高紫云, 宋洪川, 徐武美, 郭嘉航,李思民, 黃晶心, 官會林, 孫世中

(云南師范大學(xué) 能源與環(huán)境工程學(xué)院，高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復(fù)云南省野外科學(xué)觀測研究站，云南省農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500)

土壤鹽漬化是制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素之一，不僅嚴(yán)重干擾植物正常的生長發(fā)育進(jìn)程，同時(shí)對區(qū)域內(nèi)植物地理分布產(chǎn)生了巨大的不利影響.調(diào)查顯示，在全球范圍內(nèi)，鹽漬化的土地面積約有9.5×108hm2,而僅我國就已有9×107hm2的土地遭到了鹽漬化的嚴(yán)重侵襲[1]；且隨著全球氣候的變化以及近年來諸多不當(dāng)?shù)霓r(nóng)業(yè)耕作及灌溉措施的施行，預(yù)計(jì)未來土壤鹽漬化的問題將會持續(xù)加重，鹽漬化的土地面積也將進(jìn)一步擴(kuò)大[2].

鹽堿脅迫作為影響作物生長發(fā)育的重要的非生物脅迫之一，通過形成的滲透脅迫和離子脅迫干擾植株內(nèi)部的物質(zhì)合成及外部的形態(tài)構(gòu)建[3]；種子萌發(fā)期是植株整個(gè)生命進(jìn)程中最復(fù)雜也是最關(guān)鍵的時(shí)期，此時(shí)植株對外界鹽堿環(huán)境的變化最為敏感，反應(yīng)也最為明顯和強(qiáng)烈[4].因此，植株對某種鹽堿環(huán)境的耐受能力能夠從種子萌發(fā)階段時(shí)的萌發(fā)表現(xiàn)以及胚芽的生長特征上得以體現(xiàn)[5].

甘遂是我國獨(dú)有的一種藥用草本作物，廣泛分布于我國陜西、山西、甘肅及河南等地，甘遂入藥具有利尿、引產(chǎn)、瀉下及消腫等顯著效用[6]，因其優(yōu)秀的逐水特性，在醫(yī)藥界享有“瀉水圣藥”的美譽(yù)[7-8].

目前，國內(nèi)醫(yī)藥行業(yè)對甘遂的需求量激增，但由于室內(nèi)種植甘遂生長緩慢且產(chǎn)量不佳，甘遂的栽培和生產(chǎn)還是以野外自然條件下種植為主[9]，但山西、陜西和河南等甘遂主產(chǎn)區(qū)日益加重的土壤鹽漬化極大地制約了甘遂的產(chǎn)出并影響了藥材品質(zhì)[10].且甘遂在鹽脅迫環(huán)境下的萌發(fā)特性尚未有前人進(jìn)行系統(tǒng)性的研究探討，因此此次試驗(yàn)采用方差分析以及擬合回歸線的方法，通過使用不同濃度的NaCl、Na2SO4及NaHCO3溶液對甘遂種子進(jìn)行鹽脅迫處理，觀察并分析在三種不同鹽脅迫環(huán)境下甘遂種子的萌發(fā)表現(xiàn)和響應(yīng)特征，進(jìn)而總結(jié)甘遂種子的耐受機(jī)制和抑制其萌發(fā)的鹽溶液濃度范圍，旨在為甘遂的土壤選擇、科學(xué)栽培以及耐鹽品種選育提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘遂種子購自山西運(yùn)城四季藥材種苗站，所用鈉鹽為分析純NaCl、Na2SO4及NaHCO3.挑選顆粒飽滿、大小一致且無病蟲害的甘遂種子3 000粒，使用1%次氯酸鈉溶液充分浸泡20 min后，再用無菌蒸餾水沖洗干凈，最后使用無菌濾紙吸干種子表面水分，靜置備用.

1.2 試驗(yàn)方法

分別設(shè)置0、50、100、150、200、250 mmol·L-1和300 mmol·L-1的NaCl(pH 7.0)、Na2SO4(pH 7.0)和NaHCO3(pH 8.3)溶液[11-12].種子萌發(fā)采用培養(yǎng)皿濾紙芽床法，即在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中鋪設(shè)兩層定性濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放置50粒備用的種子，并分別倒入5 mL對應(yīng)濃度的鹽溶液，每個(gè)處理設(shè)6組重復(fù).將培養(yǎng)皿加蓋后放置入25 ℃且相對濕度為60%～70%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，利用稱重法每天補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分，保證各個(gè)處理組中對應(yīng)鹽溶液濃度不變，每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)當(dāng)日種子萌發(fā)數(shù)量，以胚芽露出種皮1 mm為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，以第4天作為萌發(fā)高峰計(jì)算發(fā)芽勢；待種子萌發(fā)全部停止時(shí)，將全部未萌發(fā)的種子用蒸餾水洗凈，放入蒸餾水中復(fù)水，每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)復(fù)水后各處理組種子的新增萌發(fā)數(shù).經(jīng)前期甘遂種子萌發(fā)預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，12 d內(nèi)種子萌發(fā)過程已全部結(jié)束，故在此次試驗(yàn)中取12 d作為萌發(fā)試驗(yàn)總時(shí)長.

1.3 指標(biāo)測定方法

種子的發(fā)芽率=(萌發(fā)數(shù)量/供試數(shù)量)×100%;

種子的發(fā)芽勢=(從開始至發(fā)芽高峰的萌發(fā)數(shù)量/供試數(shù))×100%;

發(fā)芽指數(shù)=∑(GT/DT),

式中,DT為萌發(fā)相應(yīng)天數(shù)，GT為相應(yīng)天數(shù)種子的發(fā)芽數(shù);

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×平均每皿總胚芽長[13-14];

相對發(fā)芽率=(處理組發(fā)芽率/對照組發(fā)芽率)×100%;

相對鹽害率=(對照組發(fā)芽率-處理組發(fā)芽率)/對照組發(fā)芽率×100%；

萌發(fā)恢復(fù)率=[(A-B)/(C-B)]×100%，

式中，A為全部時(shí)間的發(fā)芽種子數(shù),B為鹽溶液中的發(fā)芽種子數(shù)，C為該處理全部種子數(shù)；

終萌發(fā)率=(脅迫下萌發(fā)的種子數(shù)+復(fù)水后萌發(fā)的種子數(shù))/供試種子數(shù)×100%；

將種子相對發(fā)芽率與相應(yīng)的鹽溶液濃度建立回歸關(guān)系，耐鹽適宜濃度、耐鹽半致死濃度和耐鹽極限濃度分別為相對發(fā)芽率為75%、50%和25%時(shí)對應(yīng)的鹽溶液濃度.

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

使用Microsoft Excel 2019軟件整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪制圖表,使用IBM SPSS Statistics 25軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行可重復(fù)雙因素方差分析與單因素ANOVA檢驗(yàn)，并進(jìn)行顯著差異檢驗(yàn)(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對甘遂種子萌發(fā)動(dòng)態(tài)的影響

由表1可以得出，各NaCl濃度處理下甘遂種子萌發(fā)率隨時(shí)間延長穩(wěn)步提升，總體而言，同一時(shí)間段內(nèi)，甘遂種子萌發(fā)率隨NaCl濃度升高而降低，150～300 mmol·L-1NaCl脅迫下甘遂種子萌發(fā)率在任何時(shí)間段均顯著低于對照(P<0.05)；另外，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到200 mmol·L-1時(shí)，開始萌發(fā)時(shí)間較對照組推遲了1 d，濃度為250 mmol·L-1及300 mmol·L-1時(shí)，萌發(fā)開始時(shí)間均推遲了2 d.

可重復(fù)雙因素方差分析表明，處理時(shí)間和NaCl濃度以及兩者交互作用均能夠?qū)Ω仕旆N子發(fā)芽率產(chǎn)生極其顯著的影響(P< 0.01).

表1 NaCl處理對甘遂種子萌發(fā)動(dòng)態(tài)影響

同行不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著；**表示在0.01水平差異顯著，*表示在0.05水平差異顯著，ns 表示無顯著性差異，下同.

如表2所示，經(jīng)不同濃度Na2SO4處理下的各組，第1～4天內(nèi)，300 mmol·L-1Na2SO4處理組萌發(fā)率顯著低于對照組(P< 0.05)；第5～12天內(nèi)，隨Na2SO4濃度升高，甘遂種子萌發(fā)率呈先升高后降低的趨勢.

可重復(fù)雙因素方差分析表明，處理時(shí)間和Na2SO4濃度均能夠?qū)Ω仕旆N子發(fā)芽率產(chǎn)生極其顯著的影響(P< 0.01),處理時(shí)間和Na2SO4濃度交互作用對甘遂種子發(fā)芽率無顯著性影響.

表2 Na2SO4處理對甘遂種子萌發(fā)動(dòng)態(tài)影響

如表3所示，經(jīng)不同濃度NaHCO3處理下的各組，總體而言，在同一時(shí)間段內(nèi)，萌發(fā)率隨NaHCO3濃度的升高而降低；當(dāng)NaHCO3濃度達(dá)到250 mmol·L-1時(shí)，種子開始發(fā)芽時(shí)間推遲了1 d，當(dāng)鹽分濃度達(dá)到300 mmol·L-1時(shí)，種子開始萌發(fā)時(shí)間推遲了2 d，且250 mmol·L-1和300 mmol·L-1NaHCO3處理組萌發(fā)率在任何時(shí)間段均顯著低于對照組(P<0.05).

可重復(fù)雙因素方差分析表明，處理時(shí)間和NaHCO3濃度以及兩者交互作用均能夠?qū)Ω仕旆N子發(fā)芽率產(chǎn)生極其顯著的影響(P<0.01).

表3 NaHCO3處理對甘遂種子萌發(fā)動(dòng)態(tài)影響

2.2 鹽脅迫對甘遂種子相關(guān)萌發(fā)指標(biāo)的影響

由表4可知，經(jīng)不同濃度的NaCl溶液和NaHCO3溶液處理后的甘遂種子各發(fā)芽指標(biāo)均呈現(xiàn)隨濃度升高而不斷降低的趨勢，當(dāng)鹽溶液濃度達(dá)到300 mmol·L-1時(shí)，NaCl處理組和NaHCO3處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)均達(dá)到最低，顯著低于對照組(P<0.05).而Na2SO4鹽溶液處理組發(fā)芽率與發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)隨鹽溶液濃度先升高后降低的趨勢，其中發(fā)芽率在200 mmol·L-1時(shí)達(dá)到頂峰，比對照組高25.89%，發(fā)芽指數(shù)在150 mmol·L-1時(shí)達(dá)到頂峰，比對照組高4.91%;發(fā)芽勢總體呈現(xiàn)先下降，后升高，又下降的變化趨勢，在濃度為200 mmol·L-1時(shí)與對照組持平;活力指數(shù)隨Na2SO4濃度的升高不斷下降，到300 mmol·L-1時(shí)，活力指數(shù)達(dá)到最低，僅為對照組的10.23%.由此可見，甘遂種子對Na2SO4的耐受性強(qiáng)于NaCl和NaHCO3，并且低濃度的Na2SO4在一定程度上可以促進(jìn)種子的萌發(fā)，但又僅限于促進(jìn)種子萌動(dòng)與破殼，鹽溶液的刺激依然會導(dǎo)致種子整體生活力的下降.

可重復(fù)雙因素方差分析表明，鹽溶液種類、鹽溶液濃度以及鹽溶液種類和濃度的交互作用均能夠?qū)Ω仕旆N子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)產(chǎn)生極其顯著的影響(P<0.01) .

2.3 復(fù)水對甘遂種子恢復(fù)萌發(fā)的影響

由圖1-3可見，NaCl鹽溶液處理組種子復(fù)水后，最終萌發(fā)率較復(fù)水前萌發(fā)率均有不同程度的增長，且隨著鹽溶液濃度的逐漸升高呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)鹽溶液濃度達(dá)到100 mmol·L-1時(shí)，最終萌發(fā)率達(dá)到頂峰，比對照組高11.10%(P<0.05).萌發(fā)恢復(fù)率整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且在NaCl濃度為150 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最高；Na2SO4鹽溶液處理組復(fù)水后，復(fù)水后萌發(fā)恢復(fù)率與最終萌發(fā)率均隨濃度的升高先升高而后降低，且前者在不同濃度鹽溶液處理組間差異不顯著，后者在鹽溶液濃度為50～250 mmol·L-1時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)，當(dāng)濃度達(dá)到200 mmol·L-1時(shí)，最終萌發(fā)率達(dá)到頂峰，比對照組高44.44%.NaHCO3溶液處理組復(fù)水后，最終萌發(fā)率與復(fù)水后萌發(fā)恢復(fù)率均在鹽溶液濃度為50 mmol·L-1時(shí)顯著升高隨后不斷降低，50 mmol·L-1時(shí)最終萌發(fā)率比對照高7.44%(P<0.05).

圖1 甘遂種子在NaCl脅迫下的發(fā)芽率、萌發(fā)恢復(fù)率和最終發(fā)芽率

圖2 甘遂種子在Na2SO4脅迫下的發(fā)芽率、萌發(fā)恢復(fù)率和最終發(fā)芽率

2.4 甘遂種子對不同鹽脅迫的耐受性

由表5可知，處理組種子萌發(fā)進(jìn)程受到的鹽分傷害隨鹽濃度的升高而愈發(fā)劇烈，而相同鹽溶液濃度下，Na2SO4處理組相對鹽害率顯著低于其余兩種鹽溶液處理組，且在50～250 mmol·L-1濃度區(qū)間內(nèi)，相對鹽害率與對照組無顯著性差異(P<0.05).NaCl處理組與NaHCO3處理組相比，除100 mmol·L-1處理組外，在相同鹽濃度下，NaCl處理組相對鹽害率顯著高于NaHCO3處理組(P<0.05).由此可見，甘遂種子對Na2SO4的耐受性最好，對NaCl耐受性最差，三種鹽對甘遂種子萌發(fā)進(jìn)程的抑制作用從強(qiáng)到弱順序依次為NaCl>NaHCO3>Na2SO4.

可重復(fù)雙因素方差分析表明，鹽溶液種類、鹽溶液濃度以及鹽溶液種類和濃度的交互作用均能夠?qū)ΨN子相對鹽害率產(chǎn)生極其顯著的影響(P< 0.01).

如表6所示，依據(jù)鹽濃度與發(fā)芽率之間的顯著相關(guān)性建立兩者間的回歸直線方程式.由表中公式可知，甘遂種子對NaCl、Na2SO4及NaHCO3的耐鹽適宜濃度分別為109.00、318.00 mmol·L-1和140.00 mmol·L-1，半致死濃度分別為221.50、396.57 mmol·L-1和277.50 mmol·L-1，臨界濃度分別為334.00、446.57 mmol·L-1和365.00 mmol·L-1.

表6 甘遂種子發(fā)芽率與鹽分濃度回歸分析結(jié)果

3 討論

種子萌發(fā)期是植物整個(gè)生命周期中對外界環(huán)境刺激響應(yīng)最為強(qiáng)烈和脆弱的時(shí)期[15].種子萌發(fā)期對不同鹽的應(yīng)激表現(xiàn)往往最能夠反映出此種植物對該鹽的耐受性[16].而鹽分對種子萌發(fā)的影響往往和鹽的種類、濃度以及種子類型，甚至同一種種子的采收年份有密切關(guān)聯(lián)[17].鹽脅迫對種子萌發(fā)的影響一般通過滲透調(diào)節(jié)和離子毒害作用實(shí)現(xiàn)，前者一般通過改變細(xì)胞內(nèi)外溶液環(huán)境的滲透壓來抑制細(xì)胞對水分的汲取和利用，進(jìn)而干擾細(xì)胞的正常生命活動(dòng)；后者一般是無機(jī)鹽離子進(jìn)入細(xì)胞，影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的滲透調(diào)節(jié)，進(jìn)一步紊亂細(xì)胞內(nèi)部的代謝活動(dòng)，使得呼吸作用無法正常進(jìn)行[18].

研究使用不同濃度的NaCl、Na2SO4和NaHCO3對甘遂種子萌發(fā)階段進(jìn)行脅迫，結(jié)果表明，不同濃度的NaCl和NaHCO3均會對甘遂種子的萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)以及萌發(fā)指數(shù)均呈下降趨勢，并且隨鹽溶液濃度的升高，抑制作用逐漸加強(qiáng).說明NaCl和NaHCO3能夠通過滲透脅迫和離子毒害作用抑制甘遂種子的萌發(fā)潛力和發(fā)芽整齊度，推遲發(fā)芽高峰和開始萌發(fā)的時(shí)間，影響種子生長和物質(zhì)積累.而Na2SO4處理組在低濃度條件下表現(xiàn)出對種子萌發(fā)的促進(jìn)，高濃度才表現(xiàn)出抑制，這與朱毅等[12]的研究結(jié)果一致.這可能是由于甘遂種子對Na2SO4的耐受性強(qiáng)，低濃度的Na2SO4溶液作用下，部分鈉離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，細(xì)胞吸水能力提升，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)部代謝反應(yīng)的進(jìn)行；也可能是微量的鈉離子激活了細(xì)胞中相關(guān)呼吸酶，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和利用的緣故[19].

值得注意的是，NaHCO3處理組活力指數(shù)顯著低于同等濃度下的NaCl和Na2SO4處理組，表明NaHCO3能夠顯著的抑制種子胚芽的伸長和生長，并且抑制作用顯著強(qiáng)于同濃度的NaCl和Na2SO4，此種結(jié)果應(yīng)該由于NaHCO3作為一種堿性鹽(pH 8.3)，不僅通過滲透作用和離子毒害對種子萌發(fā)產(chǎn)生負(fù)面影響，而且還造成了過高pH的不良環(huán)境[20]，堿性環(huán)境下，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能遭到進(jìn)一步破壞，離子平衡被打破，細(xì)胞為了維持正常的生命活動(dòng)不得已需要消耗更多的物質(zhì)和能量去對抗pH過高產(chǎn)生的逆環(huán)境，進(jìn)而抑制了胚芽的生長進(jìn)程[21].因此,在對種植了甘遂的土壤進(jìn)行澆灌時(shí)應(yīng)注意避免堿性水源，以規(guī)避過高pH對甘遂生長發(fā)育所產(chǎn)生的不良影響.

對不同處理組種子復(fù)水試驗(yàn)后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以看出脫離鹽脅迫環(huán)境后，低濃度的鹽溶液處理組最終萌發(fā)率與對照組有顯著性差異(P<0.05)，100 mmol·L-1NaCl、50 ～250 mmol·L-1Na2SO4和50 mmol·L-1NaHCO3處理組最終萌發(fā)率顯著高于對照組，說明低濃度的鹽溶液主要通過滲透脅迫使得種子吸水困難來暫時(shí)抑制種子萌發(fā)，并未破壞種子內(nèi)部的生理結(jié)構(gòu)和膜系統(tǒng)，在外界滲透環(huán)境回復(fù)到正常水平后，種子細(xì)胞仍然能保持正常的萌發(fā)能力,這與前人研究結(jié)果相吻合[22].此外由于植物體不同的補(bǔ)償和超補(bǔ)償機(jī)制[23-24]，在鹽脅迫解除后，外界滲透環(huán)境和離子環(huán)境發(fā)生激烈變化，相關(guān)代謝酶受到刺激，活性增強(qiáng)，也進(jìn)一步打破了種子休眠，提高了發(fā)芽率[25].同時(shí)從試驗(yàn)結(jié)果可以看到，250 mmol·L-1和300 mmol·L-1NaHCO3處理組種子最終萌發(fā)率與復(fù)水前萌發(fā)率沒有顯著性差異，這可能是由于過高的鹽分脅迫對細(xì)胞產(chǎn)生了嚴(yán)重的離子毒害，使得細(xì)胞膜系統(tǒng)失去了控制離子進(jìn)出的能力，導(dǎo)致細(xì)胞異變和吸漲，對細(xì)胞正常的生理代謝造成了不可逆轉(zhuǎn)的損傷，使得種子即使解除了鹽脅迫也永久喪失了繼續(xù)萌發(fā)的能力[4,26].

通過對甘遂種子的耐鹽性評價(jià)，可知低濃度的Na2SO4對甘遂種子萌發(fā)呈現(xiàn)出促進(jìn)作用，相對鹽害率為零，另外從回歸方程可得Na2SO4的耐鹽適宜濃度、半致死濃度和臨界濃度均為最高，NaCl最低，NaHCO3居中.綜上，甘遂種子對Na2SO4具有較強(qiáng)的耐受性，對NaCl和NaHCO3的刺激則較為敏感，且對NaCl的耐受性最差.這與張麗平等[27]得出的結(jié)果不一致，可能的原因是不同植物代謝反應(yīng)進(jìn)程不同，對不同類型鹽脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)也有差別.因此，在甘遂種子實(shí)際栽培過程中，應(yīng)針對土壤中含鹽量和鹽分組成差異有選擇地種植，進(jìn)而保證甘遂植株的健康生長.

4 結(jié)語

隨鹽濃度的升高，NaCl與NaHCO3處理組的甘遂種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等發(fā)芽指標(biāo)均總體呈下降趨勢，Na2SO4處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)總體呈先上升后下降趨勢，活力指數(shù)則持續(xù)下降，表明低濃度Na2SO4對甘遂種子萌發(fā)有一定促進(jìn)作用.復(fù)水后，各鹽處理組最終萌發(fā)率均有不同程度回升，低濃度鹽處理下，最終萌發(fā)率顯著大于對照，表明低濃度鹽脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用主要來源于滲透脅迫，具有暫時(shí)性.耐鹽性評價(jià)結(jié)果表明，甘遂種子對三種鹽的耐受性由強(qiáng)到弱順序依次為Na2SO4>NaHCO3>NaCl.