顧 堯， 李 言， 錢海峰， 張 暉， 齊希光， 王 立

(江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214122)

天然酵母是指利用谷物、水果等天然基質(zhì)表面附著的野生酵母和乳酸菌等菌株進(jìn)行發(fā)酵的發(fā)酵劑[1]，其來源包括谷物、水果和花卉等。傳統(tǒng)天然酵母中含有酵母菌和乳酸菌兩類微生物，通常在穩(wěn)定的天然酵母體系中乳酸菌的數(shù)量大約是酵母菌的100倍，與常規(guī)酵母相比，天然酵母具有改善谷物面團(tuán)質(zhì)構(gòu)、延長保質(zhì)期和改良風(fēng)味的作用[2]。本文主要就面團(tuán)基谷物發(fā)酵食品食品進(jìn)行闡述，其他類型將簡要概括。近年來的研究熱點(diǎn)主要是天然酵母發(fā)酵相對(duì)于其他發(fā)酵劑所提供的功能特性和營養(yǎng)優(yōu)勢(shì)[3]。本文從谷物發(fā)酵食品、天然酵母菌群分離純化鑒定和活性發(fā)酵劑制備方法等方面綜述分析研究現(xiàn)狀及存在的問題，并對(duì)未來研究趨勢(shì)進(jìn)行展望，以期為天然酵母發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供借鑒。

1 天然酵母谷物制品

1.1 天然酵母面包

吳君艷等[4]利用葡萄干制備天然酵母液，并以此制備天然酵母面包，當(dāng)葡萄干天然酵母液用量為12%、白砂糖18%、黃油9%、改良劑0.3%時(shí)，面包接受程度較高(感官評(píng)分為86)。Garzon等[5]研究了添加小球藻的酸面團(tuán)品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗氧化活性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)酸面團(tuán)與常規(guī)普通面團(tuán)相比，能更好地保持其抗氧化活性。Jolita等[6]研究發(fā)現(xiàn)藜麥天然酵母發(fā)酵面包與常規(guī)藜麥面包相比，面包硬度降低了5.6%、老化率降低了54%。這些研究表明天然酵母發(fā)酵在改善面包品質(zhì)、延長保質(zhì)期等方面有較好的前景。

天然酵母能夠改善面包的質(zhì)構(gòu)、比容和色澤等品質(zhì)。Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)天然酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞外多糖(主要是葡聚糖)，能改善面團(tuán)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，天然酵母對(duì)面團(tuán)的流變學(xué)也有顯著影響，Moore等[8]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸性物質(zhì)會(huì)提高谷蛋白的分解程度，賦予面包更好的彈性；Nami等[9]發(fā)現(xiàn)短乳桿菌發(fā)酵通過改變面團(tuán)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)來降低面包的硬度；Cizeikiene等[10]發(fā)現(xiàn)嗜熱乳酸菌發(fā)酵劑可以增加面包的比容和彈性。天然酵母中含有的乳桿菌可以在發(fā)酵時(shí)改善面筋蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而通過影響面團(tuán)的黏彈性和持氣能力來增大面包比容和降低面包硬度，但現(xiàn)階段缺少針對(duì)通過不同途徑生效的面筋網(wǎng)絡(luò)改善能力的對(duì)比研究，且對(duì)于改良物質(zhì)的上下有效限量等影響規(guī)律沒有深入研究。

圍繞天然酵母面包感官特性的研究發(fā)現(xiàn)，天然酵母發(fā)酵過程會(huì)使風(fēng)味物質(zhì)含量提高。陳友磊等[11]制備天然酵母面包時(shí)發(fā)現(xiàn)天然酵母發(fā)酵液添加量超過25%，會(huì)由于發(fā)酵產(chǎn)生的酸性物質(zhì)過多而使得面包的口味偏酸。Brandt等[12]比較了不同天然酵母發(fā)酵劑制備酸面團(tuán)的基本性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)干燥過程會(huì)將除乙酸外的風(fēng)味物質(zhì)富集起來，使得干制發(fā)酵劑比新鮮發(fā)酵劑發(fā)酵的面團(tuán)更有麥芽味。Liu等[13]利用RNA測(cè)序技術(shù)研究中國傳統(tǒng)天然酵母，發(fā)現(xiàn)醛類風(fēng)味物質(zhì)除了由脂質(zhì)氧化產(chǎn)生，有部分還可以由特定乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生，同時(shí)醛類在天然酵母發(fā)酵過程中也可以作為電子受體而被還原。Zhao等[14]研究肽對(duì)酸面包風(fēng)味的影響，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵會(huì)將游離氨基酸轉(zhuǎn)化為γ-谷氨酰二肽以提高風(fēng)味強(qiáng)度。面包的揮發(fā)性物質(zhì)主要來自發(fā)酵過程、美拉德反應(yīng)和氧化過程[15]，天然酵母的發(fā)酵過程對(duì)面包風(fēng)味形成有直接影響的同時(shí)還會(huì)在美拉德反應(yīng)過程和氧化過程中通過底物間接影響風(fēng)味。在中長期發(fā)酵過程中(12～24 h)揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生規(guī)律已有相關(guān)研究[16]，但其中部分風(fēng)味物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的機(jī)理還未明確。

微生物污染和老化是影響面包保質(zhì)期的主要原因。在對(duì)發(fā)酵過程的研究中發(fā)現(xiàn)菌種競(jìng)爭(zhēng)性抑制和發(fā)酵代謝物抑制是天然酵母發(fā)酵抑制腐敗菌生長的主要原因[17]。王志軍等[18]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵對(duì)減緩水分損失和抑制淀粉回生焓值的增長有積極影響，其中含有短乳桿菌的單菌種天然酵母發(fā)酵使面包的老化焓值降低了29%。Scamato等[19]研究發(fā)現(xiàn)天然酵母和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶能協(xié)同催化蛋白質(zhì)交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善面包的流變學(xué)性質(zhì)和持水能力。這些研究表明天然酵母在發(fā)酵過程中生成的酸性產(chǎn)物和酶共同作用下使得蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改善，進(jìn)而提高了面團(tuán)持水性和黏彈性來減慢面包老化，降低面包老化焓值。

1.2 天然酵母饅頭

饅頭與面包相比可以避免烘烤時(shí)的美拉德反應(yīng)而保留更多的氨基酸，因此更具有營養(yǎng)優(yōu)勢(shì)。Sun等[20]利用米酒酵母來制備天然酵母饅頭，發(fā)現(xiàn)當(dāng)米酒酵母的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，饅頭的比容、硬度、白度和感官評(píng)分都為最佳。王雪婷等[21]比較了不同地區(qū)傳統(tǒng)天然酵母制備苦蕎麩皮饅頭的品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)運(yùn)城和周口地區(qū)的天然酵母發(fā)酵力最強(qiáng)，且運(yùn)城天然酵母制備的饅頭具有較高的抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5.2%)和較低的淀粉水解率(42%)。Wu等[22]研究發(fā)現(xiàn)舊金山乳桿菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可以使饅頭更加柔軟。目前對(duì)于改善饅頭質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味品質(zhì)的研究較多，但缺少對(duì)于天然酵母饅頭營養(yǎng)品質(zhì)與健康相關(guān)的研究。

近年來的研究熱點(diǎn)包括發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)的來源和乳酸菌產(chǎn)出的胞外多糖對(duì)饅頭的作用。Yan等[23]利用非靶向組學(xué)研究傳統(tǒng)酸面團(tuán)饅頭的香氣特征，發(fā)現(xiàn)酯類風(fēng)味物質(zhì)主要由天然酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸和酒精經(jīng)過蒸煮反應(yīng)生成。國內(nèi)對(duì)利用天然酵母實(shí)現(xiàn)饅頭風(fēng)味改良的研究較少，可能與酸味不符合我國大部分人群的味覺習(xí)慣有關(guān)。胞外多糖主要是由天然酵母含有的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的[24]。Tang等[25]研究了胞外多糖對(duì)饅頭的品質(zhì)影響，發(fā)現(xiàn)高含量的胞外多糖在弱酸性條件下可使谷蛋白顆粒團(tuán)聚，進(jìn)而改善饅頭的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使饅頭比容增加、硬度降低。Xu等[26]研究發(fā)現(xiàn)胞外多糖改善饅頭品質(zhì)的程度優(yōu)于其對(duì)面包的作用。天然酵母發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)于饅頭的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有較好的改善作用，因此在對(duì)其作用規(guī)律進(jìn)行深入研究后有可能應(yīng)用于天然改良劑開發(fā)。

1.3 米粉

發(fā)酵米粉在加工過程中一般需要浸泡3～7 d讓其表面上附著的天然酵母菌群充分發(fā)酵，有研究表明發(fā)酵后的米粉品質(zhì)結(jié)構(gòu)和感官特性要優(yōu)于非發(fā)酵米粉[27]。天然酵母發(fā)酵過程對(duì)米粉的品質(zhì)改良主要體現(xiàn)在質(zhì)構(gòu)上。肖勇生等[28]研究秈米為原料的發(fā)酵米粉工藝，發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種比例(乳酸菌與酵母菌質(zhì)量比)為3∶1、接種量2%、發(fā)酵溫度25℃和發(fā)酵時(shí)間5.5 d時(shí)生產(chǎn)的發(fā)酵米粉形態(tài)風(fēng)味俱佳。Xu等[29]利用糙米開發(fā)米粉類產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)糙米在天然酵母發(fā)酵過程中粗蛋白含量增多，含水量略有下降，同時(shí)在成品煮制過程中水相濁度變化不大。Zhan等[30]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的米粉淀粉顆粒比未發(fā)酵的米粉淀粉顆粒在糊化時(shí)膨脹更大且不易破碎，同時(shí)糊化溫度降低，進(jìn)而使成品煮制后更有彈性。馬霞等[31]研究發(fā)現(xiàn)天然酵母發(fā)酵過程降低了米粉的脂肪含量，這有利于淀粉膨潤和淀粉凝膠的形成。發(fā)酵米粉制作中隨著發(fā)酵時(shí)酸度的增加，酵母菌被抑制(約為乳酸菌的1/100)，主要依靠乳酸菌發(fā)酵過程產(chǎn)物對(duì)米粉的淀粉顆粒進(jìn)行了改性進(jìn)而影響米粉品質(zhì)，但發(fā)酵過程使淀粉無定形區(qū)輕微水解的作用機(jī)制還不清晰。

1.4 其他產(chǎn)品

以谷物為原料的天然酵母發(fā)酵產(chǎn)品還有許多，如餅類、酒類、玉米產(chǎn)品、意大利面等，這些產(chǎn)品或多或少都通過發(fā)酵過程在質(zhì)構(gòu)、感官、營養(yǎng)或保質(zhì)期方面得到了提升。Li等[32]比較了不同的米品種發(fā)酵后制備酒釀的品質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)天然酵母發(fā)酵黑糯米的總酚和總黃酮含量較高。Cagno等[33]研究發(fā)現(xiàn)利用天然酵母發(fā)酵可以大大降低谷物蛋白含量(約降至20%)，進(jìn)而使天然發(fā)酵意大利面的黏度硬度稍低于正常產(chǎn)品，同時(shí)保持其風(fēng)味。天然酵母有廣闊的可運(yùn)用范圍，但大部分領(lǐng)域都停留在“添加—改良”的基礎(chǔ)運(yùn)用上，缺少對(duì)天然酵母菌種改良能力的深入研究，沒有對(duì)天然酵母菌群多樣性有清晰的認(rèn)知。

2 發(fā)酵菌種分離純化與鑒定

天然酵母發(fā)酵能提升產(chǎn)品品質(zhì)，但因?yàn)樘烊唤湍赴l(fā)酵力不強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間長。因此，探究發(fā)酵活力強(qiáng)、產(chǎn)物風(fēng)味足和改良作用好的菌株及其配比顯得尤為重要。

2.1 菌種分離純化

通過對(duì)不同來源的天然酵母進(jìn)行分離純化、獨(dú)立培養(yǎng)可以得到較純的菌株，從而能夠進(jìn)一步復(fù)配研究其發(fā)酵能力和發(fā)酵特性。在提升面包整體品質(zhì)方面，相雯研等[34]通過篩選天然酵母菌株進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離鑒定出的酵母菌LBBE-1與釀酒酵母YJM1478菌株有98.32%的同源性，同時(shí)利用其制備面包在組織形態(tài)、氣味、口感和儲(chǔ)藏性能分別較商業(yè)酵母提升1.8%、7.7%、7.4%和7.9%，但其醒發(fā)時(shí)間比商業(yè)面包酵母長(增加30%～50%)。虞椏芳[35]在研究天然酵母對(duì)面包品質(zhì)影響時(shí)通過篩選菌種進(jìn)行復(fù)配，確定S. cerevisiae LY4、L. rossiae QB7、L. brevis QB11和L. plantarum QB15的配比為3∶100∶100∶100時(shí)制備的面包有最好的質(zhì)構(gòu)和感官品質(zhì)。因?yàn)椴煌瑏碓捶蛛x出的酵母菌和乳酸菌的生存能力、發(fā)酵能力、發(fā)酵產(chǎn)物等都有較大區(qū)別，因此分離、篩選、復(fù)配天然酵母將是未來天然酵母發(fā)酵劑生產(chǎn)必需的研究方向。

2.2 天然酵母菌種鑒定

Corona等[36]通過獨(dú)立菌株培養(yǎng)從當(dāng)?shù)靥烊唤湍钢需b定出了4種專性異型乳酸菌菌株：WeissellacibariaPON10030和PON10032和LeuconostoccitreumPON 10079和PON10080。Xing等[37]對(duì)河南省3種不同地形下傳統(tǒng)酵母群的微生物多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌在酸面團(tuán)樣品中屬于優(yōu)勢(shì)種，占相對(duì)豐度的58%，同時(shí)盆地群中的優(yōu)勢(shì)屬(主要是片球菌屬)與山地群和平原群(乳酸菌)有顯著差異。Fraberger等[38]比較了傳統(tǒng)小麥和黑麥酸面團(tuán)的微生物多樣性，從天然酵母含有的乳酸桿菌中鑒定出5個(gè)屬33個(gè)種，其中以異型乳桿菌為主，在小麥天然酵母中還鑒定出明串珠菌屬、鏈球菌屬和片球菌屬；關(guān)于酵母菌，僅鑒定出7個(gè)種類，其中63%的酵母菌屬于釀酒酵母。天然酵母微生物多樣性不僅體現(xiàn)在來源方面，環(huán)境因素也會(huì)影響。不同來源的天然酵母鑒定出的酵母菌種和乳酸菌種見表1。

表1 分離鑒定出的發(fā)酵菌種種類

續(xù)表1

3 活性發(fā)酵劑制備方法

工廠生產(chǎn)中主要依靠制作液體發(fā)酵劑來生產(chǎn)天然酵母產(chǎn)品，但若要達(dá)到穩(wěn)定連續(xù)化生產(chǎn)，該方法還存在一些不足：培養(yǎng)過程復(fù)雜而繁瑣、需要專業(yè)人員操作和準(zhǔn)備時(shí)間長[57]。為此，研究者利用菌種保藏方法對(duì)天然酵母進(jìn)行加工，制備活性發(fā)酵劑以縮短使用前的加工時(shí)間并降低制備難度。

3.1 預(yù)處理

制備高活性發(fā)酵劑的流程主要包括：菌種選育培養(yǎng)、高密度增殖、菌種分離和干燥收集[58]。首先菌種選擇時(shí)要注重菌種的生存能力、發(fā)酵能力和其發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味特性，可通過菌種純化來篩選優(yōu)勢(shì)菌種。Mantzourani等[59]研究冷凍干燥固定化生物催化劑作為酸面包發(fā)酵劑的效果，發(fā)現(xiàn)將天然酵母中的副乳桿菌凍干制備成菌粉后制作面包的效果最好，能產(chǎn)生較柔和的酸味。吳佳靜等[60]利用葡萄天然發(fā)酵液的制備凍干復(fù)合發(fā)酵劑以提高面包的烘焙品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)釀酒酵母、乳酸明串珠菌和植物乳桿菌配比為1∶1.5∶1.5時(shí)面包比容和硬度均優(yōu)于普通酵母面包，且該發(fā)酵劑在4 ℃儲(chǔ)藏91 d后菌株存活率仍有81.78%。菌種選擇是決定發(fā)酵劑性能的關(guān)鍵，找到具備強(qiáng)發(fā)酵能力和穩(wěn)定性的菌株來縮短發(fā)酵時(shí)間是目前的研究熱點(diǎn)之一。

其次在菌種培養(yǎng)過程中，Morgan等[61]總結(jié)了常用的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分(乳清、脫脂乳和麥芽汁)，這些培養(yǎng)基的特點(diǎn)是效率高、成本低、來源廣泛。菌種增殖后為了進(jìn)一步提高菌種濃度，以方便后續(xù)干燥，一般采用離心法將菌種富集起來，生產(chǎn)中一般依靠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和時(shí)間以降低菌種死亡率。需要特別注意的是，在菌種對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行離心分離會(huì)導(dǎo)致菌種存活率低，因?yàn)閷?duì)數(shù)生長期的細(xì)胞處于大量繁殖階段，細(xì)胞壁膜比較薄，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)累計(jì)不足，抵抗外界條件變化能力差[62]。

3.2 干燥方法

3.2.1 冷凍干燥

天然酵母中含有的乳酸菌在冷凍干燥后可能出現(xiàn)延遲恢復(fù)甚至不能恢復(fù)的現(xiàn)象[63]，主要是因?yàn)槿樗峋诶浯碳は聲?huì)發(fā)生一系列改變，例如細(xì)胞膜的變化，進(jìn)而由DNA的變化對(duì)轉(zhuǎn)錄、翻譯產(chǎn)生影響等[64]。由于碳水化合物可以在干燥時(shí)替代細(xì)胞膜中水的位置，一般認(rèn)為以海藻糖為代表的小分子糖類保護(hù)劑對(duì)乳酸菌冷凍干燥過程有保護(hù)作用。Stefanello等[65]比較發(fā)現(xiàn)5%海藻糖對(duì)酵母菌的保護(hù)效果好，對(duì)乳酸菌效果不好，而10%蔗糖對(duì)乳酸菌的保護(hù)效果較好。李周勇等[66]優(yōu)化得到凍干菌粉的凍干保護(hù)劑配方為：5%蔗糖、2%甘油、0.8%谷氨酸鈉、1%抗壞血酸、5%海藻糖，此時(shí)凍干嗜熱鏈球菌MN002的菌體存活率可達(dá)84.8%。Gul等[67]研究保護(hù)劑對(duì)乳酸菌儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)保護(hù)劑脫脂乳為20 g/100 mL、乳糖為3.57 g/100 mL、蔗糖為10 g/100 mL時(shí)凍干彎曲乳桿菌后的細(xì)胞存活率達(dá)98%。添加保護(hù)劑可以保護(hù)菌體免受冷凍傷害，不同保護(hù)劑對(duì)不同菌種的保護(hù)效果不同，針對(duì)天然酵母多菌種的狀態(tài)需要利用不同保護(hù)劑復(fù)配來達(dá)到遠(yuǎn)勝于單一保護(hù)劑的保護(hù)效果。

其他影響因素主要與溫度條件有關(guān)，任香蕓等[68]研究直投式發(fā)酵劑制備方法，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌R23采用梯度預(yù)凍(-20、-40、-80 ℃各1、2、3 h)可使預(yù)處理菌液達(dá)到較好的凍結(jié)效果且發(fā)酵劑物料凍干至水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%時(shí)最有利于儲(chǔ)藏。降溫速度要選取適中值，過快則冰晶在細(xì)胞內(nèi)形成傷害細(xì)胞；過慢則水分流出細(xì)胞太久，導(dǎo)致細(xì)胞失活。

3.2.2 噴霧干燥

影響噴霧干燥菌種存活率的主要因素是溫度條件和保護(hù)劑(表2)，可以看出噴霧干燥的溫度條件相對(duì)于常規(guī)食品較低。Martin等[69]總結(jié)了微囊化技術(shù)對(duì)益生菌的影響，發(fā)現(xiàn)與入口溫度相比，乳酸菌的生存更依賴出口溫度，在相同的進(jìn)口溫度條件下，進(jìn)料速率越高，出口溫度越低，相應(yīng)的菌種成活率越高。雖然在較低的干燥溫度下細(xì)菌存活率較高，但噴霧干燥微膠囊粉末的殘余水分含量也會(huì)增加。這種情況會(huì)導(dǎo)致剩余水分含量增大，粉末黏在管壁上影響收集效率。在流化床干燥時(shí)，即使在最佳操作參數(shù)下生產(chǎn)活性天然酵母粉，最高細(xì)胞存活率也僅為75%[70]，這表明天然酵母在現(xiàn)有的工業(yè)化菌種干燥設(shè)備中存活率還不高，還需要對(duì)干燥工藝和生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行研究和改進(jìn)以適應(yīng)多菌種干燥的復(fù)雜情況。

表2 噴霧干燥法對(duì)不同菌種的處理效果

4 總結(jié)與展望

天然酵母發(fā)酵中多種微生物共同發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸和乳酸能改善面團(tuán)的風(fēng)味并延長其保質(zhì)期，發(fā)酵過程及其產(chǎn)物也會(huì)改良面團(tuán)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。但現(xiàn)階段天然酵母還存在發(fā)酵時(shí)間長、發(fā)酵劑品質(zhì)難以穩(wěn)定控制等不足，建議后續(xù)研究可以從3個(gè)方面開展：新型DNA測(cè)序技術(shù)將有助于從基因?qū)用胬斫獍l(fā)酵過程中發(fā)酵食品風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)的改變過程，從而達(dá)到預(yù)測(cè)發(fā)酵效果的目標(biāo)；天然酵母發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)、發(fā)酵中間產(chǎn)物與產(chǎn)品品質(zhì)之間的相互作用關(guān)系有待進(jìn)一步研究；復(fù)配干酵母制備的產(chǎn)品的風(fēng)味質(zhì)構(gòu)與液狀天然酵母發(fā)酵劑還有差距，有待進(jìn)一步改進(jìn)。