毛敏 楊明 劉新宇

（沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，沈陽 110034）

經(jīng)過長期的協(xié)同進(jìn)化，腸道菌群成為宿主不可分割的一部分，并與宿主形成互惠共生關(guān)系(Leyet al.,2006,2008;Dominguez-Belloet al.,2019)。腸道微生物為宿主健康做出了很多貢獻(xiàn)，如將宿主難以消化的食物成分轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸，并對宿主提供能量，感應(yīng)周圍環(huán)境變化并調(diào)控宿主代謝，促進(jìn)腸道穩(wěn)態(tài)，刺激免疫系統(tǒng)的發(fā)展，提供針對病原體的保護(hù)等(Van den Abbeeleet al.,2011;Makkiet al.,2018;Rastelliet al.,2019)。作為回報，宿主為腸道微生物種群提供了適宜的生存環(huán)境和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)(B?ckhedet al.,2005;Hanning and Diaz-Sanchez,2015)。腸道微生物組成、多樣性和功能的變化受地理分布、飲食、益生菌和益生元的使用、抗生素的使用以及環(huán)境等因素的影響(Singhet al.,2017;Anwaret al.,2021)。研究發(fā)現(xiàn)，飲食干預(yù)會改變哺乳動物腸道微生物的組成(Kashyapet al.,2013;Kohlet al.,2014;Rinninellaet al.,2020)。冬眠哺乳動物具有極端飲食變化的特征，這有利于研究進(jìn)食狀態(tài)對腸道微生物的影響。在多紋黃鼠(Ictidomys tridecemlineatus)和北極黃鼠(Urocitellus parryii)的研究中發(fā)現(xiàn)，冬眠會對腸道菌群的多樣性和組成產(chǎn)生影響(Careyet al.,2013;Dill-McFarlandet al.,2014;Stevensonet al.,2014)。但需要與其他冬眠動物的研究結(jié)果相結(jié)合，以確定多紋黃鼠和北極黃鼠腸道菌群的季節(jié)性變化是獨有的還是專性冬眠動物共有的現(xiàn)象。

達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilus dauricus)是典型的儲脂類冬眠動物，與多紋黃鼠和北極黃鼠同屬于松鼠科黃鼠屬，活動具有明顯的周期性(楊明等，2011)。在夏季和秋季，達(dá)烏爾黃鼠體溫與恒溫動物相近，可以進(jìn)行持續(xù)的覓食等行為活動。在育肥期間，達(dá)烏爾黃鼠攝食逐漸增加，體重迅速增長，體內(nèi)的脂肪大量積累(呂錚等，2014；邢昕等，2015)；育肥完成期后，達(dá)烏爾黃鼠的體重、代謝率和體溫逐漸下降(管淑君，2010；呂錚等，2014；邢昕等，2015)；冬季入眠后，達(dá)烏爾黃鼠處于低代謝狀態(tài)，體溫隨環(huán)境溫度的降低而降低，并接近環(huán)境溫度，體重也緩慢下降，基本不進(jìn)食或少進(jìn)食，主要通過消耗體內(nèi)脂肪來提供能量(門麗媛等，2015;Xinget al.,2015;Renet al.,2022)；冬眠過后，達(dá)烏爾黃鼠的體溫和代謝率開始恢復(fù)，并開始活動和攝食。結(jié)合以上研究，我們假設(shè)達(dá)烏爾黃鼠冬眠前后體溫及能量代謝的巨大生理變化可能會對其腸道菌群的多樣性、組成和功能產(chǎn)生重要影響，并推測冬眠期達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群中偏好膳食纖維的厚壁菌門減少，可以降解宿主聚糖的擬桿菌門增加。為驗證上述假設(shè)，本研究通過16S rRNA基因高通量測序技術(shù)對育肥階段和冬眠階段達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的多樣性和組成進(jìn)行比較分析，利用PICRUSt預(yù)測不同時期盲腸菌群的功能變化，并通過冗余分析(Redundancy analysis,RDA)分析達(dá)烏爾黃鼠的生理特征與盲腸菌群組成和功能之間的關(guān)系，從而探究冬眠對達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的影響，并繼續(xù)分析盲腸菌群組成和功能的季節(jié)性變化是否對宿主的生理功能產(chǎn)生間接影響，從而為揭示腸道菌群在冬眠動物生理代謝中的作用提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 實驗動物

在內(nèi)蒙古通遼市 (北緯 43°22′12″，東經(jīng) 122°09′36″)捕捉47只雌性達(dá)烏爾黃鼠，帶回沈陽師范大學(xué)動物房單籠(48 cm×35 cm×20 cm)飼養(yǎng)，用碎刨花做巢材，飼喂標(biāo)準(zhǔn)鼠糧(沈陽前民飼料廠)和飲用水。6—9月，動物房的溫度為(23±2)℃，光周期為12L∶12D。9月初開始，當(dāng)發(fā)現(xiàn)達(dá)烏爾黃鼠出現(xiàn)蟄眠狀態(tài)時，將其移至室溫(5±2)℃且恒黑的低溫房內(nèi)，籠內(nèi)放入適量的巢材和棉花，并提供標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和飲用水；1月初，將出眠的達(dá)烏爾黃鼠移出低溫房，并提供活躍季節(jié)相同的環(huán)境溫度和食物。

1.2 樣本收集

根據(jù)達(dá)烏爾黃鼠體重的變化將其分為起始育肥期組(Initial fattening group,IF)、快速育肥期組(Rapid fattening group,RF)以及育肥完成期組(Finished fattening group,FF)，根據(jù)動物冬眠的時長分為冬眠早期組(Early hibernation group,EH)、冬眠晚期組(Late hibernation group,LH)以及出眠期組(Arousal group,A)，共6組，F(xiàn)F組的實驗動物為7只，其余組為8只。每只動物用電子天平(上表電子儀器廠，SB10001)測量體重，CO2麻醉后斷頸處死，在超凈工作臺中收集6個時期的盲腸內(nèi)容物置于15 mL滅菌管中，凍存于-80℃冰箱備用。

1.3 16S rRNA基因高通量測序

使用ForeGene糞便基因組DNA提取試劑盒提取樣本中的總DNA，用Nano drop檢測其純度，Qubit檢測其濃度。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性后，選擇合格的樣品送胤安國際(遼寧)基因科技股份有限公司測序。

使用MetaVxTMLibrary Preparation kit對樣本中16S rDNA的V3、V4區(qū)域進(jìn)行擴增并構(gòu)建DNA文庫，使用的引物為Forward：CCTACGGRRBGCAS CAGKVRVGAAT；Reverse：GGACTACNVGGGT WTCTAATCC。用 HT RNA Pico Sensitivity Reagent Kit試劑盒在Lab Chip Touch 24大分子分析儀上檢測文庫質(zhì)量后，使用Illumina MiSeq測序儀進(jìn)行讀長為300 bp的DNA測序。

1.4 生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計學(xué)分析

原始序列的數(shù)據(jù)使用QIIME1.7.0處理。使用Flash軟件將雙端的序列合并，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行fastqc質(zhì)控，刪除低質(zhì)量的序列并切除引物和接頭序列，使用mothur軟件的denovo方法去除嵌合體序 列 (Schlosset al.,2009;Mago? and Salzberg,2011)。優(yōu)化的序列用QIIME1中de novo OTU聚類的方法根據(jù)序列97%的相似性聚類生成操作分類單元(OTU)，并通過Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋(Caporasoet al.,2010)。為了能夠比較不同測序量的樣本，用等量重抽樣和CSS方法對每個樣本的序列數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)化處理(Paulsonet al.,2013)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的OTU，使用QIIME軟件對樣品進(jìn)行Alpha和Beta多樣性分析。Alpha多樣性指數(shù)包括Chao1、ACE、Shannon和Simpson等指數(shù)，其中Chao1和ACE是計算菌群豐富度(Community richness)的指數(shù)，兩者值越大，表明樣品的豐富度越高；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用來估算樣品中菌群多樣性(Community diversity)，Shannon指數(shù)越高，說明樣品中的菌群多樣性越高，Simpson指數(shù)越大，表示樣品中的菌群多樣性越低(Shannon,1948;Simpson,1949;Chao,1984;Chaoet al.,1993)。在Alpha多樣性指數(shù)的差異顯著性分析中，符合正態(tài)分布且方差齊性時用單因素方差分析，非正態(tài)分布或方差不齊時使用K-W軼和檢驗，數(shù)據(jù)結(jié)果用mean±SE表示，weighted UniFrac和unweighted UniFrac距離矩陣的主坐標(biāo)分析(PCoA)通過ANOSIM分析和非參數(shù)多元方差分析檢驗(Lozupone and Knight,2005;Lozuponeet al.,2011)。采用SPSS 26.0軟件中的單因素方差分析或K-W軼和檢驗分析門、科和屬水平中優(yōu)勢菌群的差異顯著性。使用PICRUSt軟件預(yù)測盲腸菌群的功能(Langilleet al.,2013)，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫對基因功能注釋，并利用LefSe分析對KEGG功能預(yù)測結(jié)果中的3個層級功能進(jìn)行差異統(tǒng)計，用線性判別分析(LDA)條形圖進(jìn)行可視化展示，當(dāng)LDA＞2，P＜0.05時有顯著性差異(Segataet al.,2011)。使用R version 3.6.3軟件的vegan包分別對達(dá)烏爾黃鼠不同時期的生理特征與其盲腸菌群組成和功能的相關(guān)性進(jìn)行RDA分析，我們之前已對同一批動物的生理指標(biāo)進(jìn)行檢測，詳見Ren等(2022)。

2 結(jié)果

2.1 OTU總數(shù)和Alpha多樣性分析

對47只達(dá)烏爾黃鼠盲腸內(nèi)容物中的16S rRNA基因進(jìn)行測序并經(jīng)過質(zhì)量處理，共檢測到3 308 681個序列，平均每個樣品有551 446個序列。這些序列根據(jù)97%的相似性聚類生成1 741個OTU總數(shù)，其中A組的OTU總數(shù)最高，EH組的OTU總數(shù)最低，但各組之間的OTU總數(shù)差異不顯著(P=0.068)(表1)。隨機抽取樣品中一定數(shù)量的序列繪制稀釋曲線(圖1)顯示，樣品的曲線都趨于平緩，表明所有樣品的測序數(shù)量合理，能夠涵蓋樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。

表1 不同時期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的Alpha多樣性指數(shù)表Table 1 Index table of Alpha diversity of cecal microbiota of Daurian ground squirrel in different periods

圖1 不同時期達(dá)烏爾黃鼠觀察到的OTU數(shù)的稀釋曲線.圖中的每一個樣本用不同的曲線代表，不同的顏色表示不同的分組；隨著樣本序列數(shù)的增加，OTU的數(shù)量也在增加；最終，曲線開始趨于平緩，說明所有樣品的測序數(shù)量合理，能夠涵蓋樣品中絕大多數(shù)微生物物種信息.IF：起始育肥期組；RF：快速育肥期組；FF：育肥完成期組；EH：冬眠早期組；LH：冬眠晚期組；A：出眠期組；圖2～5同F(xiàn)ig.1 The rarefaction curves of observed species of Daurian ground squirrel in different periods.Each sample in the figure is represented by a different curve,and different colors indicate different groupings.With the increase of sequence per sample,the observed species also increases.Finally,the curve began to plateau,indicating that the sequencing quantity of all samples was reasonable,and could cover the information of the vast majority of microbial species in the samples.IF:Initial fattening group;RF:Rapid fattening group;FF:Finished fattening group;EH:Early hibernation group;LH:Late hibernation group;A:Arousal group;the same to figure 2-5

通過Alpha多樣性分析，能反映不同時期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的豐富度和均勻度。根據(jù)Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)(表1)，發(fā)現(xiàn)不同時期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的Alpha多樣性不同。其中，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在A組與IF、RF和EH組之間存在顯著差異(Chao1：P=0.005；ACE：P=0.005)，說明A組的菌群豐富度顯著高于IF、RF和EH組。Shannon指數(shù)在6組樣品中無顯著差異(P=0.075)。Simpson指數(shù)在RF和FF組間存在顯著差異(P=0.017)，且FF組的菌群多樣性顯著低于RF組。

2.2 Beta多樣性分析

根據(jù)距離矩陣顯示達(dá)烏爾黃鼠各組的樣品在組內(nèi)較分散，但通過ANOSIM分析發(fā)現(xiàn)，各組樣品的組間差異顯著大于組內(nèi)差異(加權(quán)：R=0.37，P=0.001；非加權(quán)：R=0.56，P=0.001)。將每只達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群基于加權(quán)和非加權(quán)的UniFrac距離矩陣的主坐標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)均顯示出了明顯的季節(jié)性聚類(圖2A，B)。育肥期和冬眠期的盲腸菌群有明顯的分離，其中IF、RF和FF組的菌群聚集在一起，而EH和LH組的菌群聚集在一起，A組的菌群比較分散，介于育肥期和冬眠期之間(加權(quán)：R2=0.27，P=0.001；非加權(quán)：R2=0.29，P=0.001)。結(jié)果表明IF、RF和FF組的盲腸菌群結(jié)構(gòu)更相似，而與EH和LH組的盲腸菌群結(jié)構(gòu)相似性低。

圖2 不同時期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群基于加權(quán)(A)和非加權(quán)(B)UniFrac距離矩陣的主坐標(biāo)分析(PCoA).橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)表示選定的兩個主坐標(biāo)軸；百分比表示主坐標(biāo)軸對樣本組成差異的解釋度；刻度是相對距離，無實際意義；不同顏色的置信橢圓代表不同的分組；不同顏色或形狀的點代表不同分組的樣本，兩樣本的點越接近，表明兩樣本盲腸菌群結(jié)構(gòu)組成越相似Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)of the weighted(A)and unweighted(B)UniFrac distance matrix compared with the cecal microbiota of Daurian ground squirrel in different periods.The abscissa and ordinate represent are the two selected main axes,and the percentage represents the contribution of the main axis to explain the difference in sample composition.The scale is relative distance has no practical significance.Confidence ellipses of different colors represent different groups and the dots of different colors and shapes represent samples of different groups.The closer the points of the two samples are,the more similar the cecal microbiota of the two samples is proved

2.3 盲腸菌群組成

達(dá)烏爾黃鼠盲腸內(nèi)的菌群有10門15綱20目42科147屬。根據(jù)注釋結(jié)果，在門、科和屬分類水平中選擇前15個相對豐度最高的優(yōu)勢菌，其他菌群合并為Others，并用相對豐度柱狀圖展示(圖3)。

圖3 達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群在門(A)、科(B)和屬(C)水平的相對豐度組成.不同的物種用不同顏色表示，柱子的長短代表該物種所占比例的大小；Others代表其他細(xì)菌分類以及未注釋出來的細(xì)菌分類；星號表示科水平中未分類的屬Fig.3 Composition of relative abundance of cecal microbiota in Daurian ground squirrel at phylum(A),family(B)and genus(C)levels.Different species are indicated in different colors,and the length of the column represents the proportion.Others represent other bacterial taxa and undefined bacterial taxa.Asterisks indicate unclassified genera at the family level

在門水平，達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群共注釋到10個門類，包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、Patescibacteria菌門、Epsilonbacteraeota菌門和梭桿菌門(Fusobacteria)(圖3A)。其中有5個菌門所占比例大于1%，分別為厚壁菌門(57.83%～82.25%)、擬桿菌門 (15.12%～33.57%)、疣微菌門 (0.48%～6.58%)、變形菌門(0.75%～1.53%)和放線菌門(0.37%～1.22%)，其他菌門的豐度較低(＜1%)。

在科和屬水平，達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群中的厚壁菌門以毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、Familyす、消化球菌科(Peptococcaceae)、韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae)和氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)為代表。優(yōu)勢屬包括克里斯滕森菌科R-7群 (ChristensenellaceaeR-7 group)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、毛螺菌科NK4A136群 (LachnospiraceaeNK4A136 group)、Marvinbryantia、毛螺菌科中的兩個未分類屬、[Eubacterium]coprostanoli-genesgroup、毛螺菌科UCG-008屬(LachnospiraceaeUCG-008)、瘤胃菌科UCG-005屬(RuminococcaceaeUCG-005)、瘤胃球菌屬1(Ruminococcus1)和瘤胃梭菌屬9(Ruminiclostridium9)。在擬桿菌門中，主要由鼠桿菌科(Muribaculaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、理研菌科 (Rikenellaceae)和Barnesiellaceae菌科為代表，優(yōu)勢屬包括鼠桿菌科中的未分類屬、擬桿菌屬(Bacteroides)和另枝菌屬(Alistipes)。疣微菌門以艾克曼氏菌科(Akkermansiaceae)為主，且艾克曼菌屬(Akkermansia)是其唯一的屬。變形菌門以脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)中的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)為代表。放線菌門以Eggerthellaceae菌科為代表(圖3B，C)。

通過比較不同時期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的相對豐度，在不同分類水平中盲腸菌群的相對豐度存在季節(jié)性差異(表2)。其中，在門水平上，冬眠早期厚壁菌門的相對豐度相對于冬眠晚期、出眠期和起始育肥期明顯下降；擬桿菌門的相對豐度在冬眠早期顯著高于除快速育肥期以外的其他時期；疣微菌門的相對豐度在冬眠早期和冬眠晚期顯著高于出眠期，同時冬眠早期疣微菌門的相對豐度也顯著高于快速育肥期。在科水平上，瘤胃菌科和Familyす的相對豐度在冬眠早期最低，在育肥完成期最高；消化球菌科的相對豐度在冬眠晚期顯著高于起始育肥期和快速育肥期；乳桿菌科受冬眠的影響非常嚴(yán)重，其相對豐度從起始育肥期到冬眠晚期下降了近200倍；擬桿菌科的相對豐度在冬眠早期顯著高于冬眠晚期、出眠期和起始育肥期。在屬水平上，Ruminococcus1的相對豐度在快速育肥期顯著高于冬眠晚期，而與冬眠晚期相比，Marvinbryantia的相對豐度在育肥階段的3個時期顯著降低；[Eubacterium]coprostanoligenesgroup的相對豐度在快速育肥期降到最低，至育肥完成期又升到最高。擬桿菌屬的相對豐度在冬眠早期顯著高于冬眠晚期、出眠期和起始育肥期。艾克曼菌屬相對豐度的變化與疣微菌門一致。變形菌門中脫硫弧菌屬的相對豐度在冬眠早期最高，在起始育肥期最低。

表2 在門、科和屬水平中達(dá)烏爾黃鼠優(yōu)勢菌群相對豐度的差異比較Table 2 Comparison of relative abundance of dominant microbiota of Daurian ground squirrel at phylum,family and genus levels

2.4 PICRUSt功能預(yù)測分析

對不同時期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的功能預(yù)測顯示，IF、RF、FF、EH和LH組盲腸菌群的功能存在顯著差異，且有差異的代謝通路有74個(圖4)。其中，起始育肥期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群在遺傳信息的處理、復(fù)制和修復(fù)、核苷酸代謝等35個相關(guān)通路中顯著富集；快速育肥期的盲腸菌群在新陳代謝、丁酸代謝、DNA復(fù)制蛋白等10個代謝通路中顯著富集；育肥完成期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的功能有5個，即在細(xì)胞骨架蛋白、內(nèi)分泌系統(tǒng)、膀胱癌、維生素B6代謝以及磷酸鹽和次磷酸鹽代謝中顯著富集。冬眠早期的盲腸菌群在細(xì)胞過程和信號傳導(dǎo)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、磷酸戊糖途徑等12個功能通路中顯著高于其他時期。在冬眠晚期中，達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群有12個代謝通路顯著富集，包括環(huán)境信息處理、膜運輸、轉(zhuǎn)運蛋白等。以上結(jié)果表明，達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的生物學(xué)功能和代謝途徑存在季節(jié)性的差異。

圖4 LEfSe分析KEGG三個層級中達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群顯著富集的功能.LDA＞2認(rèn)為有差異.IF：起始育肥期組；RF：快速育肥期組；FF：育肥完成期組；EH：冬眠早期組；LH：冬眠晚期組Fig.4 LEfSe analysis of the function of significant enrichment of cecal microbiota of Daurian ground squirrel at three KEGG levels.LDA＞2 is considered to be different.IF:Initial fattening group;RF:Rapid fattening group;FF:Finished fattening group;EH:Early hibernation group;LH:Late hibernation group

2.5 冗余分析

將達(dá)烏爾黃鼠不同時期的生理特征分別與存在顯著差異的菌群組成和功能進(jìn)行RDA分析(圖5)。其中，達(dá)烏爾黃鼠的體重、攝食量、血糖和體溫之間呈顯著正相關(guān)。乳桿菌屬、Ruminococcus1、瘤胃菌科和[Eubacterium]coprostanoligenesgroup的相對豐度與攝食量、血糖和體溫呈正相關(guān)，且這些菌種間呈正相關(guān)；乳桿菌屬的相對豐度與體重呈顯著正相關(guān)。擬桿菌屬、艾克曼菌屬、脫硫弧菌屬和Marvinbryantia的相對豐度與體重、攝食量、血糖和體溫呈顯著負(fù)相關(guān)，且與乳桿菌屬、Ruminococcus1、瘤胃菌科和[Eubacterium]coprostanoligenesgroup的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，而這些菌種間呈顯著正相關(guān)(圖5A)。同時，在起始育肥期和快速育肥期中顯著富集的DNA復(fù)制、核糖體、嘌呤代謝、酪氨酸代謝和丁酸代謝與體重、攝食量、血糖和體溫呈顯著正相關(guān)，且這些代謝通路間呈顯著正相關(guān)。而在冬眠早期和冬眠晚期中顯著富集的氮代謝、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、硫代謝和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)與體重、攝食量、血糖和體溫呈顯著負(fù)相關(guān)，也與起始育肥期和快速育肥期中的代謝通路呈顯著負(fù)相關(guān)，這些功能通路間呈顯著正相關(guān) (圖5B)。

圖5 達(dá)烏爾黃鼠不同時期的生理特征與其盲腸菌群組成(A)和功能(B)的冗余分析.紅色箭頭射線代表不同時期達(dá)烏爾黃鼠的生理特征；藍(lán)色箭頭射線分別代表盲腸菌群的組成和功能；不同顏色的點代表不同的分組；射線與射線之間的關(guān)系由夾角表示，銳角代表正相關(guān)，鈍角代表負(fù)相關(guān)Fig.5 RDA analysis of physiological characteristics of Daurian ground squirrel in different periods and the composition(A)and function(B)of cecal microbiota.The red arrow rays represent the physiological characteristics of Daurian ground squirrel in different periods.The blue arrow rays represent the composition and function of cecal microbiota.Dots of different colors represent samples of different groups.The relationship between rays is indicated by the included angle,with acute angle representing positive correlation and obtuse angle representing negative correlation

3 討論

達(dá)烏爾黃鼠為典型的儲脂類冬眠動物，其活動具有明顯的季節(jié)性，其極端的飲食和冬眠前后的生理變化可能使腸道內(nèi)環(huán)境發(fā)生了改變，從而影響腸道菌群。本研究通過對6個時期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的多樣性、組成和功能進(jìn)行分析，探討達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的季節(jié)性變化。

3.1 達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的多樣性

本研究對各組達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，出眠期Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于起始育肥期、快速育肥期和冬眠早期，快速育肥期的Simpson指數(shù)顯著高于育肥完成期。同時基于加權(quán)和非加權(quán)的UniFrac距離矩陣的PCoA分析顯示，起始育肥期、快速育肥期和育肥完成期的盲腸菌群結(jié)構(gòu)相似，而冬眠早期和冬眠晚期的菌群結(jié)構(gòu)相似性與育肥期差異較大，出眠期作為過渡狀態(tài)，介于育肥期和冬眠期之間。以上研究結(jié)果表明，冬眠期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)與育肥期明顯不同，且盲腸菌群的多樣性存在季節(jié)性差異。該結(jié)果與多紋黃鼠、北極黃鼠、棕熊(Ursus arctos)以及馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferrumequinum)的研究結(jié)果一致(Careyet al.,2013;Stevensonet al.,2014;Sommeret al.,2016;Xiaoetal.,2019)。同時，盲腸菌群多樣性的季節(jié)性變化與達(dá)烏爾黃鼠季節(jié)性的飲食相關(guān)。與育肥完成期相比，冬眠早期盲腸菌群的豐富度減少，可能受到冬眠期間禁食的影響。禁食對腸道菌群多樣性的影響已經(jīng)在多種動物中得到證實，Sonoyama等(2009)發(fā)現(xiàn)禁食96 h的金色中倉鼠(Mesocricetus auratus)腸道菌群的總數(shù)降低，禁食后緬甸蟒(Python bivittatus)腸道菌群的多樣性降低(Costelloet al.,2010)，冬眠期多紋黃鼠腸道菌群的多樣性顯著低于春季(Careyet al.,2013)。達(dá)烏爾黃鼠在冬眠階段處于禁食狀態(tài)，以膳食纖維為主要營養(yǎng)來源的菌群減少，因此盲腸菌群的豐富度降低。出眠期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的豐富度最高，可能是達(dá)烏爾黃鼠在出眠期的進(jìn)食增加，盲腸菌群對營養(yǎng)來源的選擇增多。在育肥期達(dá)烏爾黃鼠持續(xù)攝食以及盲腸菌群之間競爭的情況下，優(yōu)勢菌群占據(jù)主導(dǎo)位置，使盲腸菌群組成趨于穩(wěn)定且豐富度降低，該結(jié)果與多紋黃鼠和馬鐵菊頭蝠的研究結(jié)果相似(Careyet al.,2013;Xiaoet al.,2019)。

3.2 達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的組成

本研究中達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門和疣微菌門組成。其中，厚壁菌門和擬桿菌門不僅在多紋黃鼠(Careyet al.,2013)、北極黃鼠(Stevensonet al.,2014)、東方田鼠(Alexandromys fortis)(馮潔等，2018)等嚙齒動物中占優(yōu)勢，而且是許多哺乳動物的優(yōu)勢菌群，如大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)(Zhuet al.,2011)、棕熊(Sommeret al.,2016)、林麝 (Moschus berezovskii)(趙貴軍等，2019)、野豬(Sus scrofa)(楊雄威等，2021)等。本研究顯示達(dá)烏爾黃鼠季節(jié)性的生理變化使盲腸菌群的相對豐度發(fā)生改變。與其他時期相比，冬眠早期厚壁菌門的相對豐度減少，而擬桿菌門和疣微菌門的相對豐度增加。該結(jié)果與多紋黃鼠和北極黃鼠優(yōu)勢菌群的變化一致(Careyet al.,2013;Stevensonet al.,2014)。瘤胃菌科和Familyす的相對豐度在冬眠早期最低，與其他時期相比，乳桿菌屬的相對豐度在冬眠早期和冬眠晚期顯著下降。Carey等(2013)發(fā)現(xiàn)，多紋黃鼠盲腸的乳桿菌屬相對豐度從冬眠開始就下降到不可檢測的水平，直到春季才逐漸增加。在北極黃鼠腸道菌群中，脫硫弧菌屬的相對豐度在冬眠期顯著高于夏季，這與達(dá)烏爾黃鼠的研究結(jié)果一致(Stevensonet al.,2014)。本研究中擬桿菌屬、艾克曼菌屬和脫硫弧菌屬的相對豐度也在冬眠早期最高。冬眠期達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的相對豐度發(fā)生改變，提示盲腸菌群可能參與了冬眠動物生理功能的調(diào)節(jié)。

3.3 達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的功能通路

已有研究發(fā)現(xiàn)瘤胃菌科和乳桿菌屬是植物多糖的主要利用者，可以降解膳食纖維，提高宿主的免疫能力(Danielet al.,2014；毛倩云等，2018)，同時它們通過產(chǎn)生丁酸等短鏈脂肪酸，刺激上皮細(xì)胞的增殖和恢復(fù)并維持腸壁的完整性(Sivaprakasamet al.,2017;Zhouet al.,2017)。本研究中，厚壁菌門的瘤胃菌科和乳桿菌屬的相對豐度在育肥期顯著高于冬眠期，且與攝食量和血糖呈正相關(guān)。Carey等(2013)發(fā)現(xiàn)，多紋黃鼠盲腸內(nèi)容物中丁酸鹽濃度與厚壁菌門呈正相關(guān)。夏季多紋黃鼠和北極黃鼠盲腸內(nèi)容物中都發(fā)現(xiàn)丁酸鹽濃度顯著高于其他時期(Careyet al.,2013;Stevensonet al.,2014)，這與本研究中丁酸代謝的功能通路在快速育肥期顯著富集，且與體重、攝食量、血糖和體溫4個生理特征呈顯著正相關(guān)的結(jié)果一致?？梢?，育肥期達(dá)烏爾黃鼠的攝食量和血糖增加，厚壁菌門中的瘤胃菌科等腸道菌群產(chǎn)生了更多丁酸鹽，其濃度在宿主的盲腸中增加，使達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群的丁酸代謝在快速育肥期富集并為其上皮細(xì)胞提供能量。此外，在功能預(yù)測和RDA分析中，DNA復(fù)制、核糖體、嘌呤代謝、酪氨酸代謝等功能通路在起始育肥期顯著富集，且與體重、攝食量、血糖和體溫呈顯著正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬參與了氨基酸的脫羧作用并生成酪氨酸等生物胺，可以調(diào)節(jié)DNA和蛋白質(zhì)的合成等生理功能，促進(jìn)腸道穩(wěn)態(tài)(Maet al.,2010；皮宇等，2017)。因此，乳桿菌屬的相對豐度在起始育肥期最高，這對達(dá)烏爾黃鼠的生理和免疫功能是有利的。以上研究結(jié)果表明，育肥期富集的丁酸代謝等功能通路參與了達(dá)烏爾黃鼠的基礎(chǔ)生命功能和營養(yǎng)物質(zhì)運輸，并為其提供能量。

本研究發(fā)現(xiàn)達(dá)烏爾黃鼠的攝食量和血糖與艾克曼菌屬和擬桿菌屬的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，顯示冬眠期禁食的達(dá)烏爾黃鼠盲腸艾克曼菌屬和擬桿菌屬的相對豐度增加。艾克曼菌屬中的Akkermansia muciniphila可以降解宿主內(nèi)源性聚糖，包括黏液中的多糖、脫落的上皮細(xì)胞以及膽汁和胰腺的分泌物等，刺激宿主粘液分泌，加強上皮細(xì)胞的完整性(Derrienet al.,2004;Geerlingset al.,2018)。擬桿菌屬中的Bacteroides thetaiotaomicron在缺乏膳食聚糖的情況下可以降解宿主聚糖，協(xié)助宿主利用碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)，并有提高免疫應(yīng)答和維持腸道微生態(tài)平衡的作用(Flintet al.,2012;Koropatkinet al.,2012)?？梢姡咂陂g達(dá)烏爾黃鼠的攝食量、血糖降低，使可以降解宿主來源底物的艾克曼菌屬和擬桿菌屬的相對豐度增加，并提高達(dá)烏爾黃鼠的免疫能力，調(diào)節(jié)其生理代謝。此外，冬眠期顯著富集的氮代謝與達(dá)烏爾黃鼠的體重、攝食量、血糖和體溫呈顯著負(fù)相關(guān)。尿素氮循環(huán)可以保持動物在冬眠中的蛋白質(zhì)含量，防止冬眠期間氨中毒(Leeet al.,2012;Riceet al.,2020)。腸道菌群將宿主腸道中的尿素水解為二氧化碳和氨，氨可以進(jìn)一步合成氨基酸，并有助于新蛋白質(zhì)的生成(Carey and Assadi-Porter,2017;Reganet al.,2022)，說明在冬眠期間達(dá)烏爾黃鼠盲腸菌群可以通過氮代謝轉(zhuǎn)換有毒物質(zhì)，并為黃鼠提供部分能量。同時，Earley等(2015)研究發(fā)現(xiàn)脫硫弧菌屬可以代謝粘蛋白的硫酸鹽并產(chǎn)生硫化氫(H2S)。H2S作為一種典型的細(xì)胞色素C氧化酶抑制劑，與冬眠的代謝抑制有關(guān)(Nichollset al.,2013;Revsbechet al.,2014)。本研究中達(dá)烏爾黃鼠的脫硫弧菌屬的相對豐度、硫代謝的功能通路與體重、攝食量、血糖和體溫4個生理特征呈顯著負(fù)相關(guān)。表明冬眠的達(dá)烏爾黃鼠盲腸脫硫弧菌屬的相對豐度增加會促進(jìn)硫代謝產(chǎn)生更多的H2S，以減少黃鼠在冬眠期間的能量消耗。以上研究結(jié)果暗示，冬眠期盲腸菌群可能通過增強氮代謝等功能，參與和調(diào)節(jié)達(dá)烏爾黃鼠的生理代謝，從而使黃鼠能夠應(yīng)對冬季的極端低溫和食物匱乏。

致謝：感謝沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周瑜老師在生物信息學(xué)分析中提供的幫助！感謝生命科學(xué)學(xué)院任月同學(xué)在樣本采集工作中給予的幫助！