鞏 政，劉艷超，馬聰敏，李小兵

(1.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東棗莊 277160；2.水利部中國(guó)科學(xué)院水工程生態(tài)研究所水利部水工程生態(tài)效應(yīng)與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072；3.西藏自治區(qū)高原生物研究所，拉薩850000；4.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，重慶 402460)

雅魯藏布江是西藏地區(qū)最大的河流，也是世界上海拔最高的大河，它發(fā)源于喜馬拉雅西段北麓的杰馬央宗冰川，由西向東橫貫西藏南部，隨后沿喜馬拉雅山東麓急轉(zhuǎn)南下，在巴昔卡流出國(guó)境進(jìn)入印度。雅魯藏布江全長(zhǎng)2 229 km，流域面積達(dá)239 228 km，源頭至里孜段為其上游，派鎮(zhèn)以下至巴昔卡為下游，從里孜至派鎮(zhèn)全長(zhǎng)1 340 km的河段則屬于雅魯藏布江中游。中游江段流域環(huán)境獨(dú)特且復(fù)雜多樣，孕育出異齒裂腹魚(′)、巨須裂腹魚()和黑斑原鮡()等雅魯藏布江流域特有物種。然而，近十幾年來(lái)，作為西藏人口和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展最為密集的區(qū)域，在人類活動(dòng)干擾、外來(lái)魚類入侵、水電開發(fā)和全球氣候變化等因素的影響下，雅魯藏布江中游魚類的生活史特征、遺傳多樣性及群落結(jié)構(gòu)等方面均發(fā)生重要變化，引發(fā)廣泛關(guān)注。

高原鰍屬()隸屬于鯉形目(Cypriniformes)條鰍科(Nemacheilidae)，現(xiàn)知FishBase數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄超過(guò)180個(gè)有效種或亞種，是條鰍科中最大的類群，并與鯉形目鯉科的裂腹魚類和鲇形目鮡科的鰋鮡魚類共同組成了適應(yīng)青藏高原高寒環(huán)境的三大魚類類群。已知分布于雅魯藏布江流域的高原鰍屬魚類包括短尾高原鰍()、東方高原鰍()、細(xì)尾高原鰍()、異尾高原鰍()、斯氏高原鰍()和西藏高原鰍()等6種。短尾高原鰍的模式產(chǎn)地為青海省達(dá)布遜鹽湖水系，目前被認(rèn)為分布于包括雅魯藏布江在內(nèi)的青藏高原及其毗鄰的各水系中，相關(guān)魚類資源調(diào)查研究表明短尾高原鰍廣泛分布于雅魯藏布江中游流域且種群規(guī)模較大。然而，目前對(duì)于該流域短尾高原鰍包括遺傳多樣性在內(nèi)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究報(bào)道十分匱乏。

脊椎動(dòng)物的線粒體DNA(mtDNA)基因組分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，進(jìn)化速率較核基因快且嚴(yán)格遵循母系遺傳，在遺傳多樣性分析中可選取其中特定基因片段，基于堿基位點(diǎn)的突變分析其遺傳變異的程度并推測(cè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)。線粒體細(xì)胞色素b(b)基因以其進(jìn)化速率較快和易于擴(kuò)增測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于種內(nèi)或種間的遺傳變異分析中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)雅魯藏布江中游不同支流中生活的短尾高原鰍b基因序列的測(cè)定，分析其遺傳多樣性現(xiàn)狀，檢測(cè)群體間分化水平，追溯其種群歷史動(dòng)態(tài)，進(jìn)而為該物種提供生物學(xué)資料，為物種保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

分別于2020年5-6月和2021年8月在雅魯藏布江中游10條支流中采集短尾高原鰍樣本，共計(jì)125尾。剪取樣本背部右側(cè)肌肉或?qū)⑵湔w固定于無(wú)水乙醇中，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于-20 ℃冰箱中備用。采樣點(diǎn)的樣本量及分布信息見表1和圖1。

表1 雅魯藏布江中游短尾高原鰍的樣本采集信息Tab.1 Sample data of T.brevicauda collected from the middle Yarlung Tsangpo River

圖1 雅魯藏布江中游短尾高原鰍的采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Map showing the sampling sites of T.brevicauda in the middle Yarlung Tsangpo River

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

DNA提取采用略微改進(jìn)的高鹽抽提法，分子標(biāo)記b基因擴(kuò)增和測(cè)序的引物為L(zhǎng)14724和H15915。PCR反應(yīng)體系為30 μL，包括3 μL的10 × Buffer，1.5 μL dNTPs，上下游擴(kuò)增引物各1 μL，0.25 μL的TaqDNA聚合酶和30～50 ng DNA模板，然后加入雙蒸水標(biāo)定體積。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性4 min；進(jìn)入反應(yīng)循環(huán)：95 ℃變性45 s，54～56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用8%的瓊脂糖電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶，擴(kuò)增成功后送至武漢擎科生物有限公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)定的短尾高原鰍b序列使用Clustal X v2.0軟件進(jìn)行比對(duì)，并在SEAVIEW軟件中參照序列峰圖進(jìn)行人工校正。使用MEGA v6.0軟件將基因序列翻譯成氨基酸序列進(jìn)行勘誤，并計(jì)算序列中堿基組成、變異位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)換()顛換()比值等參數(shù)。利用DnaSP v5.1軟件分析短尾高原鰍的遺傳多樣性指數(shù)，包括單倍型數(shù)目()、單倍型多樣性()和核苷酸多樣性()等。

采用貝葉斯推斷(Bayesian inference，BI)和最大似然法(Maximum likelihood，ML)分別重建單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹。首先在PhyloSuite v1.2軟件PartitionFinder v2.1模塊中基于修正的赤池信息準(zhǔn)則(corrected Akaike information criterion，AICc)和密碼子分區(qū)篩選核苷酸替換模型，得到的最佳模型用于下一步系統(tǒng)樹的構(gòu)建中。貝葉斯樹的構(gòu)建在MrBayes v3.1軟件中實(shí)現(xiàn)；最大似然樹的構(gòu)建在RaxML v8.0軟件中實(shí)現(xiàn)。利用popart 1.7軟件中的TSC方法繪制單倍型的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖，分析單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。使用Arlequin v3.5軟件檢測(cè)不同地理群體間遺傳分化指數(shù)()，基于分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)估算群體遺傳結(jié)構(gòu)和地理群體遺傳變異的分布。

種群歷史動(dòng)態(tài)分析使用Arlequin v3.5軟件對(duì)各群體和總體進(jìn)行中性檢驗(yàn)，計(jì)算Tajima′s和Fu′s值兩項(xiàng)參數(shù)；錯(cuò)配分布分析基于粗糙指數(shù)(Harpending′s raggedness index，)和偏差平方和()衡量結(jié)果與預(yù)期模型是否相符合及其顯著性水平。使用BEAST v1.8軟件進(jìn)行種群動(dòng)態(tài)的貝葉斯天際線(Bayesian Skyline Plot，BSP)分析：采用鯉形目魚類常用的進(jìn)化速率(0.01/ma)，堿基替換模型選擇GTR模型，Number of Gamma Categories設(shè)為6，選擇Coalescent Bayesian Skyline模型作為點(diǎn)圖模型，馬爾科夫鏈(MCMC)的長(zhǎng)度為100 000 000；最后在Tracer v1.5軟件中構(gòu)圖。

2 結(jié)果

2.1 Cyt b基因序列堿基組成與變異

對(duì)125尾短尾高原鰍的線粒體b基因序列進(jìn)行比對(duì)校正后，獲得長(zhǎng)度為1 140 bp的序列集，起始密碼子為ATG，中止密碼子為GCT，未檢測(cè)到堿基的插入或缺失。

基于短尾高原鰍的b序列集檢測(cè)到堿基變異位點(diǎn)共95個(gè)，其中70個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)；全部個(gè)體的平均堿基組成為A=27.0%，T=29.4%，C=26.9%，G=16.7%，A+T的含量(56.4%)高于C+G(43.6%)，堿基組成具有強(qiáng)烈的反G偏倚(bias)，其中堿基G在密碼子第三位的含量尤其低(10.7%)；序列的轉(zhuǎn)換和顛換均未達(dá)飽和，轉(zhuǎn)換數(shù)明顯大于顛換數(shù)，平均值為10.26。

2.2 遺傳多樣性

從125尾個(gè)體中檢測(cè)到52個(gè)單倍型，總體單倍型多樣性與核苷酸多樣性分別為0.953±0.010和0.010 51±0.001 04。具體而言，單倍型多樣性最低的是扎繞河群體(0.600±0.175)，最高的是那姆曲群體(0.900±0.161)；核苷酸多樣性最低的是尼洋河群體(0.001 87±0.000 40)，最高的是那姆曲群體(0.019 65±0.003 36)。短尾高原鰍各地理群體的序列變異情況和遺傳多樣性指數(shù)見表2。

表2 基于Cyt b基因序列的雅魯藏布江中游短尾高原鰍的遺傳多樣性Tab.2 Genetic diversity of T.brevicauda in the middle Yarlung Tsangpo River based on Cyt b gene sequences

以分布于雅魯藏布江中游的另外兩種高原鰍屬魚類：細(xì)尾高原鰍和異尾高原鰍作為外類群，采用BI法和ML法重建的短尾高原鰍單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，在系統(tǒng)樹中所有單倍型可被劃分為5支譜系(圖2)。其中，譜系I規(guī)模最大，其中包含的33個(gè)單倍型分布于除拿窩蒲曲和絲波絨曲以外的其他所有群體中；此外，譜系I中還包含若干亞譜系。譜系II中包含的5個(gè)單倍型分布于絲波絨曲、腳布朗曲和里龍普曲3個(gè)群體中。譜系III中包含的6個(gè)單倍型僅分布于尼洋河群體中。譜系IV中包含的5個(gè)單倍型分布于尼木瑪曲、拉薩河和絲波絨曲3個(gè)群體中。譜系V中包含的3個(gè)單倍型分布于尼木瑪曲、腳布朗曲、拿窩蒲曲和那姆曲4個(gè)群體中。

圖2 基于Cyt b基因序列單倍型構(gòu)建的雅魯藏布江中游短尾高原鰍的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of T.brevicauda in the middle Yarlung Tsangpo River based on Cyt b gene sequence haplotypes

基于TCS法構(gòu)建的單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖顯示：52個(gè)單倍型中有47個(gè)單倍型為單一群體所獨(dú)享，僅有少數(shù)單倍型(例如H2)為多個(gè)群體所共享(圖3)。系統(tǒng)發(fā)育分析檢測(cè)出的5支譜系所屬單倍型之間堿基突變大都超過(guò)十步；而在譜系內(nèi)部相鄰單倍型之間往往僅經(jīng)歷一到兩步的堿基突變，多個(gè)單倍型通過(guò)缺失的中間單倍型連接。

圖3 基于Cyt b基因序列的雅魯藏布江中游短尾高原鰍單倍型的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Evolutionary network of T.brevicauda in the middle Yarlung Tsangpo River inferred from Cyt b gene haplotype frequencies

2.3 群體間遺傳分化

不同地理群體兩兩配對(duì)計(jì)算得到的范圍為-0.057～0.605(表3)，大部分群體之間的遺傳分化指數(shù)呈現(xiàn)示出顯著或極顯著水平，少數(shù)群體間未檢測(cè)出遺傳分化。其中，尼木瑪曲群體與其他群體之間的最大(0.467～0.605)且均為顯著或極顯著水平；拿窩蒲曲群體、扎繞河群體與其他群體之間遺傳分化指數(shù)最小(-0.016～0.525，-0.057～0.566)，且部分群體間的檢測(cè)結(jié)果未達(dá)到顯著性水平。

表3 雅魯藏布江中游10個(gè)地理群體短尾高原鰍的FSTTab.3 The FST between 10 populations of T.brevicauda in the middle Yarlung Tsangpo River

AMOVA分析結(jié)果顯示，在不分組的情況下遺傳變異主要來(lái)自于群體內(nèi)部，占比為62.1%；群體間的遺傳變異相對(duì)較小，占比為37.9%，表明遺傳多樣性主要產(chǎn)生于個(gè)體間的遺傳變異，群體間的分化亦占有一定比例。根據(jù)楊漢運(yùn)等對(duì)雅魯藏布江中游不同江段河流形態(tài)的劃分，將10個(gè)群體劃分為3組(尼木瑪曲和拉薩河群體為一組，分布于曲水寬谷段；絲波絨曲、腳布朗曲、拿窩蒲曲、那姆曲和里龍普曲群體為一組，分布于加查峽谷段；扎繞河、南伊曲和尼洋河群體為一組，分布于米林寬谷段)，此時(shí)得到的組間變異占9.23%，組內(nèi)群體間變異占30.28%，群體內(nèi)變異占60.89%(表4)。

表4 雅魯藏布江中游10個(gè)地理群體短尾高原鰍的AMOVA分析Tab.4 Analysis of molecular variance analysis among ten populations of T.brevicauda in the middle Yarlung Tsangpo River

2.4 種群歷史動(dòng)態(tài)

中性檢驗(yàn)與核苷酸錯(cuò)配分析的結(jié)果見表5，中性檢驗(yàn)的結(jié)果顯示尼木瑪曲、拉薩河、尼洋河群體及總體的Tajima′值或Fu′s值均為顯著或極顯著的負(fù)值，而其他群體的Tajima′值或Fu′s值檢驗(yàn)結(jié)果均不顯著。核苷酸錯(cuò)配分析顯示，絲波絨曲、拿窩蒲曲、那姆曲、里龍普曲和扎繞河群體檢測(cè)出具有顯著或極顯著水平的和，其他群體的參數(shù)檢驗(yàn)均未達(dá)到顯著水平。對(duì)10條支流短尾高原鰍總體進(jìn)行BSP分析，結(jié)果顯示短尾高原鰍在1.12 kya出現(xiàn)過(guò)快速的種群擴(kuò)張，隨后又發(fā)生了急速的種群收縮(圖4)。

表5 雅魯藏布江中游短尾高原鰍地理群體的中性檢驗(yàn)和核苷酸錯(cuò)配分析Tab.5 Indices of neutral test and mismatch distribution analysis for T.brevicauda in the middle Yarlung Tsangpo River

圖4 基于Cyt b基因序列的雅魯藏布江中游短尾高原鰍的貝葉斯天際線分析Fig.4 Bayesian skyline plot analysis based on Cyt b gene sequences for T.brevicauda in the middle Yarlung Tsangpo River

3 討論

3.1 遺傳多樣性與群體分化

單倍型多樣性指數(shù)()與核苷酸多樣性指數(shù)()被認(rèn)為是衡量物種或群體遺傳多樣性水平高低的重要指標(biāo)。本研究中短尾高原鰍總體及尼木瑪曲、拉薩河、絲波絨曲、腳布朗曲、拿窩蒲曲和那姆曲群體≥0.5，≥0.005，表明這些地理群體和總體的遺傳結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定；而里龍普曲、扎繞河、南伊曲和尼洋河群體≥0.5，<0.005，表明這些群體在歷史上可能遭遇過(guò)遺傳瓶頸后又經(jīng)歷了種群擴(kuò)張。同雅魯藏布江中游異齒裂腹魚等其他魚類的基于b序列的遺傳多樣性指數(shù)相比，短尾高原鰍總體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均處于較高水平，遺傳結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖顯示，短尾高原鰍單倍型大致聚為5支譜系且未按照地理分布聚類，即10個(gè)地理群體的單倍型混雜分布于5支譜系中，不符合各支流群體的空間分布格局(個(gè)別譜系僅由單一群體的單倍型構(gòu)成：譜系III包含的單倍型僅分布于尼洋河群體中)。90.4%的單倍型僅出現(xiàn)在單一群體中，不同群體間共享的單倍型極少，這些暗示著雅魯藏布江中游的短尾高原鰍群體具有共同的祖先起源或曾經(jīng)發(fā)生過(guò)充分的遺傳交流，在較近的時(shí)期內(nèi)發(fā)生了種群收縮和遺傳分化。此外，單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖還顯示不同譜系的單倍型群組不具有占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)中心，僅在譜系局部存在少數(shù)單倍型呈中心放射狀分布，其他單倍型由它突變演化而來(lái)；例如譜系I中的H3和H29，推測(cè)這些單倍型為發(fā)揮過(guò)“奠基者效應(yīng)”的古老單倍型。

遺傳分化指數(shù)()可在一定程度上指示群體間基因交流和遺傳漂變的程度，是反映群體進(jìn)化歷史的重要參數(shù)。尼木瑪曲群體與其他9個(gè)群體之間均存在極顯著水平的高度分化(范圍為0.467～0.605)；部分群體之間未檢測(cè)具有顯著水平的遺傳分化，主要出現(xiàn)在拿窩蒲曲和扎繞河群體與其他少數(shù)群體之間，原因可能是這兩個(gè)群體樣本數(shù)量較少，后期需要增加樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。AMOVA分析同樣表明群體間的遺傳變異占據(jù)相當(dāng)比例，支持遺傳分化的結(jié)論。短尾高原鰍在雅魯藏布江中游不同支流群體間普遍存在高度遺傳分化，究其原因可能是由于短尾高原鰍是一種小型定居型魚類，沒有遷移洄游的習(xí)性，不同地理群體間基因交流的機(jī)會(huì)很少，局域種群在長(zhǎng)期獨(dú)立進(jìn)化過(guò)程中朝著不同方向發(fā)生遺傳漂變。

3.2 種群歷史動(dòng)態(tài)

中性檢驗(yàn)顯示部分群體的Tajima′值和Fu′s值均為顯著的負(fù)值，偏離了中性突變，表明三種魚類在近期應(yīng)該經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張事件，對(duì)應(yīng)的核苷酸錯(cuò)配分析中粗糙度指數(shù)和偏方差的檢驗(yàn)結(jié)果均不顯著，支持種群擴(kuò)張的推斷。對(duì)短尾高原鰍總體進(jìn)行BSP分析的結(jié)果顯示其在很近的歷史時(shí)期(約1.12 kya)經(jīng)歷過(guò)急速的種群擴(kuò)張和種群收縮。

種群的歷史動(dòng)態(tài)對(duì)區(qū)域地質(zhì)運(yùn)動(dòng)和氣候變化有著優(yōu)良的指示作用。相關(guān)地質(zhì)研究表明，青藏高原的隆升是決定雅魯藏布江河谷地貌形成的主要因素。雅魯藏布江中游寬谷與峽谷相間呈串珠狀分布，說(shuō)明雅魯藏布江流域的地質(zhì)構(gòu)造復(fù)雜多變，具體表現(xiàn)在峽谷江段主要是由地殼上升塑造而成，而寬谷江段主要是由局部地殼下降所導(dǎo)致。本研究的10條支流從上至下依次分布于曲水寬谷、加查峽谷和米林寬谷段，各自經(jīng)歷了不同類型和強(qiáng)度的地質(zhì)運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而影響著各江段內(nèi)的河流形態(tài)和水系格局。同時(shí)，全新世以來(lái)青藏高原出現(xiàn)過(guò)多次明顯的冰期和間冰期的冷暖波動(dòng)，且平均氣溫變化幅度以西藏南部地區(qū)為最大。末次冰盛期以后，青藏高原氣溫雖然整體上逐步回升，但仍存在多次波動(dòng)調(diào)整，氣候依舊不穩(wěn)定；例如在最近的2 ky，青藏高原先后出現(xiàn)了8次暖期和7次冷期。

作為一種適應(yīng)高原環(huán)境的小型魚類，短尾高原鰍主要棲息于雅魯藏布江各支流中，遷移能力弱，對(duì)于分布區(qū)內(nèi)的冷暖波動(dòng)、水系變遷等環(huán)境擾動(dòng)的響應(yīng)尤為敏感。結(jié)合種群動(dòng)態(tài)分析結(jié)果，我們認(rèn)為末次冰期以來(lái)青藏高原南部的氣候波動(dòng)可能通過(guò)改變短尾高原鰍在不同支流中的適合度，進(jìn)而影響其種群動(dòng)態(tài)；同時(shí)推測(cè)地質(zhì)活動(dòng)導(dǎo)致的水系變遷也是影響短尾高原鰍種群波動(dòng)的重要因素。

3.3 物種保護(hù)建議

本研究基于線粒體b基因序列分析了雅魯藏布江中游短尾高原鰍的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示各地理群體呈現(xiàn)較高的遺傳多樣性，不同地理群體間高度分化，共享單倍型極少。隨著雅魯藏布江干流多座梯級(jí)水電站的建設(shè)運(yùn)行，不同河段支流間的群體進(jìn)行基因交流變得更加困難。因此，為了防止小種群遺傳資源的喪失，在設(shè)置保護(hù)單元時(shí)應(yīng)該針對(duì)不同支流進(jìn)行分別管理和保護(hù)。同時(shí)，作為雅魯藏布江各支流中常見的高原鰍屬魚類，短尾高原鰍主要棲息于淺水礫石灘緩流水或靜水小潭等生境中。然而，隨著雅魯藏布江流域沿線公路、鐵路等工程的影響和外來(lái)物種的侵入，部分支流河道生境遭到破壞，外來(lái)魚類數(shù)量泛濫，短尾高原鰍種群生存受到嚴(yán)重威脅。

因此，我們建議對(duì)于諸如拉薩河、尼洋河等流量較大、生境類型豐富且已建有水利工程設(shè)施的支流，應(yīng)當(dāng)識(shí)別短尾高原鰍典型棲息地并劃定重點(diǎn)保護(hù)河段，對(duì)已遭破壞魚類保護(hù)河段進(jìn)行生態(tài)修復(fù)，同時(shí)進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)管和防范外來(lái)魚類進(jìn)入自然水體；對(duì)于其他流量較小、生境類型較為單一的支流，建議進(jìn)行整體保護(hù)，不做水利水電開發(fā)，盡可能減少人類活動(dòng)對(duì)河流生態(tài)環(huán)境造成的影響。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)短尾高原鰍的種群數(shù)量曾受到較近歷史時(shí)期內(nèi)氣候波動(dòng)的影響。因此，還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該物種遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的跟蹤監(jiān)測(cè)，及時(shí)完善和調(diào)整物種保護(hù)策略。