印雙紅，張先姝，朱 志，張孟琴，張俊波,3，毛 宏，易 萌，易彩霞，蔡春連

(1.銅仁學(xué)院大健康學(xué)院，貴州銅仁 554300；2.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州銅仁 554300；3.銅仁學(xué)院，貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室，貴州銅仁 554300；4.銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州銅仁 554300；5.銅仁學(xué)院大數(shù)據(jù)學(xué)院，貴州銅仁 554300)

鱘是軟骨硬鱗魚，有“水中活化石”之稱，全球現(xiàn)存2科6屬27種，均處于不同程度的瀕危狀態(tài)。雜交鱘(♀×)是亞冷性魚類，具有生長快、肉質(zhì)鮮美和營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，是我國主要的鱘魚養(yǎng)殖品種，深受消費者喜愛，養(yǎng)殖前景廣闊。

天然中草藥中的有效成分復(fù)雜，除含有抗菌、免疫物質(zhì)外，還含有一些未知的促生長的活性物質(zhì)及一定量的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，這些成分可以增強食欲、促進機體代謝和消化酶分泌、提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率和降低水產(chǎn)動物的飼料系數(shù)。二氫楊梅素也稱雙氫楊梅素，是藤茶中的主要活性成分，化學(xué)名為苯并二氫吡喃-4-酮，分子式為CHO。研究表明二氫楊梅素具有消炎、鎮(zhèn)痛、增強免疫力、抗氧化和抑菌等作用。二氫楊梅素在畜禽生長方面有較多的研究，而對雜交鱘生長性能、血清指標、肌肉品質(zhì)等方面的影響尚未見報道。因此，本實驗以雜交鱘幼魚為研究對象，研究二氫楊梅素對雜交鱘幼魚生長性能、血清生化及免疫指標、肌肉常規(guī)成分及氨基酸組成、腸道消化酶活性及微生物多樣性的影響，為開發(fā)雜交鱘高效綠色環(huán)保飼料和二氫楊梅素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

二氫楊梅素(含量98%)購于貴州苗藥生物技術(shù)有限公司。配制4種飼料(表1)：基礎(chǔ)飼料組(D0)、0.15%二氫楊梅素組(D1)、0.3%二氫楊梅素組(D2)和0.6%二氫楊梅素組(D3)。原料粉碎過60目篩，逐級混勻，制成粒徑為1.5 mm的顆粒飼料，室溫通風(fēng)干燥后，在-20 ℃冰柜存放。

表1 實驗飼料配方及營養(yǎng)組成Tab.1 Formula and nutritional composition of experimental diets %

雜交鱘幼魚購于貴州省松桃吉光農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司。實驗前將雜交鱘幼魚在水箱中馴養(yǎng)7 d。挑選(33.02±1.39)g/尾的180尾雜交鱘隨機分配到12個水箱(120 cm×40 cm×40 cm)中，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15尾魚。日投餌量為魚體質(zhì)量的2.0%～4.0%，投喂時間分別為08:00、14:00和20:00，每天換水1次，換水量為1/3，從2020年10月5日開始，養(yǎng)殖周期為60 d，實驗期間溶解氧大于5 mg/L，氨氮小于0.05 mg/L，pH 7.5～8.0，水溫為18.1～21.7 ℃；換水前后溫差小于1 ℃。

1.2 樣品的采集

實驗魚禁食24 h后，統(tǒng)計魚的數(shù)量和體重，以計算生長指標。每箱隨機取3尾魚，用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(120 mg /L)進行麻醉，從尾靜脈采血，將血樣置于試管中，于4 ℃條件下放置1 h，以3 500 r/min離心10 min，將上層血清分裝于離心管中，用于測定血清的生化和免疫指標；取其背部肌肉用以測定肌肉常規(guī)成分及氨基酸組成；取其前腸，PBS沖洗，截取中間部分0.5 cm左右放入Bouin固定液中，制作腸道切片。為測定消化酶的活性，每箱隨機取3尾魚，取其整個腸道，稱重，再加入9倍體積0.86%的預(yù)冷生理鹽水，用勻漿機磨成勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得待測樣品。為研究腸道菌群，每箱隨機取3尾魚，取其腸道內(nèi)容物，迅速將樣品放入液氮中保存。

1.3 生長指標的測定

生長指標計算公式為：

增重率(WGR)=100%×(-)；

特定生長率(SGR)=100%×(ln-ln)/t；

成活率(SR)=(/)×100%，

式中，為終末體質(zhì)量(g)；為初始體質(zhì)量(g)；為實驗時間(d)；為終末尾數(shù)；為初始尾數(shù)。

1.4 肌肉常規(guī)成分的測定

粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、水分含量分別采用凱氏定氮法(GB/T 6432-1994)、索氏抽提法(GB/T 6433-1994)、550 ℃灼燒法(GB/T6438-1992)、105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435-2006)進行測定。

1.5 腸道消化酶、血清生化及免疫指標的測定

蛋白酶活力采用福林-酚試劑法測定，脂肪酶、淀粉酶、血清生化及免疫指標均采用南京建成試劑盒測定。

1.6 腸道組織切片制備及觀察

制作腸道組織切片，利用Image pro plus 6.0軟件統(tǒng)計分析皺襞高度和肌層厚度。

1.7 氨基酸組成的測定

酸水解法處理肌肉，氨基酸分析參照國家標準(GB/T 5009.124-2003)，由日立L-8900型全自動氨基酸分析儀測定17種氨基酸的組成。

1.8 腸道微生物菌群分析

提取樣品總DNA并送北京百邁客生物科技有限公司進行建庫和高通量測序。

1.9 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果采用統(tǒng)計軟件SPSS25.0中的單因素方差分析(ANOVA)、最小顯著極差法(LSD)和Duncan′s多重比較法進行差異顯著性分析，所有結(jié)果均以平均值±標準差(mean±SD)表示，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘生長性能的影響

如表2所示，與D0相比，D3雜交鱘的增重率和特定生長率均顯著降低，其它各組間無顯著性差異；各組雜交鱘的成活率無顯著性差異。

表2 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘生長性能的影響Tab.2 Effects of dietary dihydromyricetin levels on the growth of hybrid sturgeon

2.2 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘血清生化及免疫指標的影響

2.2.1 血清生化指標的測定

如表3所示，D1血清中總膽固醇、白蛋白和葡萄糖水平均顯著高于D0；D2血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著低于D0，而白蛋白和葡萄糖水平均顯著高于D0；D3血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白和甘油三酯水平均顯著高于D0。

表3 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘血清生化指標的影響Tab.3 Effects of dietary dihydromyricetin levels on serum biochemical indexes of hybrid sturgeon

2.2.2 血清免疫指標的測定

如表4所示，各實驗組血清中堿性磷酸酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和總抗氧化能力均顯著高于D0；并且，D3血清中堿性磷酸酶活性顯著高于D2，D1和D2血清中谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于D3，D2血清中超氧化物歧化酶活性顯著均高于D1和D3。D2和D3血清中溶菌酶活性均顯著高于D1和D0。

表4 飼料二氫楊梅素水平對血清免疫指標的影響Tab.4 Effects of dietary dihydromyricetin levels on serum immune indexes of hybrid sturgeon

2.3 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘腸道消化酶活性的影響

如表5所示，D1和D2腸道中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均顯著高于D0；D3腸道中蛋白酶活性顯著高于D0。D2腸道中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均顯著高于D1和D3。

表5 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘腸道消化酶的影響Tab.5 Effects of dietary dihydromyricetin levels on digestive enzymes in the intestine of hybrid sturgeon

2.4 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘腸道形態(tài)的影響

如表6所示，D1腸道皺襞高度顯著高于對照組，而D2和D3相對于D0無顯著性差異；各實驗組腸道肌層厚度均無顯著性差異。

表6 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘腸道形態(tài)的影響Tab.6 Effects of dietary dihydromyricetin levels on the intestinal morphology of hybrid sturgeon μm

2.5 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘肌肉常規(guī)成分及氨基酸組成的影響

2.5.1 肌肉常規(guī)成分的測定

如表7所示，各組間肌肉中水分、粗脂肪、粗蛋白和粗灰分的含量均無顯著性差異。

表7 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘肌肉常規(guī)成分的影響Tab.7 Effects of dietary dihydromyricetin levels on the muscle components of hybrid sturgeon %

2.5.2 氨基酸組成的測定

如表8所示，各組雜交鱘肌肉中所含氨基酸種類齊全，均檢測到17種氨基酸，其中含有人體必需氨基酸7種，包括蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸，總氨基酸含量為211.37～224.23 mg/g，其中D1含量最高；必需氨基酸含量為5.45～22.35 mg/g，其中賴氨酸含量最高；鮮味氨基酸含量為11.50～34.43 mg/g，其中谷氨酸含量最高；各組間肌肉中總氨基酸、必需氨基酸和鮮味氨基酸的含量均無顯著性差異。

表8 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘肌肉氨基酸組成的影響Tab.8 Effects of dietary dihydromyricetin levels on the amino acid composition of the muscle of hybrid sturgeon mg/g

2.6 飼料二氫楊梅素水平對雜交鱘腸道微生物多樣性的影響

2.6.1 腸道樣本測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

如表9和圖1所示，各組腸道內(nèi)容物樣本共獲得825 863條序列，1 216個OTUs，其中有重疊OTUs 684個，占該總數(shù)的56.25%，因此，飼喂不同水平二氫楊梅素的雜交鱘腸道細菌群落具有一個核心的微生物菌群。

表9 樣本16S rDNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.9 Statistics of 16S rDNA sequencing data of samples

圖1 腸道菌群OTU韋恩圖Fig.1 OTU Venn diagram of intestinal flora

2.6.2 腸道菌群Alpha多樣性分析

如表10所示，各組間的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均無顯著性差異；各組的覆蓋率均在99%以上，表明已覆蓋到樣品中所有的物種。

表10 樣品的菌群多樣性指數(shù)Tab.10 Alpha-diversity of samples

2.6.3 門分類水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示，各組腸道菌群在分類學(xué)上主要歸屬于9個門，分別是藍細菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、衣原體門(Chlamydiae)、螺旋體門(Spirochaetes)、放線菌門(Acidobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)；D0(Control)的優(yōu)勢菌門為藍細菌門和軟壁菌門，D1(TCC1)的優(yōu)勢菌門為藍細菌門和厚壁菌門，D2(TCC2)和D3(TCC3)的優(yōu)勢菌門均為藍細菌門和變形菌門；各組間優(yōu)勢菌門的組成比例存在差異。

圖2 門水平進行腸道菌群結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structural analysis of phylum levels of intestinal flora

3 討論

二氫楊梅素可提高畜禽生長和生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化率，研究表明，日糧中添加0.05%二氫楊梅素顯著提高肉雞飼料轉(zhuǎn)化率；飼料中添加0.075%～0.25%二氫楊梅素對鯉(L.)生長性能及形態(tài)指標均有促進作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，0.15%和0.3%組不影響雜交鱘生長指標，而0.6%組抑制雜交鱘的生長指標。

飼料中粗脂肪水平或能量水平與粗蛋白水平的關(guān)系決定著魚類的生長。飼料中脂肪含量過高會造成魚體內(nèi)脂肪蓄積，對魚體的增重產(chǎn)生負作用。機體氨基酸平衡狀況決定了蛋白質(zhì)的生物學(xué)價值，被食用肌肉中氨基酸組成比例和人體蛋白質(zhì)氨基酸組成比例越接近，它的生物學(xué)價值越高。飼料的差異會影響魚類氨基酸的組成和蛋白質(zhì)的合成。研究表明，不同濃度的二氫楊梅素不影響鯉肌肉品質(zhì)中的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分、總氨基酸含量，與本次實驗得到的結(jié)果一致，表明二氫楊梅素也不影響雜交鱘的肌肉品質(zhì)。

水產(chǎn)動物消化酶的活力與養(yǎng)殖動物的品種、生長階段、環(huán)境、飼料組成等因素密切相關(guān)。日糧中添加二氫楊梅素0.025%、0.05%和0.1%可提高肉仔雞()的消化酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶)的活性，并以添加0.1%二氫楊梅素的提高效果最佳。飼料中添加0.25%二氫楊梅素可以極顯著提高鯉魚腸道蛋白酶活性。本實驗發(fā)現(xiàn)，0.15%和0.3%組腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均顯著升高，表明二氫楊梅素可顯著提高雜交鱘消化酶活性。

血液生化指標的改變可反映動物機體的生理變化情況。血清甘油三酯和膽固醇水平能夠反映出機體對脂類代謝狀況，其含量的升高說明機體脂質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，甘油三酯和膽固醇水平升高是肝功能損傷的標志。本實驗發(fā)現(xiàn)，0.3%組甘油三酯和總膽固醇水平無顯著性變化，表明0.3%二氫楊梅素對雜交鱘幼魚肝臟無損傷。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是肝臟細胞中活性最強、分布最廣的轉(zhuǎn)氨酶，如果肝臟出現(xiàn)病變，肝細胞通透性會增大，酶即釋放于血清中，因此血漿中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量可以作為肝功能的檢測指標。日料中添加不同劑量的二氫楊梅素可提高瑤山雞血清白蛋白含量，降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，提高溶菌酶活性。本實驗發(fā)現(xiàn)，0.15%組谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性無顯著性變化；0.3%組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低，同時谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性無顯著性變化，表明0.15%和0.3%二氫楊梅素對雜交鱘幼魚肝臟無損傷。

動物體內(nèi)的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶主要來源于肝臟，是機體代謝過程中重要的調(diào)控酶，常作為評價非特異性免疫性能的重要指標，其活性降低會導(dǎo)致非特異性免疫性能下降。本實驗發(fā)現(xiàn)，各實驗組血清中堿性磷酸酶均顯著升高，表明二氫楊梅素可提高雜交鱘的非特異性免疫性能。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是存在生物體內(nèi)非常重要的抗氧化防御性功能酶，保護機體免受氧化傷害。本實驗發(fā)現(xiàn)，各實驗組血清中超氧化物歧化酶活性均顯著升高，表明二氫楊梅素可提高雜交鱘幼魚的抗過氧化損傷能力。

腸道菌群既可以代謝機體的營養(yǎng)物質(zhì)，又可以與機體相互作用產(chǎn)生各種代謝物質(zhì)，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物既能影響飼料營養(yǎng)素的高效利用，又能調(diào)控宿主的正常生理功能。研究表明，二氫楊梅素可不同程度改變小鼠()腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性，二氫楊梅素可提高小鼠體內(nèi)擬桿菌門與厚壁菌門的相對豐度比值。本實驗發(fā)現(xiàn)，不同水平的二氫楊梅素對雜交鱘腸道優(yōu)勢菌門有一定的影響。

綜上所述，0.3%組的雜交鱘免疫水平增加且肝臟無損傷，因此，雜交鱘飼料中二氫楊梅素的建議添加量為0.3%。