張 尊 孫圣榮

武漢大學(xué)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科 湖北 武漢 430060

根據(jù)最新全球癌癥統(tǒng)計(jì)，每年乳腺癌新發(fā)病例數(shù)約226 萬(wàn)，超越肺癌成為世界上最常見的惡性腫瘤［1］。盡管乳腺癌綜合治療效果不斷提升，但是其高度的分子異質(zhì)性仍然是精準(zhǔn)治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)的重要挑戰(zhàn)。近年來(lái)，生活習(xí)慣等社會(huì)行為因素與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)引起了重大關(guān)切。Picon-Ruiz等［2］綜述了肥胖對(duì)乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)、死亡率、生存率、不同亞型之間的影響，提示肥胖顯著增加乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)并賦予其惡性侵襲能力。值得注意的是，多項(xiàng)研究［3，4］表明，肥胖會(huì)增加乳腺癌中最具侵襲性的亞型——三陰性乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后。因此，在本研究中，我們著重探討肥胖促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制。

作為腫瘤或癌癥干細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞環(huán)境，免疫細(xì)胞、血管、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓衍生的炎性細(xì)胞和信號(hào)分子共同構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境是癌癥生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)。免疫細(xì)胞作為腫瘤基質(zhì)的重要組成部分，通過其表型和構(gòu)成比例的變化形成了利于癌癥生長(zhǎng)擴(kuò)散的腫瘤免疫微環(huán)境［5］。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是乳腺癌中研究最多的免疫細(xì)胞［6］。在乳腺腫瘤中表達(dá)最多的免疫抑制細(xì)胞［7］是調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC），除此之外，自然殺傷（NK）細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及T 和B 淋巴細(xì)胞也可以在乳腺癌的腫瘤免疫微環(huán)境中表達(dá)。Pingili 等［8］探討了肥胖影響乳腺癌中免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制。這些研究發(fā)現(xiàn)提示了肥胖可能通過影響免疫系統(tǒng)，從而促進(jìn)乳腺癌的惡性進(jìn)展。

CD73 又稱胞外-5'-核苷酸酶（Ecto-5'-Nucleotidase，EC3.1.3.5，ecto-5'-NT），是一種由NT5E 基因編碼的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白［9］，廣泛地表達(dá)在免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞的表面。在胞外，CD73 能夠?qū)⒁涣姿嵯佘眨ˋMP）轉(zhuǎn)化為腺苷，從而調(diào)節(jié)傳遞到免疫細(xì)胞的嘌呤能信號(hào)的持續(xù)時(shí)間、數(shù)量和化學(xué)性質(zhì)［10］。腫瘤微環(huán)境中的腺苷可以作為信號(hào)分子與Treg 細(xì)胞A2AR 受體結(jié)合幫助Treg 細(xì)胞抑制并關(guān)停免疫活性，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤來(lái)源的CD73 是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的原因之一［11］。在乳腺癌中，一些研究提示較高的CD73 表達(dá)水平與較差的預(yù)后相關(guān)［12，13］，但在另外一些研究中，CD73 表達(dá)水平增加與較好的預(yù)后相關(guān)［14］。面對(duì)這些有爭(zhēng)議的結(jié)果，需要我們提供更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，闡釋CD73 表達(dá)水平與乳腺癌組織微環(huán)境中的免疫狀態(tài)以及乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

本研究通過收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科臨床乳腺癌患者的組織標(biāo)本和相關(guān)臨床信息，發(fā)現(xiàn)了CD73 表達(dá)水平增加與體質(zhì)量指數(shù)（BMI）顯著正相關(guān)。此外我們發(fā)現(xiàn)在肥胖相關(guān)乳腺癌組織中CD73 表達(dá)水平顯著上調(diào)。我們應(yīng)用CIBERSORT［15］整體分析CD73 表達(dá)水平相關(guān)的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的表達(dá)水平，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD73高表達(dá)組中Treg 和活化NK 細(xì)胞的比例較高，而低表達(dá)組中CD8+T 細(xì)胞、γδ+T 細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)率較高。因此本研究著重從肥胖相關(guān)乳腺癌入手，從免疫微環(huán)境的角度探討CD73 的表達(dá)水平與乳腺癌發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析方法

1.1.1探索CD73 在乳腺癌不同亞型中表達(dá)水平以及相關(guān)信號(hào)通路 應(yīng)用GOBO 在線平臺(tái)［16］“Gene Set Analysis”模塊分析CD73 mRNA 在乳腺癌不同亞型中的表達(dá)情況，進(jìn)一步篩選和評(píng)估與CD73 表達(dá)變化顯著相關(guān)的信號(hào)通路。

1.1.2探索CD73 mRNA 在乳腺癌不同亞型中的預(yù)后 應(yīng)用Kaplan-Meier plotter 在線平臺(tái)［17］分析CD73 mRNA 的表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性，計(jì)算與總生存期（OS）的log rankP值和危險(xiǎn)因素（HR）。將CD73 表達(dá)閾值設(shè)定為50%，高于該閾值即為高表達(dá)，低于該閾值為低表達(dá)。

1.1.3探索CD73 mRNA 表達(dá)水平與乳腺癌組織免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性 下載癌癥基因組圖譜［18］（TCGA）的乳腺癌組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)格式為“FPKM”，計(jì)算并分析CD73 mRNA 表達(dá)水平與乳腺癌組織中免疫微環(huán)境的相關(guān)性。將上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)按照CD73 mRNA 的四分位數(shù)劃分為CD73 高表達(dá)組和低表達(dá)組；CIBERSORT［15］為一款用于針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，量化分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例的分析軟件，我們采用的是CIBERSORT 在線分析平臺(tái)［15］，定量分析組織樣本中的免疫細(xì)胞組分。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1病例收集 收集2010 年2 月至2017 年10月，在武漢大學(xué)人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的50 例乳腺癌患者的組織標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)過4%多聚甲醛固定并進(jìn)行石蠟包埋。所有患者均為女性。所有納入研究的患者均簽署知情同意書，項(xiàng)目研究獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。收集患者的相關(guān)臨床資料，并進(jìn)行定期隨訪，本項(xiàng)目隨訪評(píng)價(jià)的終點(diǎn)為患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2.2免疫組化 免疫組化（IHC）染色由兩名獨(dú)立的病理學(xué)家進(jìn)行，通過ImageJ IHC Profilier 計(jì)算CD73 表達(dá)陽(yáng)性率。受試者工作特征（ROC）分析用于確定與生存率相關(guān)的所有表達(dá)水平的最佳截?cái)嘀?。一抗抗體為抗CD73 抗體（orb197830，Biorbyt，美國(guó)）。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0 軟件（IBM Corporation，Armonk，NY，USA） 和 GraphPad Prism 8.0 軟件（GraphPad software Inc，San Diego，CA，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組間的顯著差異。對(duì)獨(dú)立樣本采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間比較。采用卡方檢驗(yàn)評(píng)價(jià)CD73 表達(dá)水平與乳腺癌患者基線臨床特征的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier 法計(jì)算患者生存概率，logrank 檢驗(yàn)評(píng)估各預(yù)后因素在生存資料中的異質(zhì)性。采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。采用Pearson 相關(guān)分析評(píng)估蛋白表達(dá)水平之間的相關(guān)性。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD73 mRNA 表達(dá)水平在乳腺癌Basal-like亞型中上調(diào)比較分析不同亞型乳腺癌中胞外-5'-核苷酸酶CD73 基因（NT5E）的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果表明，與HER2+、LumA、LumB 三個(gè)亞型相比，CD73 mRNA 表達(dá)水平在乳腺癌Basal-like 亞型中增高（圖1）。三陰性乳腺癌亞型是乳腺癌臨床治療效果最差一個(gè)類型，基于該類型組織的免疫組化臨床病理特點(diǎn)與分子分型（PAM50）中的Basal-like 亞型高度重合，這一結(jié)果提示CD73 表達(dá)水平增加可能和惡性程度較高的三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖1 不同乳腺癌亞型中CD73 mRNA 表達(dá)水平

2.2 CD73 mRNA 表達(dá)水平與免疫微環(huán)境和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)通過GOBO 平臺(tái)篩選CD73 mRNA 表達(dá)水平顯著相關(guān)的信號(hào)通路，結(jié)果提示CD73 mRNA 表達(dá)水平升高與乳腺癌組織微環(huán)境基質(zhì)、脂質(zhì)代謝以及免疫應(yīng)答顯著正相關(guān)（圖2）。另外一方面，與固醇類代謝顯著負(fù)相關(guān)（圖2）。這一發(fā)現(xiàn)提示CD73 可能是通過參與脂質(zhì)代謝、免疫微環(huán)境等途徑發(fā)揮促進(jìn)乳腺發(fā)展的作用。

圖2 CD73 mRNA 表達(dá)相關(guān)信號(hào)通路

2.3 CD73 mRNA 表達(dá)水平與不同亞型乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性Kaplan Meier 生存分析顯示不同亞型乳腺癌患者中，CD73 表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性：CD73 低表達(dá)與三陰性乳腺癌和Luminal-A型乳腺癌的OS 顯著延長(zhǎng)（P=0.026 和0.048，圖3A、3C）。另外一方面，HER2+型乳腺癌和Luminal-B 型乳腺癌中CD73 表達(dá)水平與生存率無(wú)顯著相關(guān)性（P=0.22 和0.14；圖3B、3D）。

圖3 CD73 mRNA 表達(dá)水平與不同亞型乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)性

2.4 CD73 蛋白表達(dá)水平與乳腺癌分期分級(jí)無(wú)相關(guān)性我們采用免疫組化分析了50 例臨床乳腺癌標(biāo)本中CD73 的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞中，CD73 蛋白表達(dá)陽(yáng)性有19 例，CD73 蛋白表達(dá)陰性有31 例。此外，除了在乳腺癌細(xì)胞中，在間質(zhì)中也可以觀察到CD73 的陽(yáng)性表達(dá)（圖4A）。

將CD73 的蛋白表達(dá)水平與臨床病理數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，CD73 蛋白表達(dá)水平與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、TNM 分期、ER、PR、HER2、Ki67 水平均無(wú)顯著的相關(guān)性（表1）。但是，與組織中CD73 的蛋白表達(dá)水平低組患者的生存率相比較，乳腺癌組織中CD73 的蛋白表達(dá)水平高組患者的生存率顯著降低（P=0.000 2，圖4B）。

表1 CD73 表達(dá)與患者臨床特點(diǎn)相關(guān)性[例(%)]

圖4 乳腺癌組織CD73 蛋白表達(dá)情況及預(yù)后相關(guān)性

2.5 CD73 蛋白表達(dá)水平與患者BMI 的相關(guān)性盡管CD73 與患者的腫瘤大小、TNM 分期等臨床病理特征無(wú)顯著相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)患者乳腺癌組織中CD73 的表達(dá)水平與患者的BMI 存在正相關(guān)（P=0.021 4，圖5A），在肥胖（BMI＞24 kg/m2）的乳腺癌患者中CD73 的表達(dá)水平要高于正?；蜻^輕的乳腺癌患者（圖5B）。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在肥胖病人中，靠近脂肪細(xì)胞的乳腺癌細(xì)胞附近可以發(fā)現(xiàn)更多的CD73 陽(yáng)性細(xì)胞聚集（圖5C）。這一結(jié)果表明CD7 的表達(dá)與肥胖性乳腺癌密切相關(guān)，CD73 可能作為肥胖性乳腺癌的促癌因子發(fā)揮作用。

圖5 CD73 蛋白表達(dá)水平與患者BMI 的相關(guān)性

2.6 CD73 通過脂代謝相關(guān)的基因調(diào)控肥胖相關(guān)乳腺癌為了探究CD73 通過何種途徑參與肥胖相關(guān)乳腺癌的調(diào)節(jié)。本研究通過生物信息學(xué)手段并借助GeneMANIA 蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD73 可能通過參與脂肪代謝蛋白FTO 等的調(diào)節(jié)［19］，進(jìn)而調(diào)控肥胖相關(guān)的乳腺癌。

2.7 CD73 調(diào)節(jié)乳腺癌腫瘤免疫微環(huán)境本研究分析CD73 表達(dá)與調(diào)控乳腺癌腫瘤免疫微環(huán)境的可能機(jī)制。在執(zhí)行CIBERSOFT 算法后，TCGA 隊(duì)列中1 053 個(gè)腫瘤樣本的P＜0.05，數(shù)據(jù)均合格。將CD73 表達(dá)水平的下四分位數(shù)表達(dá)定義為低表達(dá)組，將CD73 表達(dá)水平上四分?jǐn)?shù)表達(dá)定義為高表達(dá)組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)組中Treg 比例較高，而低表達(dá)組中CD8+T 細(xì)胞、γδ+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)率較高（均P＜0.05，圖7）。這些結(jié)果提示，CD73 表達(dá)水平變化可能調(diào)節(jié)乳腺癌組織中的免疫浸潤(rùn)，特別是CD8+T 細(xì)胞和γδ+T 細(xì)胞的減少，會(huì)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的免疫逃逸。

圖6 CD73 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖7 CD73 不同表達(dá)水平下乳腺癌腫瘤免疫微環(huán)境特點(diǎn)

3 討論

在本研究中，我們首先采用在線表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘工具，系統(tǒng)分析了CD73 mRNA 表達(dá)水平與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與乳腺癌HER2+、LumA、LumB三個(gè)亞型相比，CD73 mRNA 表達(dá)水平在Basal-like亞型中增高；并且在三陰型和LumA 型乳腺癌患者在CD73 表達(dá)水平越高，預(yù)后越差。通路分析結(jié)果顯示，CD73 表達(dá)水平變化與脂質(zhì)代謝和免疫密切相關(guān)，更重要的是，通過我們收集的50 例乳腺癌組織樣本，免疫組化分析顯示乳腺癌組織中CD73 蛋白表達(dá)水平增加與患者的BMI 水平增加之間存在正相關(guān)。生理狀態(tài)下CD73 會(huì)通過脂肪細(xì)胞分泌的脂肪小體釋放，將細(xì)胞外AMP 轉(zhuǎn)化為腺苷，抑制甘油三酯分解，從而協(xié)助脂肪組織的脂質(zhì)儲(chǔ)存［20］。但在腫瘤發(fā)生發(fā)展時(shí)，脂肪組織參與構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境中更高的CD73 水平可能反而為腫瘤的生長(zhǎng)和免疫逃逸提供了幫助。結(jié)合肥胖作為一種常見的代謝癥群，被證實(shí)與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［2］。并且BMI 的增加與乳腺癌發(fā)病率的增加之間存在明顯的聯(lián)系［21］。CD73 可能是肥胖相關(guān)乳腺癌發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。因此本研究重點(diǎn)分析CD73 表達(dá)水平變化與乳腺癌組織免疫微環(huán)境的相關(guān)性，從此角度探索肥胖在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。

CD73 在腫瘤微環(huán)境中的積累被認(rèn)為是癌癥免疫逃逸的一種機(jī)制［22］。為了研究CD73 對(duì)乳腺癌中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的影響，我們使用CIBERSORT比較CD73 高表達(dá)組和低表達(dá)組組織樣本之間22 種不同的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異。結(jié)果顯示，CD73 高表達(dá)組乳腺癌組織中CD8+T 細(xì)胞和γδ+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)程度顯著降低，這可能是CD73 參與免疫抑制、誘導(dǎo)免疫逃逸的重要環(huán)節(jié)。首先CD8+T 細(xì)胞對(duì)于針對(duì)腫瘤的保護(hù)性免疫至關(guān)重要。在乳腺癌中，腫瘤微環(huán)境中CD8+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)與總生存期延長(zhǎng)正相關(guān)［23］，因此，CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)的豐度對(duì)預(yù)后和治療策略具有重要意義。其次，γδ+T 細(xì)胞作為先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，是包含T 細(xì)胞受體（TCR）γ 和δ 鏈的T 細(xì)胞亞群。它能夠通過刺激巨噬細(xì)胞和DCs 產(chǎn)生具有抗腫瘤效應(yīng)的細(xì)胞因子如IFN-γ 和TNF-α 來(lái)對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并且能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞的抗原而沒有主要的組織相容性復(fù)合物限制。高表達(dá)CD73 抑制乳腺癌組織微環(huán)境中的CD8+和γδ+T 細(xì)胞浸潤(rùn)最終導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)及臨床標(biāo)本檢測(cè)，分析CD73 表達(dá)水平在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。結(jié)果提示乳腺癌發(fā)生過程中，肥胖患者脂肪組織為腫瘤微環(huán)境提供了更高的CD73 水平，其產(chǎn)物腺苷可以與CTL 細(xì)胞上的A2AR 受體結(jié)合，引起c-AMP 在細(xì)胞內(nèi)積累，結(jié)合調(diào)節(jié)亞基PKA，抑制T 細(xì)胞受體結(jié)合的促炎癥信號(hào)，阻止高效的CTL活化、擴(kuò)增和IFN-γ 產(chǎn)生，使細(xì)胞毒性抗腫瘤免疫力失去作用，并導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境血管形成和免疫抑制細(xì)胞浸潤(rùn)等促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的副作用，最終導(dǎo)致免疫逃［24］。靶向CD73-腺苷信號(hào)通路可能成為肥胖相關(guān)乳腺癌臨床治療新的靶點(diǎn)。

本研究仍然存在一些局限性，比如，臨床樣本來(lái)自單中心非隨機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)，肥胖人群臨床患者納入數(shù)量有待進(jìn)一步累積；此外，CD73 作用的分子機(jī)制有待更深入的實(shí)驗(yàn)結(jié)果論證，以進(jìn)一步明確肥胖與嘌呤能信號(hào)通路間的具體聯(lián)系，及其在促進(jìn)肥胖相關(guān)乳腺癌進(jìn)展中的作用。