包 穎

生命科學(xué)與技術(shù)

月季RcNAC72基因的克隆及表達分析

包 穎

（唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000）

為揭示月季NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能，以月季“月月粉”生根的組培苗為材料克隆得到一個基因，命名為。生物信息學(xué)分析表明，基因全長為1 672 bp，開放閱讀框（ORF）為1 059 bp，可編碼353個氨基酸?；蛐蛄斜葘Πl(fā)現(xiàn)，RcNAC72在N端具有保守的結(jié)構(gòu)域，與草莓FvNAC72-like、桃PpNAC72、梅花PmNAC72-like、蘋果MdNAC91蛋白序列分別有88.34%、80.74%、80.70%、79.96%的相似性。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，RcNAC72與梅花PmNAC72-like、桃PpNAC72、甜櫻桃PaNAC72、櫻花PsNAC72，親緣關(guān)系較近。實時熒光定量PCR分析表明，高鹽、水楊酸、茉莉酸甲酯均可誘導(dǎo)基因上調(diào)表達，高鹽，水楊酸，高鹽與水楊酸共處理時，根系中的相對表達量明顯高于葉片。綜上推測基因主要在月季根中作為調(diào)節(jié)因子參與鹽脅迫響應(yīng)。

月季“月月粉”；RcNAC72；基因克?。槐磉_分析

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是近10年新發(fā)現(xiàn)的最大的一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子[1]。NAC是由NAM、ATAF、CΜC這三者的首字母而命名的，其中NAM基因是在研究矮牽牛的時候被發(fā)現(xiàn)的，ATAF1、ATAF2、CΜC2的基因結(jié)構(gòu)與NAM相似，均在研究擬南芥的時候被發(fā)現(xiàn)[2-3]。NAC轉(zhuǎn)錄因子的C端為氨基酸序列具有高度多樣性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，能激活轉(zhuǎn)錄也能抑制轉(zhuǎn)錄。由于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的結(jié)構(gòu)具有不穩(wěn)定性，使得NAC蛋白能夠與目標蛋白互作，從而使NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答非生物脅迫和病原菌侵染等生物脅迫的過程中起到重要的調(diào)控作用[4]。

研究證明，擬南芥類基因可被鹽脅迫誘導(dǎo)表達，鹽脅迫處理后的擬南芥植株根部組織中33個基因的表達水平發(fā)生改變，其中26個基因上調(diào)表達，7個基因下調(diào)表達[5]。Tyagi等利用水稻基因芯片數(shù)據(jù)庫分析了水稻族基因在高鹽、干旱、低溫脅迫后的表達水平，發(fā)現(xiàn)45個鹽脅迫響應(yīng)基因，其中33個上調(diào)表達，12個下調(diào)表達[6]。干旱、高鹽等逆境脅迫或脫落酸（ABA）能誘導(dǎo)水稻和擬南芥等類基因的表達，而且功能研究也證明這些類基因在抗旱、耐鹽反應(yīng)中具有重要作用[7-8]。

古老月季品種“月月粉”（‘Old Blush'）因其為二倍體且是月季育種的重要親本之一，所以是月季分子生物學(xué)研究的重要材料[9]。鹽堿地區(qū)的環(huán)境脅迫嚴重制約著園林植物景觀規(guī)劃的發(fā)展，鹽脅迫導(dǎo)致大多數(shù)月季品種生長不良、病蟲害加重，嚴重影響月季的生長發(fā)育和觀賞效果。目前，國內(nèi)外對月季抗鹽性的研究主要集中在生理水平，對于月季耐鹽性分子機理研究較少[10]。目前還沒有關(guān)于月季響應(yīng)鹽脅迫NAC類轉(zhuǎn)錄因子的研究報道。因此，克隆類基因，研究其在月季響應(yīng)鹽脅迫的時空表達模式具有重要的理論意義。

本研究利用前期已經(jīng)完成的月季“月月粉”在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[11]，篩選獲得1個表達水平具有顯著性差異的類基因。為驗證月季“月月粉”轉(zhuǎn)錄因子RcNAC72是否參與鹽脅迫逆境應(yīng)答，我們分析了基因?qū)}脅迫以及激素（茉莉酸甲酯MeJA和水楊酸SA）的誘導(dǎo)表達模式。同時進一步對月季RcNAC72進行生物信息學(xué)分析，預(yù)測其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

月季“月月粉”購自昆明楊月季園藝有限責(zé)任公司。將其栽植于唐山師范學(xué)院溫室內(nèi)，并進行扦插繁殖。選取生長健壯、無病蟲害、植株大小一致的“月月粉”當年生扦插苗作為實驗材料。

1.1.2 試劑

月季總RNA提取采用EASY spin植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄采用Prime Script? RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒，（寶生物工程（大連）有限公司）Real time- PCR熒光染料混合液SYBR? Premix Ex Taq?（寶生物工程（大連）有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成

RNA的提取采用EASY spin植物RNA快速提取試劑盒；利用Roche公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。上述操作過程均按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 RcNAC72基因的克隆

利用月季“月月粉”cDNA序列為模板設(shè)計CDS全長擴增引物（詳見表1）并進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為10×KOD Buffer 5 μl；MgSO4 3 μl；dNTPs 5 μl；cDNA 1 μl；上下游引物各1.5 μl；KOD Plus高保真酶1 μl；用無菌ddH20補齊至20 μl?；靹螂x心后于PCR儀中進行擴增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，56.1 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min以上程序35個循環(huán)；68 ℃ 5 min；4℃反應(yīng)終止。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用TaKaRa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒（大連TaKaRa公司）回收目的條帶，并與pMD18-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，藍白斑篩選，挑取白色單菌落鑒定，根據(jù)菌落PCR結(jié)果，將鑒定出的陽性克隆交由諾賽生物工程有限公司測序。

1.2.3 月季轉(zhuǎn)錄因子RcNAC72的生物信息學(xué)分析

根據(jù)本課題組前期月季“月月粉”鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和月季全基因組數(shù)據(jù)[12]，獲取基因CDS和基因全長序列。根據(jù)所獲得的基因的cDNA和基因全長序列，使用DNAMAN軟件分析RcNAC72氨基酸序列同源性；使用clutaLX進行氨基酸序列比對分析，使用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.2.4 脅迫處理

選取根系生長健壯的“月月粉”幼苗，用1/2的營養(yǎng)液水培緩苗一周。之后用全Hoagland營養(yǎng)液進行鹽脅迫（200 mmol·L-1NaHCO3）、激素處理（1 μmol·L-1MeJA，200 μmol·L-1SA）、鹽與激素共處理（200 mmol·L-1NaHCO3+1 μmol·L-1MeJA，200 mol·L-1NaHCO3+200 μmol·L-1SA），每個處理分別于處理后0 h、2 h、6 h、12 h、2 4 h、48 h進行月季根系和葉片的取樣，并置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｃ總€處理5株，3次重復(fù)。本實驗中鹽處理濃度參照丁晗[13]的方法，MeJA處理濃度參照嚴加坤等[14]的方法，SA處理濃度參照付乃鑫等[15]的方法。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析

采用軟件Primer5.0設(shè)計的實時熒光定量引物，內(nèi)參基因為，引物序列見表1。

表1 實驗中所用的引物

利用ABI7500熒光定量PCR儀檢測基因的表達量。20 μL反應(yīng)體系：3 μl cDNA模板，1 μl上游引物，1 μl下游引物，10 μl SYBR?Premix Ex Taq II（2×），5 μl ddH2O。反應(yīng)程序為：94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；60 ℃，2 min；40個循環(huán)。每處理進行3次生物學(xué)重復(fù)和3次平行樣重復(fù)。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算，其中：

?t=t,RcMYB102-tRcActin

ΔΔt=Δt(h)-Δt(0)

所有數(shù)據(jù)均用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 月季RcNCA72生物信息學(xué)分析

根據(jù)前期鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和月季全基因組數(shù)據(jù)，獲得了月季72基因的cDNA和基因序列全長（圖1）。

M: DNA分子量標記；A: RcNAC72基因PCR擴增產(chǎn)物

圖2 RcNAC72與其他植物NAC類同源蛋白序列多重比對

圖3 月季RcNAC72與其他物種的系統(tǒng)進化樹

測序結(jié)果表明，基因全長1 672 bp，開放閱讀框（ORF）1 059 bp，編碼353個氨基酸。利用DNAMAN軟件對RcNAC72蛋白序列進行同源性比對分析表明，RcNAC72蛋白序列與同科的草莓FvNAC72-like、桃PpNAC72、梅花PmNAC72- like、蘋果MdNAC91蛋白序列分別有88.34%、80.74%、80.70%、79.96%的相似性；利用clutaLX軟件進行氨基酸序列比對分析表明RcNAC72存在N-端保守氨基序列（如圖2所示）。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建RcNAC72蛋白與其他植物的NAC類蛋白的氨基酸序列進化樹結(jié)果表明，RcNAC72與梅花PmNAC72-like、桃PpNAC72、甜櫻桃PaNAC72、櫻花PsNAC 72處于同一分支，親緣關(guān)系較近（如圖3所示）。

2.2 月季RcNAC72在不同處理下的表達模式分析

鹽脅迫、外源激素SA和MeJA處理均能誘導(dǎo)基因的上調(diào)表達（圖4）。

a: 鹽脅迫處理；b: 水楊酸處理；c: 茉莉酸處理；d: 鹽與水楊酸共處理；e: 鹽與茉莉酸共處理

研究結(jié)果顯示，在高鹽處理下，根與葉中基因相對表達量均呈顯著上升趨勢，在處理48 h達到峰值，分別為對照的25.38倍和25.42倍。在外施水楊酸處理下，根中基因相對表達量在12 h達到峰值，為對照組的5.51倍，隨后下降；葉中基因相對表達量在48 h達到峰值，為對照組的10.44倍。在外施MeJA處理下，葉中基因相對表達量在6 h達到峰值，為對照組的7.55倍，而根中基因相對表達量在24 h達到峰值，為對照組的6.80倍。高鹽與SA共處理下，根與葉中基因相對表達量均呈顯著上升趨勢，且根中基因相對表達量較單獨處理顯著升高。高鹽與MeJA共處理下，根中基因相對表達量在24 h達到峰值，為對照組的17.70倍；葉中基因相對表達量在6 h達到峰值，為對照組的21.82倍。上述結(jié)果表明，基因在葉和根中的表達模式存在明顯的差異，并且高鹽、SA、高鹽與SA共處理時，根中的相對表達量明顯高于葉片中，推測基因主要在月季根中起到重要作用。

3 討論

鹽脅迫不僅會導(dǎo)致植株產(chǎn)生多種表型變化，如植物失水、黃化、落葉和萎蔫，還會引起植物體內(nèi)的生理變化，如活性氧的過度積累加速了植物萎蔫[16]。植物通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用和能量代謝等生物途徑調(diào)節(jié)對鹽脅迫的反應(yīng)。植物應(yīng)對環(huán)境中各種非生物脅迫的方式復(fù)雜而有序，而轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控是其中一種重要的途徑。研究表明NAC家族在植物的生長發(fā)育過程以及響應(yīng)非生物脅迫的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[17]。隨著研究的不斷深入，越來越多的報道證實NAC轉(zhuǎn)錄因子與植物響應(yīng)高鹽脅迫密切相關(guān)[18-20]。

沙柳基因在鹽脅迫和高溫脅迫下均可應(yīng)答，且較為顯著[21]。郭文芳等研究發(fā)現(xiàn)柚和檸檬對低溫、干旱、高鹽和脫落酸（ABA）等脅迫的響應(yīng)都較敏感，表達量均有明顯變化，且在干旱和高鹽脅迫時和表達隨時間推移呈逐漸上升趨勢[22]。邵帥等研究表明茄子在受赤霉素（GA）、低溫和高鹽誘導(dǎo)后上調(diào)表達，且在根中優(yōu)先表達，這一表達模式與本研究結(jié)果相似[23]。一些植物激素在鹽脅迫響應(yīng)過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用，在鹽脅迫條件下，蘋果MdNAC047直接與乙烯啟動子結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄，增加了乙烯反應(yīng)基因的表達，從而增強了蘋果對鹽脅迫的耐受性[24]。吉璐研究發(fā)現(xiàn)南荻基因在高鹽、干旱、MeJA和SA誘導(dǎo)下都上調(diào)[25]。擬南芥AtNAC055和AtNAC019均可響應(yīng)茉莉酸的應(yīng)答。在本研究中，RcNAC72響應(yīng)SA應(yīng)答較MeJA更為敏感。

綜上，本研究從月季“月月粉”中克隆分離了一個與鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，并對其序列結(jié)構(gòu)和表達模式進行了初步研究。本研究結(jié)果為研究基因的鹽脅迫分子機制和耐鹽功能提供了依據(jù)，同時為利用基因工程技術(shù)改良月季抗逆性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Gene Cloning and Expression Analysis of

BAO Ying

(Department of Life Sciences, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, China)

In order to reveal the function of the NAC transcription factor in, an NAC gene namedwas cloned from root fissue culture of“Old Blush”. Bioinformatics analysis showed that the full length ofgene was 1 672 bp, and the open reading frame (ORF) was 1 059 bp, encoding 353 amino acids. Sequence alignment revealed that RcNAC72 had a conserved domain at the N-terminal, and its protein sequences were 88.34%, 80.74%, 80.70% and 79.96% similar to those of FvNAC72-like, PpNAC72, PmNAC72-like and MdNAC91, respectively. The results of phylogenetic tree showed that RcNAC72 was phylogenetically closed to PmNAC72-like, PpNAC72, PaNAC72 and PsNAC72. Real-time fluorescence quantitative analysis showed that high salt, salicylic acid, methyl jasmonate could induce the increasing expression of. Theexpression level ofgene in roots was significantly higher than that in leaves. In conclusion,gene mainly acts as a regulatory factorinrootsin response to salt stress.

; RcNAC72; gene cloning; expression analysis

S688

A

1009-9115(2022)03-0044-06

10.3969/j.issn.1009-9115.2022.03.013

河北省自然科學(xué)基金面上項目（2021105002），唐山師范學(xué)院校內(nèi)科研項目（2022C54）

2021-12-18

2022-03-17

包穎（1983-），女，河北廊坊人，博士，講師，研究方向為月季遺傳育種與逆境分子生物學(xué)。

（責(zé)任編輯、校對：范永山）