安康 包明芳 姚寶輝 康宇坤 譚宇塵 王艷莉 蘇軍虎*

（1甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統教育部重點實驗室，中美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070）（2甘肅農業(yè)大學—新西蘭梅西大學草地生物多樣性研究中心，蘭州 730070）（3甘肅省祁連山草原生態(tài)系統野外科學觀測研究站，天祝 733200）

季節(jié)性繁殖是動物適應復雜環(huán)境所采取的一種策略，受光照、溫度、降水和食物等多種因素的影響。其中光照的周期性變化被認為是影響動物繁殖的主要因素(Shinomiyaet al.,2014)。光信號通過視網膜傳到大腦調節(jié)褪黑素(Melatonin)的分泌(Dardenteet al.,2016)，進而影響繁殖激素的合成與分泌。作為感知光周期變化的神經激素，褪黑素主要由松果體分泌(Ceconet al.,2019)，血液循環(huán)中的色氨酸是其生物合成前體，經過芳香胺-N-乙?；D移酶(Arylalkylamine-N-acetyl transferase)和羥基吲哚-O-甲基轉移酶(Hydroxyindole-O-methyl transferase)最終合成為褪黑素(Axelrod and Wurtman,1968;Pandi-Perumalet al.,2008)。褪黑素還在胃、心臟、肝臟、卵巢等組織器官中合成和分泌(Reiteret al.,2015)，但周期性分泌僅存在于松果體和視網膜中(姚蔚等，2017)。研究發(fā)現，褪黑素的周期性分泌主要受下丘腦視交叉上核(Suprachiasmatic nucleus,SCN)的晝夜節(jié)律振蕩器控制，其激素分泌水平與夜間長度呈正相關(Simonneaux and Ribelayga,2003)，呈現出晝低夜高的特點(Wurtman and Ozaki,1978)；隨著一年中光周期的變化，褪黑素又表現出季節(jié)性分泌規(guī)律(陳玉林和張小輝，2005)，促使動物在行為和生理上與季節(jié)變化同步，進而調整其繁殖狀態(tài)。因此，褪黑素在動物的季節(jié)性繁殖調控中具有重要作用，通過與下丘腦—垂體—性腺(Hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)軸上的受體結合發(fā)揮生物學功能(Aleandriet al.,1996)。

在哺乳動物中，褪黑素的生理功能主要通過兩種高親和力的膜受體介導，即褪黑素受體1a(Melatonin receptor 1a,MTNR1a)和褪黑素受體1b(Melatonin receptor 1b,MTNR1b)，兩者均屬于G蛋白偶聯受體家族成員，參與多種功能調節(jié)(Jockerset al.,2008;Wuet al.,2013)。MTNR1a 和 MTNR1b已證實存在于小鼠(Mus musculus)下丘腦SCN中，共同調節(jié)其晝夜節(jié)律(Liuet al.,1997;Jinet al.,2003)。陳健楠等 (2020)采用qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)技術檢測到MTNR1a和MTNR1b基因在牦牛(Bos grunniens)垂體中表達。MTNR1a和MTNR1b除了在下丘腦和垂體中發(fā)揮作用外，在動物睪丸中也有作用(Frungieriet al.,2005)。Izzo等(2010)發(fā)現大鼠(Rattus norvegicus)睪丸中存在MTNR1a和MTNR1b；Yang等(2014)發(fā)現褪黑素通過與MTNR1a和MTNR1b結合調節(jié)荷斯坦牛(B.taurus)睪丸支持細胞的發(fā)育與功能發(fā)揮。這表明褪黑素與受體結合，可獨立于下丘腦和垂體，直接影響動物睪丸的生長和發(fā)育?，F已證實，褪黑素與垂體中MTNR1a結合，一方面通過中間信使分子調節(jié)垂體遠側催乳激素(Prolactin,PL)的分泌和門脈血管的發(fā)生，調控繁殖(Lincoln and Clarke,1994)；另一方面通過促甲狀腺激素—甲狀腺激素(Thyroid stimulating hormone-thyroid hormone)通路誘導促性腺激素釋放激素神經元活性，分泌促性腺激素釋放激素(Gonadotropin releasing hormone,GnRH)調節(jié)垂體合成、分泌卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone)和黃體生成素(Luteinizing hormone)，參與調控繁殖(Nishiwaki-Ohkawa and Yoshimura,2016)。褪黑素參與繁殖作用的研究，豐富了動物季節(jié)性繁殖調控理論，探明了更多動物類群褪黑素繁殖調控作用機理，對完善動物繁殖理論具有重要意義。

高原鼢鼠(Eospalax baileyi)是青藏高原特有的地下嚙齒動物(張堰銘和劉季科，2002)，主要棲息在高寒草甸、高寒草原和高山灌叢等地帶，受到氣候、地形、食物和土壤等因素的制約(Keinathet al.,2014)，繁殖期為每年的4月中旬到6月中旬(鄭生武，1980)，是典型的季節(jié)性繁殖動物。近年來，由于人類活動和氣候變化等影響，高原鼢鼠種群數量急劇增加，加劇了對草原環(huán)境的破壞。繁殖是嚙齒動物種群數量發(fā)生及其危害的重要生物學基礎，掌握其繁殖調控機理對其種群進行有效管理至關重要。長期營地下生活的嚙齒動物視覺系統嚴重退化，但是感受光周期的“非成像”視覺通路仍高度發(fā)達，能夠感光和感知外界光周期的變化，并產生與外界晝夜循環(huán)同步的生物節(jié)律(孟衫衫等，2010)。安曉宇等(2020)發(fā)現，高原鼢鼠褪黑素水平在繁殖期和非繁殖期存在顯著差異，暗示了褪黑素在高原鼢鼠季節(jié)性繁殖調控中的潛在作用，然而褪黑素受體基因表達模式和組織特異性等未知?；诖?，本研究通過分析MTNR1a和MTNR1b基因在繁殖期與非繁殖期雄性高原鼢鼠HPG軸上的表達模式，探究褪黑素在高原鼢鼠繁殖調控中的作用機理，旨在豐富光周期誘導地下嚙齒動物季節(jié)性繁殖調控的理論，為高原鼢鼠有效管理提供參考。

1 研究方法

1.1 實驗材料

于2020年5月(繁殖期)和9月(非繁殖期)在甘肅省天祝藏族自治縣甘肅省祁連山草原生態(tài)系統野外科學觀測研究站進行高原鼢鼠樣本采集，依據其胴體重判斷是否成年(蘇軍虎等，2018)，在兩個時期分別非損傷活捕10只成年健康雄性個體。為避免褪黑素的晝夜節(jié)律性對實驗結果造成影響，將兩個時期所有實驗樣品的采集工作控制在同一天的2 h內完成(20:00—22:00)。取出每只個體的睪丸、附睪和精囊腺稱重記錄，下丘腦、垂體以及一側睪丸于-80℃冷凍保存，用于RNA的提取；另一側睪丸保存于4%多聚甲醛組織固定液中，用于免疫組織化學實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取及引物設計

將兩個時期各10只成年雄性高原鼢鼠個體的下丘腦、垂體及睪丸在同等條件下，按照RNAiso Plus Total RNA提取試劑盒(TaKaRa)的操作說明進行總RNA的提取，于-80℃儲存。所有樣品的ODA260/A280值均為1.8～2.0，說明RNA質量高(Huoet al.,2017)。根據NCBI數據庫中已發(fā)布大鼠和小鼠MTNR1a(NM_001100641.1)和MTNR1b(NM_145712.2)的堿基序列，使用Primer3 Input 0.4.0軟件設計高原鼢鼠MTNR1a和MTNR1b引物，引物序列由西安擎科有限責任公司進行合成 (表1)。

表1 雄性高原鼢鼠MTNR1a和MTNR1b引物序列Table 1 Primers sequence for MTNR1a and MTNR1b of male plateau zokor

1.2.2 RNA逆轉錄和實時熒光定量PCR測定

使用PrimeScript 1st Strand(Takara)試劑盒將所有樣品RNA反轉錄為cDNA，使用TB Green?Premix Ex TaqTM II(Takara)在實時PCR系統(Light Cycler 96 System)中通過實時熒光定量(q-PCR)擴增cDNA。

1.2.3 免疫組織化學實驗

將保存在4%多聚甲醛溶液中的睪丸(繁殖期和非繁殖期各10個)同批進行沖洗、脫水、浸蠟和包埋處理，5 μm切片在60℃恒溫6 h，然后常規(guī)脫蠟、蒸餾水沖洗，按照免疫組化染色試劑盒(SP-0032，北京博奧森?)的操作說明進行。其中，實驗組用兔抗羊MTNR1a(bs-0027R)和MTNR1b(bs-0963R)多克隆抗體(1∶250)作為第一抗體進行陽性反應，陰性對照組用PBS代替第一抗體進行處理，所有樣品4℃過夜(12 h)，后加山羊抗兔IgG，加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，最后用DAB顯色劑顯色。借助Motic Images Plus 3.0軟件拍照。進一步對免疫組化陽性進行定量評價。根據實驗效果，選擇兩個時期每只實驗動物1張切片(每張重復3個視野)，利用Image Pro Plus軟件進行平均光密度值(Average optical density)測定，用IP圖像處理技術計算：平均光密度值=累計光密度/有效測量區(qū)面積。

1.3 數據處理

q-PCR實驗結果使用相對定量法(2-ΔΔCq)計算目的基因的相對表達量，每個基因相對表達量均以內參基因為基準進行校正。以上所有數據均使用SPSS 26.0軟件，采用獨立樣本t檢驗分析，結果用平均值±標準誤(mean±SE)表示，用Excel進行數據統計作圖。

2 結果

2.1 高原鼢鼠繁殖期和非繁殖期性腺器官重量變化

高原鼢鼠體重在繁殖期與非繁殖期無顯著變化(P＞0.05)，但非繁殖期的睪丸、附睪以及精囊腺的重量較繁殖期分別下降了87.98%、89.95%和97.02%，表現出顯著的季節(jié)性變化(P＜0.05)(表2)。

表2 高原鼢鼠繁殖期和非繁殖期性腺器官重量變化Table 2 Weight changes of gonad organs during the breeding and non-breeding seasons of plateau zokor

2.2 MTNR1a和MTNR1b mRNA在高原鼢鼠中的表達

高原鼢鼠繁殖期和非繁殖期下丘腦、垂體和睪丸中均檢測到MTNR1amRNA的表達。在繁殖期，高原鼢鼠下丘腦和垂體中MTNR1amRNA的相對表達量顯著高于非繁殖期(P＜0.05)，但繁殖期睪丸中的相對表達量顯著低于非繁殖期(P＜0.01)(圖1A)。

圖1 MTNR1a和MTNR1b mRNA在繁殖期與非繁殖期高原鼢鼠下丘腦、垂體和睪丸中的表達.A：MTNR1a mRNA的相對表達量；B：MTNR1b mRNA的相對表達量.*P＜0.05；**P＜0.01Fig.1 MTNR1a and MTNR1b mRNA in the hypothalamus,pituitary,and testis of plateau zokor during the breeding and non-breeding seasons.A:relative expression level of MTNR1a mRNA;B:relative expression level of MTNR1b mRNA.*P＜0.05;**P＜0.01

高原鼢鼠下丘腦和垂體中，繁殖期與非繁殖期的MTNR1b基因相對表達量無顯著差異(P＞0.05)，但在睪丸中MTNR1b基因在繁殖期的相對表達量顯著低于非繁殖期(P＜0.01)(圖1B)。

2.3 MTNR1a和MTNR1b在高原鼢鼠中的定位

高原鼢鼠繁殖期MTNR1a在睪丸間質細胞的胞漿中具有免疫陽性信號，在曲細精管內的支持細胞以及除長形精子細胞以外的各級生殖細胞中均有陽性表達，其中包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞和圓形精子細胞；但非繁殖期MTNR1a在高原鼢鼠睪丸的間質細胞、支持細胞和精原細胞中均有陽性表達(圖2A、D)。

MTNR1b在高原鼢鼠繁殖期多種細胞的胞漿中存在免疫陽性信號，包括支持細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、圓形精子細胞和間質細胞，但在細胞核中無表達，在精原細胞和長形精子細胞中也無免疫信號；在非繁殖期睪丸間質細胞和支持細胞的細胞質中均檢測到MTNR1b的陽性信號，但在精原細胞中無表達(圖2B、E)。

2.4 高原鼢鼠睪丸中MTNR1a和MTNR1b的免疫組化陽性評價

高原鼢鼠非繁殖期睪丸中MTNR1a的陽性信號的平均光密度值顯著高于繁殖期(P＜0.01)(圖3A)。與MTNR1a相似，繁殖期睪丸中MTNR1b的平均光密度值顯著低于非繁殖期(P＜0.01)(圖 3B)。

3 討論

伴隨著高原鼢鼠性腺的季節(jié)性發(fā)育，褪黑素受體基因在其下丘腦、垂體和睪丸中也呈現出季節(jié)性變化，但MTNR1a基因表達量在下丘腦、垂體和睪丸中有顯著季節(jié)性差異，MTNR1b基因僅在睪丸中有季節(jié)性差異。免疫定位和表達量分析發(fā)現，褪黑素通過與不同細胞上的受體結合，影響高原鼢鼠睪丸的生長發(fā)育，揭示了褪黑素在高原鼢鼠季節(jié)性繁殖調控中的重要作用，對豐富高原鼢鼠繁殖調控理論具有重要意義。

季節(jié)性繁殖動物的性腺活性在全年中出現周期性變化，包括睪丸大小、精子發(fā)生以及生殖激素的合成和分泌等(郝偉麗等，2016;Wanget al.,2017)。本研究發(fā)現，高原鼢鼠性腺發(fā)育在非繁殖期出現明顯退化，具有季節(jié)性繁殖特征。高原鼢鼠屬于地下嚙齒動物，感光受洞道限制，安曉宇等(2020)發(fā)現高原鼢鼠褪黑素水平在繁殖期和非繁殖期有顯著差異，說明褪黑素可能參與了高原鼢鼠的季節(jié)性繁殖調控，但有關機理未知。本研究發(fā)現MTNR1a和MTNR1b基因在雄性高原鼢鼠下丘腦、垂體和睪丸中顯著表達。相似的研究也在其他物種中報道，如甘加藏羊(Ovis aries)整個發(fā)情周期下丘腦、垂體和卵巢中MTNR1a基因均有表達，且不同時期存在差異(楊大鵬等，2019)。MTNR1a和MTNR1b基因在牦牛下丘腦、垂體以及睪丸中明顯表達 (陳健楠等，2020)。王玉軍等(2020)通過對高原鼠兔(Ochotona curzoniae)繁殖期注射褪黑素處理，發(fā)現其睪丸重量下降，精子發(fā)生停止，而在非繁殖期注射褪黑素受體拮抗劑，發(fā)現睪丸重量顯著增加，各級生殖細胞重新出現，精子發(fā)生恢復。這提示光周期誘導的褪黑素是引起季節(jié)性繁殖動物性腺周期性變化的潛在原因。作為相同高原環(huán)境下生存的高原鼢鼠，褪黑素可能有類似的作用，推測褪黑素通過與HPG軸上受體結合調控高原鼢鼠的季節(jié)性繁殖，但這還需后續(xù)通過注射褪黑素處理等研究來進一步驗證。

利用原位雜交組織化學技術發(fā)現，MTNR1a和MTNR1bmRNA在小鼠下丘腦SCN中表達(Dubocovichet al.,1998)。這與本研究在下丘腦不同時期檢測到MTNR1a和MTNR1b基因的表達相似。下丘腦SCN是控制行為、代謝和生理節(jié)律的主時鐘(Reppert and Weaver,2001;Gillette and Mitchell,2002)，包括光信號調節(jié)松果體褪黑素的合成與分泌(Moore,1995)。研究發(fā)現，松果體產生的內源性褪黑素可通過反饋機制影響MTNR1a和MTNR1b基因的表達，調節(jié)SCN神經元活性和晝夜節(jié)律(Gillette and Mitchell,2002)。本研究中，MTNR1a和MTNR1bmRNA在高原鼢鼠下丘腦中表達，暗示其在SCN中轉錄翻譯的受體可能與褪黑素結合，調節(jié)神經元活性和晝夜節(jié)律，使之在行為上與一天中光周期的變化同步，進而適應一年中的季節(jié)變化。研究發(fā)現，位于下丘腦弓狀核中的親吻素(kisspeptins,Kp)是一種調節(jié)生殖功能的激活劑(Anselet al.,2010)。Simonneaux等 (2013)將金色中倉鼠(Mesocricetus auratus)暴露在短日照條件下，手術切除松果體去除內源性褪黑素影響，發(fā)現弓狀核中Kp蛋白表達增加，并在幾周內金色中倉鼠恢復到繁殖期狀態(tài)；Fischer等(2017)證實下丘腦弓狀核中也存在MTNR1a，這說明褪黑素通過與MTNR1a結合參與調節(jié)Kp蛋白的表達水平，間接調控動物繁殖。本研究中，MTNR1a基因表達量在高原鼢鼠下丘腦中存在明顯的季節(jié)差異，說明MTNR1a基因轉錄翻譯出不同水平的受體與褪黑素結合，但具體的通路，如是否參與調節(jié)下丘腦弓狀核中Kp蛋白的表達，間接調控高原鼢鼠的繁殖狀態(tài)，還需要進一步分析驗證。

在綿羊垂體結節(jié)部體外培養(yǎng)細胞的研究中發(fā)現，佛司可林(Forskolin)能誘導MTNR1a基因表達增加，但這種增加又被褪黑素本身所抑制(Barrettet al.,1996)；同樣，給處于黑暗環(huán)境中的大鼠施加光照，發(fā)現MTNR1a基因的表達在1 h內顯著增加，相反在施加光照前15 min注射外源褪黑素可以逆轉上述現象，說明褪黑素對大鼠垂體結節(jié)部MTNR1a基因的表達具有抑制作用(Guerreroet al.,2000)。這些研究說明垂體中MTNR1a基因的表達受褪黑素本身抑制，而高原鼢鼠內源性褪黑素水平在繁殖期顯著低于非繁殖期(安曉宇等，2020)。本研究發(fā)現高原鼢鼠繁殖期垂體中MTNR1a基因的相對表達量顯著高于非繁殖期，基因的表達量與激素水平呈負相關，這與以上結果相似。垂體結節(jié)部是褪黑激素受體密度最高的部位(Masson-Pévet and Gauer,1994)。在原倉鼠 (Cricetus cricetus)垂體結節(jié)部產生促甲狀腺素(Hyroid stimulating hormone,TSH)的細胞上，發(fā)現MTNR1a高表達(Dardenteet al.,2003)，說明褪黑素影響TSH的合成和分泌。TSH通過調控2型甲狀腺素脫碘酶(Type 2 thyroid hormone deiodinase)和3型甲狀腺素脫碘酶(Type 3 thyroid hormone deiodinase)的轉換，調節(jié)甲狀腺素(Thyroid hormone)水平(Hanonet al.,2008;Klosenet al.,2013)，進而誘導GnRH神經元活化促進動物繁殖(Nishiwaki-Ohkawa and Yoshimura,2016)。此外，褪黑素與受體結合還可調節(jié)垂體遠側PL的分泌和門脈血管的發(fā)生，從而影響動物繁殖(Lincoln and Clarke,1994)，證明垂體的MTNR1a在動物的繁殖調控中發(fā)揮關鍵作用。綜上可推斷，繁殖期MTNR1a基因轉錄翻譯的受體與低水平褪黑素結合，可能對高原鼢鼠繁殖活動的發(fā)生具有促進作用；相反，非繁殖期高水平的褪黑素抑制MTNR1a基因的表達，從而可能限制其繁殖活動的進行。陳健楠等(2020)在牦牛的垂體中檢測到MTNR1bmRNA的表達，說明MTNR1b存在于牦牛垂體中，但對其在繁殖功能性狀的研究較少，在本研究中同樣檢測到不同時期高原鼢鼠垂體中MTNR1b基因的表達，而繁殖期與非繁殖期表達差異不顯著。

HPG軸上除了下丘腦和垂體外，性腺組織中也存在褪黑素受體結合位點(Clemenset al.,2001;Ku?et al.,2002)。本研究中，MTNR1a和MTNR1bmRNA在高原鼢鼠不同時期睪丸中均存在明顯表達，表明褪黑素與受體結合直接影響高原鼢鼠睪丸的生長發(fā)育。外源褪黑素綿羊體外共培養(yǎng)發(fā)現，褪黑素能促進綿羊睪丸間質細胞和支持細胞分泌睪酮，并檢測到MTNR1a基因的表達(Denget al.,2018)。而通過蛋白質印跡技術發(fā)現，雄性狍(Capreolus capreolus)睪丸中MTNR1a和MTNR1b的表達在發(fā)情期前(5月)和發(fā)情期(7—8月)均高于發(fā)情期后(9月)，表明褪黑素通過與不同受體結合對雄性狍睪丸(即類固醇生成和精子發(fā)生)發(fā)育具有促進作用(Kozio?et al.,2020)。與之相反，在歐洲雄性野牛(Bison bonasus)中發(fā)現，與發(fā)情期前(6月)相比，發(fā)情期后 (12月)檢測到睪丸中MTNR1a和MTNR1b基因高水平表達，證明發(fā)情期后褪黑素與不同受體結合對歐洲野牛睪丸精子發(fā)生的抑制作用增強(Tabecka-Lonczynskaet al.,2017)；同樣將金色中倉鼠(Mesocricetus auratus)暴露在3種不同的光照條件下，發(fā)現睪丸類固醇合成減少，MTNR1a基因的表達增加并且伴隨局部褪黑素水平的升高(Mukherjee and Haldar,2014)，與本研究結果相似，褪黑素與MTNR1a和MTNR1b結合對睪丸組織發(fā)育具有抑制作用，這也表明MTNR1a和MTNR1b基因在睪丸中的功能性狀存在物種差異。本研究在非繁殖期高原鼢鼠睪丸中檢測到MTNR1a和MTNR1b基因高表達，推測在這一時期褪黑素與受體結合可能最大限度地抑制高原鼢鼠繁殖，從而減少能量損失來度過寒冷的冬季。為進一步探究褪黑素與睪丸間的關系，本研究利用免疫組化技術檢測到睪丸的多種細胞類型中存在MTNR1a和MTNR1b的陽性信號，并存有差異，這表明褪黑素對高原鼢鼠睪丸的調控作用是在不同類型細胞上完成的。

綜上所述，高原鼢鼠褪黑素受體基因在HPG軸上存在明顯表達，且MTNR1a和MTNR1bmRNA在繁殖期與非繁殖期高原鼢鼠下丘腦、垂體和睪丸中的表達模式不同，推測褪黑素通過與不同類型細胞上的受體結合，直接調節(jié)高原鼢鼠睪丸的生長發(fā)育和精子發(fā)生。本研究為理解光周期調控高原鼢鼠季節(jié)性繁殖的機理提供了參考，同時對豐富地下物種季節(jié)性繁殖調控理論具有重要意義。然而，針對褪黑素對高原鼢鼠睪丸發(fā)育、精子發(fā)生的影響，后續(xù)仍需進一步研究。