王穎旺，陳燕凌，田志革，胡曉亮#

（1.宜賓市翠屏區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川宜賓 644000；2.宜賓市動物疫病預(yù)防控制中心，四川宜賓 644000；3.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部/動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）在小腸上皮細(xì)胞中幾乎完全復(fù)制，導(dǎo)致絨毛萎縮、吸收不良和嚴(yán)重腹瀉，引起傳染性腸道疾?。▏I吐、腹瀉和脫水），造成豬嚴(yán)重的精神、食欲狀況下降，引起仔豬的高死亡率，成年豬的生長緩慢，并且各種年齡的豬均易感染。2010年，由PEDV變種引起的PED大規(guī)模爆發(fā)在中國發(fā)生，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

偽狂犬病病毒（PRV）主要侵害豬的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，并且破壞豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致豬的多重感染，增加其死亡率。豬是PRV的天然宿主和重要感染源，可通過豬配種進(jìn)行生殖系統(tǒng)感染，當(dāng)妊娠母豬感染后，又通過胎盤進(jìn)行垂直感染胎兒，嚴(yán)重會造成流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎等。導(dǎo)致新生崽豬數(shù)量質(zhì)量的下降，直接造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

經(jīng)典豬瘟（CSFV）在臨床中其發(fā)病率和病死率都在90%以上，豬是本病唯一的自然宿主，是高度傳染性病毒性疾病，傳染性強(qiáng)、死亡率高、是一種嚴(yán)重的跨界疾病，威脅著全球的生豬生產(chǎn)。分為以下幾種疾病形式:急性、慢性和持續(xù)性病程。表現(xiàn)出高燒、厭食、胃腸癥狀、全身虛弱，結(jié)膜炎，不協(xié)調(diào)、癱瘓和抽搐，皮膚出血或發(fā)紺（如耳朵、四肢和腹部）。同時，病毒通過胎盤屏障，從而傳染給胎兒，而被感染的小豬看起來很健康，在此期間，它們釋放出足以傳播的高病毒載量[7]。

在規(guī)?；B(yǎng)殖的豬場，2種或2種以上病毒共同感染的情況經(jīng)常發(fā)生。僅憑借臨床癥狀，很難斷定疫病是由單一病毒還是由多種病毒所引起。傳染性疫病傳統(tǒng)的診斷較為費(fèi)時；PCR方法較傳統(tǒng)方法敏感，并已經(jīng)用于多種豬病原的檢測。但單一病毒特異的PCR方法，檢測成本較高。因此，建立一種快速、又可信度高的檢測方法，對病毒進(jìn)行鑒定，將有利于疾病的準(zhǔn)確診斷和疫病的流行病學(xué)監(jiān)測。

本研究以3種重要豬源病毒?。≒EDV、PRV、CSFV）為研究對象，通過條件優(yōu)化建立特異性好、靈敏度高的3種病原三重PCR檢測方法，為我國生豬市場豬病檢測與管理提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸

非洲豬瘟（ASFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、經(jīng)典豬瘟（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的核酸均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所湯艷東博士饋贈，病毒RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲取的cDNA保存在動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

Premix TaqDNA聚合酶購自Gen Star公司，DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂粉、TAE緩沖液（50倍）、EB替代染料為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

在NCBI網(wǎng)站下載的PEDV、PRV、CSFV的基因序列，用DNA STAR的MegAlign程序?qū)ο螺d的基因序列進(jìn)行比對，選擇保守區(qū)，利用Oligo軟件針對保守區(qū)各設(shè)計(jì)1對引物，引物序列及擴(kuò)增目的片段的大小見表1。引物由成都擎科生物工程公司合成，使用時，用ddH2O將引物稀釋至10μmol/L，置于-20℃冰箱保存。

表1 三重PCR引物信息

1.4 三重PCR檢測方法的建立

以PEDV、PRV和CSFV的核酸混合物作為模板建立PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系采用50 μl，加25 μl Taq PCR Master Mix于體系中，PEDV、PRV和CSFV模板經(jīng)適當(dāng)稀釋后（濃度分別為3.5 ng/μl，5 ng/μl，12 ng/μl）各 加1μL、PEDV、PRV和CSFV上下引物濃度（10 μmol/L ）各0.75 μl、最后加滅菌ddH2O補(bǔ)足50 μl。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μl于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。

1.5 三重PCR檢測方法的條件優(yōu)化

1.5.1 退火溫度優(yōu)化試驗(yàn)

采用50 μl的反應(yīng)體系，進(jìn)行退火溫度優(yōu)化。PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變5 min；94℃變性30 s,梯度溫度（50℃、52.5℃、54.5℃、56.2℃、57.3℃、60℃）退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，確定最佳退火溫度。

1.5.2 引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)化的退火溫度，進(jìn)行引物濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。設(shè)置0.1μmol/L、0.15μmol/L、0.2 μmol/L 3個引物濃度，PCR反應(yīng)程序同1.5.1，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μl于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，確定最佳引物濃度。

1.5.3 敏感性試驗(yàn)

根據(jù)已優(yōu)化的反應(yīng)條件，將PEDV（原始濃度為350 ng/μl）、PRV（原始濃度為1200 ng/μl）、CSFV(原始濃度為500 ng/μl)的模板進(jìn)行10-1～10-10倍比稀釋，各加1 μl于50 μl的體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μl于2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，確定三重PCR檢測方法的敏感性。

1.5.4 特異性試驗(yàn)

根據(jù)已優(yōu)化的反應(yīng)條件，在PCR反應(yīng)體系中，加入PEDV、PRV、CSFV、上下引物（10 μmol/L）各0.75 μl，加入PEDV、PRV、CSFV、PRRSV、ASFV的模板各1 μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μl于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，驗(yàn)證三重PCR檢測方法的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 三重PCR檢測方法的建立

通過建立的三重PCR檢測反應(yīng)體系，對PEDV、PRV、CSFV的核酸模板及混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別獲得了它們各自對應(yīng)的條帶，大小分別為518bp、401bp、213bp，與預(yù)期相符（見圖1）。

2.2 退火溫度的優(yōu)化

采用不同的退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由結(jié)果可知（見圖2），退火溫度為52.5℃時，效果較好。54.5℃、56.2℃、57.3℃、60℃；8.陰性對照。

2.3 引物濃度優(yōu)化

采用不同濃度的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由結(jié)果可知（見圖3～4）最佳引物濃度為0.15 μmol/L。

2.4 敏感性試驗(yàn)

將PEDV、PRV、CSFV核酸經(jīng)10倍倍比稀釋（PEDV原始濃度350 ng/μl；PRV原始濃度1200 ng/μl；CSFV原始濃度500 ng/μl）后作為模板，進(jìn)行三重PCR反應(yīng)，檢測其敏感性。結(jié)果顯示，該方法對PEDV、PRV、CSFV的最低檢測限分別為3.5pg、12pg、0.05pg（見圖5）。

2.5 特異性試驗(yàn)

用提取的PEDV、PRV、CSFV、PRRSV、ASFV的核酸作為模板，同時以ddH2O作為陰性對照，利用優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行三重PCR檢測方法的特異性實(shí)驗(yàn)。由圖5可知，，建立的三重PCR方法對PEDV、PRV、CSFV的核酸能進(jìn)行特異性擴(kuò)增，對其他病毒核酸模板無擴(kuò)增，表明該檢測方法具有較強(qiáng)的特異性。

3 討論

近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，豬傳染病對豬群健康有著極大的威脅，豬傳染性疾病的多重感染或混合感染為主要流行形式，張森發(fā)現(xiàn)70.00%以上的病豬以病毒病為主并且80.00%以上的病豬均是由2種或2種以上的病原體混合感染，導(dǎo)致病豬臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜化[2]。因此，建立一種快速、高效、成本低的多重PCR檢測方法非常有必要。

本試驗(yàn)建立關(guān)于PEDV、PRV和CSFV的三重PCR檢測方法，敏感性、特異性結(jié)果表明，該方法具有良好的敏感性和特異性。

本研究建立的三重PCR檢測方法，對PEDV、PRV、CSFV具有同時檢測的效果，保持了單重PCR檢測方法的準(zhǔn)確性，又具有高效性和經(jīng)濟(jì)節(jié)約性，此方法可廣泛應(yīng)用其他地區(qū)的各養(yǎng)豬場傳染病的檢測，有良好應(yīng)用前景。