李耀英，謝紅珍，林樂濤，鐘智輝，馮 凱，趙 亮，張艷玲*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3.檢驗與生物技術(shù)學(xué)院， 廣東 廣州 510515；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心實驗研究部華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室，4.微創(chuàng)介入治療科，廣東 廣州 510060；5.深圳市第三人民醫(yī)院放射科，廣東 深圳 518112)

我國肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者數(shù)量約占全球一半以上，且呈明顯上升趨勢[1]。植入放射性125I粒子近距離放射治療(放療)多種中晚期實體腫瘤效果較佳，相比其他治療方式作用時間長、不良反應(yīng)少。125I粒子可持續(xù)產(chǎn)生低劑量射線以促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡[2-3]。本研究基于前期構(gòu)建的125I粒子體外驗證模型[3]，觀察125I粒子治療HCC的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 PLC/PRF/5細(xì)胞及HepG2細(xì)胞(ATCC細(xì)胞庫)，RNA提取試劑盒(上海奕杉生物科技)，Gene Chip prime view human Array人基因表達(dá)譜芯片(吉凱基因)，Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑(艾科瑞生物科技)，iTaq Universal SYBR?GreenSupermix(美國Bio-Rad)，LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀(瑞士Roche)，蛋白提取試劑盒(上海奕杉生物科技)，雙特異性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1, DUSP1)、Sestrin2蛋白(stress induced protein 2, SESN2)、乙?；D(zhuǎn)移酶2(establishment of sister chromatid cohesion N-acetytransferase 2, ESCO2)及人DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3(DNA damage inducible transcript 3, DDIT3)抗體(英國abcam)，辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(Santa Cruz)；ChemiDoc成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將PLC/PRF/5細(xì)胞及HepG2細(xì)胞以5×104個/孔鋪至6孔板；將PLC/PRF/5細(xì)胞置于含10%胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基中，將HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 分組 選取PLC/PRF/5，分為125I粒子組和空白對照組，均按1×106個/孔將細(xì)胞鋪于transwell小室上室；基于前期構(gòu)建的125I粒子體外驗證模型[3]，按治療計劃系統(tǒng)(treatment planning system, TPS)規(guī)劃均勻放置6顆0.8 mCi125I粒子于125I粒子組的下室(圖1)，累積接受125I劑量D90為4.5 Gy；對空白對照組下室不做任何處理；5天后收取細(xì)胞(圖2)，每組3個樣本。

1.4 平板克隆實驗 選取PLC/PRF/5細(xì)胞及HepG2細(xì)胞，按1.3分別分為125I粒子處理組和空白對照組進(jìn)行處理；之后按1×105個/孔將細(xì)胞鋪于6孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每隔2～3天更換1次培養(yǎng)基；2周后以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)浸洗并用無水甲醇固定，采用5%結(jié)晶紫染料染色后，于顯微鏡下拍照觀察。

圖1 以 125I粒子處理PLC/PRF/5細(xì)胞 A.模型圖，transwell小室的上室為PLC/PRF/5細(xì)胞，下室為125I粒子； B.transwell小室下室125I粒子分布實物圖； C.TPS顯示125I粒子位置； D.TPS顯示125I粒子輻照范圍，藍(lán)圈為下室輻照范圍，紫圈為上室輻照范圍

圖2 TPS計算125I粒子處理5天后PLC/PRF/5細(xì)胞劑量曲線及其參數(shù)

1.5 免疫熒光染色 將PLC/PRF/5細(xì)胞分為125I粒子組和空白對照組進(jìn)行處理；按1×105個/孔將細(xì)胞鋪至放有玻片的6孔板，培養(yǎng)72 h后，以PBS浸洗玻片，并采用0.5% TritonX-100將其于室溫下通透20 min，再次以PBS浸洗，以山羊血清于室溫下封閉30 min，去封閉液并加入γH2AX抗體后于4℃孵育過夜；次日以含吐溫-20的PSB(PBS tween-20, PBST)浸洗玻片，之后加入鼠二抗，于37℃下避光孵育1 h，再次以PBST浸洗后滴加DAPI，避光孵育5 min，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 提取總RNA 采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞樣品總RNA。Nanodrop質(zhì)檢正常值為1.90

1.7 基因芯片檢測 以agilent 2100分析總RNA樣品后，采用GeneChip 3'IVT Express Kit制備aRNA(amplified RNA)，通過二鏈合成得到雙鏈DNA模板，再經(jīng)體外反轉(zhuǎn)獲得帶生物素標(biāo)記的aRNA；純化aRNA并將其片段化后與芯片探針雜交，完成后對芯片進(jìn)行洗染；最后進(jìn)行掃描，得到原始數(shù)據(jù)。評價芯片原始數(shù)據(jù)質(zhì)量，對質(zhì)量控制合格的數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)信息分析，包括顯著性差異分析及差異基因的功能分析等。

1.8 qPCR下游基因檢測 提取PLC/PRF/5細(xì)胞樣品總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；配置iTaq Universal SYBR?GreenSupermix反應(yīng)體系，于PCR儀中擴增cDNA。以2-ΔΔCt反映基因表達(dá)水平。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白 提取PLC/PRF/5細(xì)胞總蛋白，以二辛可寧酸含量檢測法(bicinchoninic acid assay, BCA)測定蛋白濃度。一抗孵育稀釋比例為DUSP1 1∶200，SESN2 1∶300，ESCO2 1∶100，DDIT3 1∶500。DUSP1和ESCO2為兔二抗，SESN2和DDIT3為鼠二抗；均以1∶2 000稀釋。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，以基于經(jīng)驗貝葉斯分布的線性模型[4]計算顯著差異水平，并以Benjamini-Hochberg法對顯著差異水平進(jìn)行校正；以|Fold Change|>1.5且FDR(false discovery rate)校正P<0.05為顯著差異基因。采用GraphPad prism 8.0統(tǒng)計分析軟件。以±s表示符合正態(tài)分布的計量資料，組間行t檢驗；以Pearson相關(guān)性分析評價相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 平板克隆實驗及免疫熒光染色 相比空白對照組，125I粒子組PLC/PRF/5及HepG2細(xì)胞的平板克隆能力均顯著降低(圖3A、3B)，PLC/PRF/5細(xì)胞內(nèi)γH2AX熒光明顯增加(圖3C)。

圖3 125I粒子組與空白對照組平板克隆實驗及免疫熒光染色圖 A、B.PLC/PRF/5(A)及HepG2細(xì)胞(B)平板克隆實驗； C.PLC/PRF/5細(xì)胞免疫熒光染色

2.2 評估芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量 所有樣本的中位數(shù)Z-score均小于2，表明芯片實驗可靠性高、數(shù)據(jù)重復(fù)性較好，符合繼續(xù)分析標(biāo)準(zhǔn)(圖4A)。125I粒子組及空白對照組PLC/PRF/5細(xì)胞樣本基因表達(dá)的組內(nèi)r均>0.99而組間r=0.91，符合繼續(xù)分析標(biāo)準(zhǔn)(圖4B)。主成分分析(principal component analysis, PCA)得分圖顯示，PC1及PC2維度上，125I粒子組及空白對照組組內(nèi)樣本聚集趨勢及組間樣本分離趨勢均明顯，符合繼續(xù)分析標(biāo)準(zhǔn)(圖4C)。

圖4 芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 A.相對對數(shù)信號強度箱線圖(橫坐標(biāo)表示樣本名稱，縱坐標(biāo)表示相對對數(shù)信號強度)； B.樣品基因表達(dá)Pearson相關(guān)系數(shù)分布圖(紅色表示相關(guān)性高，藍(lán)色表示相關(guān)性低)； C.PCA得分圖(紅點代表空白對照組樣本，綠點代表125I粒子組樣本)

2.3 IPA分析125I粒子調(diào)控HCC細(xì)胞的經(jīng)典通路及調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 將顯著差異基因數(shù)據(jù)輸入IPA軟件，行經(jīng)典通路分析，結(jié)果顯示，顯著差異基因參與的Acute Phase Response Signaling經(jīng)典通路被抑制時，Z-score為-1.00，Ras、CFB、SAA、RBP及C1等106個基因表達(dá)上調(diào)，SOCS3、MKK3/6、SOD2、c-FOS及c-JUN等276個基因表達(dá)下調(diào)。見圖5、6。

圖5 125I粒子調(diào)控HCC細(xì)胞的經(jīng)典通路富集分析統(tǒng)計圖 橫坐標(biāo)為通路名稱，縱坐標(biāo)為富集顯著性水平(以10為底的負(fù)對數(shù)變換)；灰色表示無可用的活動模式，白色為Z-score=0，橙色表示通路被激活(Z-score>0)，藍(lán)色表示通路被抑制(Z-score<0)，橙色和藍(lán)色的深淺代表被激活或抑制的程度；Ratio表示顯著差異基因數(shù)在該信號通路中占所有基因數(shù)的比值

圖6 顯著差異基因參與125I粒子調(diào)控HCC細(xì)胞的調(diào)控效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖 (Adhesion of tumor csell lines：腫瘤細(xì)胞株黏附；Migration of smooth muscle cells：平滑肌細(xì)胞的遷移；Size of animal：動物大??；Cell viability of lymphoma cell line：淋巴瘤細(xì)胞系的細(xì)胞活力)

2.4125I粒子對HCC細(xì)胞中相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 根據(jù)上述分析結(jié)果，選取Acute Phase Response Signaling經(jīng)典通路中的24個顯著差異基因，于PLC/PRF/5細(xì)胞中進(jìn)行qPCR驗證；125I粒子組BMP4、UBD、ESCO2及STS的表達(dá)豐度分別為空白對照組的1.81、2.12、1.55及1.65倍，DDIT3、SESN2、DDIT4及DUSP1的表達(dá)豐度在空白對照組的占比分別為0.44、0.55、0.55及0.45。見圖7A。

圖7 125I粒子對PLC/PRF/5細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)的影響 A.qPCR檢測mRNA表達(dá)； B.蛋白質(zhì)印跡法檢測Acute Phase Response Signaling經(jīng)典通路相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5125I粒子對HCC細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)影響 根據(jù)上述qPCR檢測結(jié)果，選取與基因損傷修復(fù)相關(guān)的4個分子，于PLC/PRF/5細(xì)胞中用蛋白質(zhì)印跡法驗證蛋白水平，結(jié)果顯示125I粒子組ESCO2及DUSP1表達(dá)水平低于、而DDIT3高于空白對照組。見圖7B。

3 討論

125I粒子可持續(xù)低劑量放射γ射線及X射線，作用于腫瘤細(xì)胞G2/M期，抑制有絲分裂并造成DNA雙鏈斷裂而引起細(xì)胞凋亡，同時可不斷產(chǎn)生氧自由基以殺傷腫瘤細(xì)胞、減少腫瘤轉(zhuǎn)移[5]。

既往常規(guī)放療研究多集中于探索HCC細(xì)胞系放射敏感性機制，如2～6 Gy X射線體外輻射MHCC-97H細(xì)胞、胞內(nèi)解整合素金屬蛋白酶9(a disintegrin and metalloprotease 9, ADAM9)表達(dá)上調(diào)及核因子E2相關(guān)因子2[nuclear factor (erythroid-2 related) factor 2, Nrf2]表達(dá)下調(diào)，以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、降低HCC細(xì)胞放射敏感性[6]；4 Gy X射線輻射HepG2和Smmc-7721細(xì)胞，miR-621表達(dá)上調(diào)，抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 SET domain bifurcated 1(SETDB1)，激活p53信號通路，從而增強HCC細(xì)胞放射敏感性[7]；5 Gy X射線輻射HCC細(xì)胞，通過重組人GABA受體相關(guān)蛋白(GABA receptor-associated protein, GABARAP)促進(jìn)細(xì)胞自噬，使HCC產(chǎn)生放射抗性[8]。125I粒子放療可上調(diào)HCC細(xì)胞PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路中的CHOP(即DDIT3)表達(dá)[9]，激活生長抑制DNA損傷誘導(dǎo)蛋白34(growth arrest and DNA damage-inducible protein34, GADD34)，促進(jìn)真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor, eIF2α)去磷酸化，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；且CHOP過表達(dá)可使Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡[10]。此外，125I粒子放療亦可上調(diào)HCCLM3細(xì)胞內(nèi)miR-338表達(dá)，抑制肝臟磷酸果糖激酶(phosphofructokinase of liver, PFKL)表達(dá)，顯著降低瓦博格(Warburg)效應(yīng)，達(dá)到治療目的[11]。

染色體聚集直接決定其穩(wěn)定性。ESCO2是最重要的染色體聚集調(diào)節(jié)蛋白之一，在細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)過程中起重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，125I粒子輻照后的HCC細(xì)胞ESCO2表達(dá)下調(diào)，與既往研究[13]結(jié)果一致；此時ESCO2表達(dá)下調(diào)，可致HCC細(xì)胞DNA損傷及染色體不穩(wěn)定而死亡。

DUSP1可致絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)蛋白的磷酸蘇氨酸和酪氨酸發(fā)生去磷酸化，使MAPK失活；其表達(dá)水平在多種癌中均有顯著變化。DUSP1過表達(dá)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長、侵襲及血管生成[14]。125I粒子輻照后HCC細(xì)胞的DUSP1表達(dá)下調(diào)，提示其可能通過降低HCC細(xì)胞侵襲能力、減緩HCC細(xì)胞生長而起到治療作用。

DDIT3(即CHOP)表達(dá)產(chǎn)物通過與其他增強子結(jié)合蛋白結(jié)合而形成異二聚體，并抑制其DNA結(jié)合活性，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。125I粒子輻照后HCC細(xì)胞的DDIT3表達(dá)上調(diào)，提示其可能通過促進(jìn)DDIT3參與的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡。

綜上，125I粒子治療HCC的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包括抑制Acute Phase Response Signaling、下調(diào)ESCO2表達(dá)、使HCC細(xì)胞無法及時修復(fù)增殖時發(fā)生的DNA損傷，上調(diào)DDIT3表達(dá)、阻滯HCC細(xì)胞生長，下調(diào)DUSP1表達(dá)、誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡；上述結(jié)論尚有待在體研究結(jié)果加以驗證。