)基按比例稀釋(1∶4)，取100 μL混合液均勻覆蓋Transwell小室聚碳酸酯膜表面，37℃靜置1 h，使凝膠凝固。用DMEM培養(yǎng)基將待測細胞制成密度為5×105/mL的細胞懸液。在24孔板內(nèi)加入650 μL 含 20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，取100 μL細胞懸液加入Transwell小室內(nèi)，置于37℃培養(yǎng)箱孵育48 h。取出小室，用棉簽輕輕拭去小室膜上表面細胞。4%多聚甲醛固定30 min。棄去固定液，將小室浸泡于0.2%結(jié)晶紫染色液10 min，清水漂洗小室三次。待小室風干后，在高倍顯微鏡下選取5個視野觀察細胞并計數(shù)。

1.11 Western blot檢測MAPK信號通路變化

具體步驟詳見1.5，其中所用一抗分別為兔抗人p-P38單克隆抗體(1∶500)、兔抗人P38單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人p-ERK單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人ERK單克隆抗體(1∶1 000)。

1.12 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均值±標準差表示，t檢驗比較兩組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 NOD1-siRNA干擾BPCPA細胞中NOD1表達

通過轉(zhuǎn)染siRNA，干擾甲狀腺癌細胞BPCPA中NOD1的表達水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，siNOD1組細胞中NOD1 mRNA表達水平較siNC組細胞顯著下降(0.194±0.059vs1.00±0.000，t=19.220，P<0.001，圖1A)，抑制率達80.63%±5.93%。Western blot結(jié)果顯示，siNOD1組細胞中NOD1蛋白表達水平顯著低于siNC組(0.073±0.020vs0.352±0.040，t=8.852，P<0.001，圖1B)，抑制率達78.03%±5.64%。

圖1 轉(zhuǎn)染NOD1-siRNA后NOD1在BPCPA細胞中的表達

2.2 NOD1對BPCPA細胞增殖的影響

利用EdU增殖實驗檢測干擾NOD1后甲狀腺癌細胞BPCPA增殖能力的變化。熒光顯微鏡下，藍色熒光為細胞核，綠色熒光為EdU陽性細胞。結(jié)果顯示，siNOD1組中EdU陽性細胞比例(76.41%±3.75%)相較于siNC組細胞(28.75%±3.79%)顯著升高(t=4.751，P<0.001，圖2)，說明siNOD1組中處于增殖狀態(tài)的細胞多于siNC組。

圖2 NOD1表達對BPCPA細胞增殖能力的影響

2.3 NOD1對BPCPA細胞周期的調(diào)控

通過流式細胞儀探究干擾NOD1對甲狀腺癌細胞BPCPA細胞周期的影響。結(jié)果顯示，干擾NOD1表達后，siNOD1組較siNC組G1期細胞比例降低(55.38%±3.11%vs66.23%±4.28%)，S和G2/M期細胞比例增加(36.00%±3.49%vs22.41%±2.87%，10.92%±1.08%vs6.84%±0.50%)，差異具有統(tǒng)計學意義(G1，t=2.902，P=0.044；S，t=4.249，P=0.013；G2/M，t=4.859，P=0.010，圖3)。

圖3 NOD1表達對BPCPA細胞周期的影響

2.4 NOD1對BPCPA細胞凋亡的影響

利用流式細胞儀檢測NOD1對甲狀腺癌細胞BPCPA凋亡的調(diào)控作用。結(jié)果顯示， siNOD1組的凋亡細胞比例(8.47%±0.61%)和siNC組細胞(8.74%±1.03%)的差異無統(tǒng)計學意義(t=0.322，P=0.763，圖4)。

圖4 干擾NOD1表達對BPCPA細胞凋亡的影響

2.5 NOD1對BPCPA細胞運動能力的作用

細胞劃痕實驗檢測NOD1表達減少后甲狀腺癌細胞BPCPA運動能力的變化。劃痕24 h后，siNOD1組細胞愈合距離多于siNC組細胞[(609.33±41.11)μmvs(316.63±24.05)μm，t=8.691，P=0.001，圖5]。

圖5 NOD1表達對BPCPA細胞運動能力的影響

2.6 NOD1對BPCPA細胞侵襲能力的調(diào)控

Transwell侵襲實驗檢測干擾NOD1表達對甲狀腺癌細胞BPCPA侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，siNOD1組穿過小室的數(shù)量為(545.3±24.5)個，顯著多于siNC組(392.3±17.6)個，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.060，P=0.007，圖6)。

圖6 NOD1表達對BPCPA細胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色)

2.7 NOD1對MAPK信號通路的調(diào)控作用

通過Western blot檢測NOD1對MAPK信號通路的影響。結(jié)果顯示，siNOD1組細胞的p-P38和p-ERK表達水平較siNC組顯著升高(p-P38，1.196±0.045vs0.357±0.030，t=21.961，P<0.001；p-ERK，0.764±0.039vs0.219±0.038，t=14.265，P<0.001)，P38和ERK表達水平無顯著變化(P38，0.818±0.047vs0.844±0.036，t=0.623，P=0.567；ERK，0.927±0.054vs0.974±0.082，t=0.685，P=0.531，圖7)。

圖7 NOD1表達對MAPK信號通路的影響

3 討 論

NOD1是一種模式識別受體，負責感知先天免疫中的致病肽。NOD1可誘導細胞內(nèi)信號通路的激活，導致促炎反應(yīng)和抗菌反應(yīng)，因此NOD1被認為能夠維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)[5]。隨著研究的深入，NOD1對腫瘤的影響越來越受到重視。人透明細胞腎細胞癌腫瘤組織中NOD1的表達低于健康腎組織，而肝細胞癌細胞中NOD1相較于正常肝細胞則是高表達的[4, 6]。但Ma等[2]卻發(fā)現(xiàn)NOD1在肝癌組織中低表達，且可通過抑制MAPK信號通路抑制肝細胞癌的增殖并增強其對化療的敏感性。亦有報道稱激活的NOD1有助于胃癌的發(fā)展[7]。以上研究表明NOD1可能在惡性腫瘤的進展中發(fā)揮雙重作用。目前NOD1在甲狀腺癌中的作用尚不清楚。

Ma等[2]發(fā)現(xiàn)NOD1通過增加P21蛋白水平，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，從而顯著抑制了肝癌細胞的增殖。P21被認為是一種新型的腫瘤抑制因子，在G1檢查點抑制細胞周期蛋白，抑制細胞周期從G1期向S期過渡[8]。本研究通過靶向NOD1的siRNA干擾甲狀腺癌細胞中NOD1的表達，發(fā)現(xiàn)降低NOD1表達水平可促進甲狀腺癌細胞的增殖。通過檢測細胞周期，本研究發(fā)現(xiàn)干擾NOD1表達可導致細胞加速從G1期進入S期，進而增加G2/M期細胞的比例。以上結(jié)果表明干擾NOD1可通過減少G1期阻滯促進甲狀腺癌細胞增殖，與已有文獻結(jié)果相似。不同腫瘤中NOD1對癌細胞凋亡的影響是不一致的。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)NOD1的激活促進了HPV16陽性宮頸癌細胞的凋亡。在肝癌中，抑制NOD1通路可誘導SMMC-7721和HepG2凋亡[4]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾NOD1表達后甲狀腺癌細胞的凋亡并未發(fā)生顯著變化，NOD1對甲狀腺癌細胞的凋亡可能無直接調(diào)節(jié)作用，具體機制仍需進一步研究。

腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)是甲狀腺癌患者預后不良的主要因素，而NOD1在調(diào)控腫瘤細胞運動和侵襲中發(fā)揮重要作用。Jiang等[3]證明NOD1的激活可能促進結(jié)腸癌細胞的黏附、遷移和轉(zhuǎn)移。存在淋巴血管侵襲的宮頸癌組織中的NOD1表達高于原位癌組織，NOD1通過激活NF-κB和ERK信號通路促進鱗狀宮頸癌的形成和轉(zhuǎn)移[10]。此外，NOD1在卵巢腫瘤中的表達顯著上調(diào)，且在轉(zhuǎn)移性腫瘤組織中的表達高于非轉(zhuǎn)移性腫瘤[11]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾NOD1表達后，甲狀腺癌細胞BPCPA的運動和侵襲能力增強，說明NOD1在甲狀腺癌轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮抑制性作用。

NOD1可通過與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(serine/threonine protein kinase 2， RIP2)相互作用，參與下游信號通路的激活[12]。RIP2是一種控制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和凋亡的蛋白激酶，并作為NOD1信號通路的下游中介[13]。RIP2被E3連接酶泛素化，激活抑制因子I-kappa B激酶(I-kappa B kinase，IKK)復合物和TGF-β活化激酶1(TGF-beta-activated kinase 1，TAK1)[14-15]。TAK1與IKK復合體相互作用，與P38和JNK結(jié)合，從而調(diào)控MAPK信號通路[16]。SRC是一種非受體蛋白-酪氨酸激酶，其過度激活與晚期疾病進展相關(guān)[17]。研究表明，NOD1通過抑制SRC磷酸化和SRC-MAPK軸發(fā)揮其抗腫瘤作用[2]。本研究檢測了NOD1表達改變后MAPK信號通路的變化，發(fā)現(xiàn)干擾NOD1表達可提高p-P38和p-ERK水平，表明NOD1通過降低MAPK信號通路磷酸化抑制甲狀腺癌細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，干擾NOD1表達可促進甲狀腺癌細胞BPCPA的增殖、運動和侵襲，對細胞凋亡無影響，并降低MAPK信號通路磷酸化水平，表明NOD1可減少MAPK信號通路磷酸化進而抑制甲狀腺癌增殖和轉(zhuǎn)移。本研究為探討NOD1在甲狀腺癌中的作用提供了新視角，為甲狀腺癌患者的治療策略提供了新的理論依據(jù)。

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