曾家晶 趙怡嬌 曾東琳 唐為玲 李尊文Gefu WANG-PRUSKI 賴鐘雄 郭容芳*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福州 350002； 2.福建農(nóng)林大學(xué)戴爾豪西大學(xué)聯(lián)合試驗(yàn)室，福州 350002)

TCP

家族基因是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族之一，不僅參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，在植物體生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段也起到重要的調(diào)控作用。

TCP

轉(zhuǎn)錄因子基因家族首先發(fā)現(xiàn)于1999年，此基因的命名起初來自3個(gè)不同物種的4個(gè)基因，分別是對(duì)玉米中抑制側(cè)枝生長(zhǎng)和雄花形成有重要作用的

TB1

(

Teosinte

branched

1

)基因、金魚草中參與早期的花器官側(cè)生區(qū)域表達(dá)并調(diào)控花對(duì)稱性的

CYC

(

CYCLOIDEA

)基因、水稻中與細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的

PCF1

(

Proliferating

cell

factors

1

)基因和

PCF2

(

Proliferating

cell

factors

2

)基因，

TCP

即取其4個(gè)基因的首字母而得名?；趯?duì)

TCP

基因家族結(jié)構(gòu)域同源性分析，可將

TCP

基因家族分為ClassⅠ(或者

TCP

-

P

)和ClassⅡ(或者

TCP

-

C

)2個(gè)類群。ClassⅠ類又名

PCF

亞家族，ClassⅡ則進(jìn)一步劃分為

CIN

和

CYC

/

TB1

這2個(gè)亞家族。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，

TCP

基因家族相繼在擬南芥、水稻、番茄、馬鈴薯、高粱、牡丹和香蕉等物種中得到鑒定，并發(fā)現(xiàn)該家族成員廣泛參與調(diào)控植物胚胎生長(zhǎng)、種子萌發(fā)、花粉發(fā)育、葉片發(fā)育、細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律和激素信號(hào)傳導(dǎo)等生長(zhǎng)發(fā)育過程。在擬南芥屬于ClassⅠ類的成員中，

AtTCP15

不僅參與節(jié)間長(zhǎng)度調(diào)控，在葉片發(fā)育方面也起調(diào)控作用；

AtTCP20

與生長(zhǎng)發(fā)育、茉莉酸(JA)生物合成及葉片衰老調(diào)控有關(guān)；

AtTCP22

負(fù)調(diào)控葉片的衰老，且與

AtTCP15

存在功能上的冗余。在擬南芥屬于ClassⅡ類的成員中，

AtTCP1

能夠調(diào)控

DWARF4

基因的表達(dá)，從而影響油菜素類固醇的合成，進(jìn)而調(diào)控其自身的生長(zhǎng)發(fā)育；

AtTCP18

和

AtTCP12

在腋芽中表達(dá)，其單突變體能夠減少這2個(gè)基因的表達(dá)，增加分枝；5個(gè)

CIN

-

TCP

基因(

AtTCP2

、

AtTCP3

、

AtTCP4

、

AtTCP10

和

AtTCP24

)均是miR319的靶基因，參與調(diào)控葉片的形態(tài)建成；

CIN

-

TCP

轉(zhuǎn)錄因子通過促進(jìn)分化來影響葉片形狀。在金魚草中，

CIN

類成員促進(jìn)了葉片層的組織分化和生長(zhǎng)停滯，將發(fā)育程序推向了次級(jí)形態(tài)發(fā)生。在擬南芥中，當(dāng)葉片開始發(fā)育時(shí)，連續(xù)的

TCP

活性促進(jìn)了從初級(jí)形態(tài)發(fā)生到細(xì)胞擴(kuò)張和次級(jí)形態(tài)發(fā)生階段的轉(zhuǎn)變。此外，玉米Ⅱ組基因

TB1

能夠影響腋分生組織的分化速率，防止低節(jié)間點(diǎn)芽的突起和促進(jìn)高節(jié)間點(diǎn)雌花序的形成；番茄Ⅱ組基因

SlTCP9

和

SlTCP7

對(duì)腋芽的起始和突起起到相似的作用。此外，有研究表明相關(guān)ClassⅡ亞家族成員與ClassⅠ亞家族成員起相互拮抗作用。芥藍(lán)(

Brassica

oleracea

)屬于十字花科蕓薹屬一二年生草本植物，甘藍(lán)類蔬菜之一，原產(chǎn)于中國(guó)南部，是中國(guó)的特產(chǎn)蔬菜之一。芥藍(lán)品種多樣，葉片和主薹等形態(tài)存在差異，其菜苔柔嫩、鮮脆，味鮮美，以肥嫩的花薹和嫩葉供食用，且芥藍(lán)富含胡蘿卜素、維生素C和芥子油苷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的功能型蔬菜。芥藍(lán)因其獨(dú)特風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)保健功效而受到人們喜愛?！愎健嫠{(lán)因真葉葉脈上長(zhǎng)有小葉，貌似菇花而得名，其真葉上長(zhǎng)出的小葉形態(tài)特異，俗稱‘菇葉’，屬于廣東潮汕地區(qū)特色品種，后引種到福建。作為蕓薹屬物種的重要蔬菜之一，芥藍(lán)在我國(guó)南方地區(qū)如福建、廣東和云南等地廣泛栽培。雖然栽培面積較廣，但是其單位面積產(chǎn)出率偏低，導(dǎo)致其總產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益總體偏低。菜薹產(chǎn)量較低以及口感較差，很大一部分原因是對(duì)調(diào)控其食用器官的分子機(jī)制尚未可知，這就涉及到與葉片發(fā)育密切相關(guān)的

TCP

轉(zhuǎn)錄因子家族。目前，對(duì)于

TCP

基因家族的研究主要集中在模式植物擬南芥、水稻和玉米等物種，在蔬菜中，特別是十字花科蕓薹屬物種，關(guān)于

TCP

基因家族的研究鮮有報(bào)道，而關(guān)于葉片發(fā)育的研究則更加不明確。相關(guān)

TCP

家族成員在模式植物中，對(duì)葉片生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，而葉片作為植物重要的組成部位，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，影響葉菜類植物產(chǎn)量及風(fēng)味品質(zhì)的形成。基于此，本研究推測(cè)葉菜類的‘香菇’芥藍(lán)中，其葉片發(fā)育大小和葉緣形狀與

TCP

轉(zhuǎn)錄因子家族密切相關(guān)。因此，本研究擬以甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，采用生物信息學(xué)方法對(duì)芥藍(lán)中的

TCP

家族成員進(jìn)行鑒定，明確相關(guān)

BoTCP

成員與葉片發(fā)育之間存在的關(guān)系，進(jìn)而全面分析

BoTCP

家族成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序、基因的染色體定位、種內(nèi)種間共線性關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化樹、啟動(dòng)子順式作用元件、蛋白互作關(guān)系、RNA-Seq數(shù)據(jù)和qRT-PCR表達(dá)，旨在為深入揭示芥藍(lán)

TCP

基因家族的生物學(xué)功能及挖掘與葉片發(fā)育相關(guān)成員奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為‘香菇’芥藍(lán)，第1批試驗(yàn)材料種植于福建農(nóng)林大學(xué)園藝樓人工培養(yǎng)室內(nèi)。將芥藍(lán)種子均勻撒在裝有濕潤(rùn)珍珠巖的培養(yǎng)皿中(

d

=15 cm)，置于28 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)催芽，前3 d黑暗處理，后7 d光周期設(shè)定為16 h/8 h(Light/Dark)。待子葉完全展開且育苗滿10 d后將芥藍(lán)幼苗移入裝有混合基質(zhì)(

V

(草炭土)∶

V

(蛭石)∶

V

(珍珠巖)=3∶1∶1)的培養(yǎng)缽中，放置在人工氣候箱(MGC-450HP-2，上海一恒科技有限公司)，25 ℃(16 h/8 h(Light/Dark))進(jìn)行光照培養(yǎng)。生長(zhǎng)3周后，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的‘香菇’芥藍(lán)植株，對(duì)其根、葉緣、葉肉、葉脈和菇葉這5個(gè)部位進(jìn)行取樣，每份樣品取0.1 g，3次生物學(xué)重復(fù)。

第2批試驗(yàn)材料種植于福建農(nóng)林大學(xué)設(shè)施溫室大棚，前期在催芽與幼苗培養(yǎng)中培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置與第1批試驗(yàn)材料相同。培養(yǎng)20 d后定植于精整的田間，行距為35 cm，列距為30 cm，田間四周設(shè)置保護(hù)行，定期進(jìn)行日常澆水和施肥等田間管理。在2020年9月—2021年3月期間，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的‘香菇’植株，進(jìn)行不同組織部位取樣，取樣分2個(gè)時(shí)期共10個(gè)部位：在抽薹未開花時(shí)期(以下簡(jiǎn)稱Ⅰ時(shí)期)，對(duì)根、真葉、花莖和薹葉(1次側(cè)薹)進(jìn)行取樣；在全部結(jié)莢時(shí)期(以下簡(jiǎn)稱Ⅱ時(shí)期)，對(duì)根、真葉、花莖和薹葉進(jìn)行取樣；在顯微鏡下觀察到種子處于子葉形胚時(shí)期(以下亦簡(jiǎn)稱Ⅱ時(shí)期)，對(duì)該時(shí)期種子和種莢進(jìn)行取樣。每份樣品取0.1 g，3次生物學(xué)重復(fù)，取樣后經(jīng)液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱，以備后續(xù)qRT-PCR表達(dá)分析。

1.2 方法

1

.

2

.

1

芥藍(lán)

TCP

基因家族成員鑒定

本研究所使用的基因組序列信息和基因組基因結(jié)構(gòu)注釋信息包含甘藍(lán)基因組、擬南芥基因組以及水稻基因組，其中甘藍(lán)基因組和水稻基因組來源于Ensembl網(wǎng)站(http:∥plants.ensembl.org/)，擬南芥基因組來源于TAIR網(wǎng)站(https:∥www.arabidopsis.org/)。

利用TBtools 1.0695軟件，在Blast界面下設(shè)定參數(shù)E-value:1e-5和Number of hits:500，選取擬南芥

TCP

家族氨基酸序列作為引用序列與甘藍(lán)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)，并結(jié)合NCBI網(wǎng)站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blast分析獲得芥藍(lán)

TCP

候選成員。將獲得的芥藍(lán)

TCP

候選成員序列在NCBI中的CD-Seach進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域比對(duì)，手動(dòng)刪除不包含

TCP

結(jié)構(gòu)域的候選序列。進(jìn)一步采用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)網(wǎng)站中PFAM domain在線分析候選成員序列的蛋白結(jié)構(gòu)域，從而篩選以確定芥藍(lán)

TCP

家族的成員數(shù)目。最后根據(jù)擬南芥

TCP

家族成員在芥藍(lán)中的查找同源基因注釋，參考擬南芥現(xiàn)有的命名方法，對(duì)芥藍(lán)

TCP

家族成員進(jìn)行命名。

1

.

2

.

2

芥藍(lán)

BoTCP

家族成員表達(dá)分析參考擬南芥

TCP

家族注釋到芥藍(lán)的同源基因功能和TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)基因的表達(dá)量，選定

BoTCP21

和

BoTCP25

用于qRT-PCR試驗(yàn)分析。

1

.

2

.

3

芥藍(lán)

TCP

基因結(jié)構(gòu)及蛋白基序分析采用ExPASy(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，采用singalp(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)分析N端信號(hào)肽，采用Softberry ProtComp 9.0(http:∥www.softberry.com/berry.phtml)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的分析與預(yù)測(cè)。下載gDNA序列的fasta文件和gff3文件后，進(jìn)一步獲得CDS序列，進(jìn)行Blast比對(duì)分析；采用GSDS2.0(http:∥gsds.cbi.pku. edu.cn/)對(duì)芥藍(lán)

TCP

不同成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子和外顯子特征分析并在線作圖；通過MEME(https:∥meme-suite.org/)在線分析

BoTCP

不同成員蛋白質(zhì)保守基序motif，設(shè)置motif檢索數(shù)目為20，并采用TBtools 1.0695軟件對(duì)獲得的motif進(jìn)行可視化分析作圖，再結(jié)合Smart中domain蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1

.

2

.

4

芥藍(lán)

TCP

基因染色體定位分析利用甘藍(lán)基因組中的gff3文件，通過TBtools 1.0695軟件，對(duì)芥藍(lán)

TCP

家族成員在染色體上的位置分布圖進(jìn)行繪制。

1

.

2

.

5

芥藍(lán)

TCP

基因家族種內(nèi)和種間共線性分析使用TBtools 1.0695中Circle gene view功能構(gòu)建芥藍(lán)全基因組種內(nèi)相關(guān)共線性圖譜。為進(jìn)一步揭示甘藍(lán)類作物基因組存在三倍化復(fù)雜復(fù)制過程，采用MCScanX對(duì)芥藍(lán)與擬南芥及水稻

TCPs

進(jìn)行種間共線性分析。

1

.

2

.

6

芥藍(lán)

TCP

基因啟動(dòng)子順式作用元件和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用TBtools 1.0695軟件提取

BoTCP

基因家族成員ATG上游2 000 bp作為啟動(dòng)子序列，使用BDGP(http:∥www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)在線預(yù)測(cè)各成員啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；同時(shí)使用PlantCARE Database(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線預(yù)測(cè)各成員啟動(dòng)子的順式作用元件種類和數(shù)量，在Excel 2016中整理數(shù)據(jù)并繪制透視圖。

1

.

2

.

7

芥藍(lán)

TCP

基因蛋白互作預(yù)測(cè)及系統(tǒng)發(fā)育分析將擬南芥、芥藍(lán)和水稻3個(gè)物種共86條

TCP

家族氨基酸序列在MEGA X軟件中進(jìn)行多序列比對(duì)，通過建模找出構(gòu)建進(jìn)化樹的最佳模型，進(jìn)一步在MEGA X中采用鄰近法(Neighbor-joining)下的JTT模型進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，自展法系數(shù)(Bootstrap)設(shè)置為1 000次。利用String 11.5(http:∥cn.string-db.org)在線軟件，選用K均值聚類算法分析，最低互動(dòng)評(píng)分選擇High confidence(0.700)，對(duì)

BoTCP

成員蛋白之間、成員與其他蛋白之間存在的互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1

.

2

.

8

家族基因在芥藍(lán)不同光質(zhì)處理下和不同時(shí)期種子種莢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)合芥藍(lán)在紅藍(lán)光質(zhì)處理下RNA-seq數(shù)據(jù)以及處于魚雷形胚時(shí)期和子葉形胚早期種子種莢的FPKM值，分析

BoTCP

家族各成員的表達(dá)趨勢(shì)，使用TBtools 1.0695軟件繪制表達(dá)量熱圖。

1

.

2

.

9

家族基因在芥藍(lán)不同時(shí)期不同組織部位的qRT

-

PCR分析采用TaKaRa試劑盒RNAiso Plus (Code No. 9109)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Code No. RR047A)和TB GreenPremix Ex

Taq

TM Ⅱ (Code No. RR820A)來依次提取芥藍(lán)材料總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。利用DNAMAN 9.0和Primer Premier 5軟件對(duì)所選序列進(jìn)行同源比對(duì)和qRT-PCR引物設(shè)計(jì)(表1)。以

BoActin

作為內(nèi)參基因，使用CFX96 Real-Time PCR Detection System儀器進(jìn)行定量檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL：TB Green Premix Ex

Taq

Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2x)10 μL，ddHO 7.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板1 μL，每個(gè)樣品4次生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)2方法來計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，利用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 24軟件中的Duncan法進(jìn)行顯著性分析(

P

≤0.05),并用Origin 2017軟件制作柱形圖。

表1 芥藍(lán)家族相關(guān)基因引物序列
Table 1 Primer sequence of family related genes in Chinese kale

引物名稱Primer name上游引物(5'→3')Forward primer (5'→3')下游引物(5'→3')Reverse primer (5'→3')引物用途Primer useBoActinCTGTGACAATGGTACCGGAATGACAGCCCTGGGAGCATCA內(nèi)參 ActinBoTCP5ACGACGGAGCAATGACTAACGTGGCGGCTATGATGGAAGGqPCRBoTCP14GCTCCACCGTCGTCGTCAATCGTCAGCATCAGCGTTCGTCqPCRBoTCP16CCCTTCAGTCCAGTTACAGTCCCAGGGACCCCTCTGAGAATAAAGCqPCRBoTCP21CAACTTGGCTGATACTCAAACGCCTTGGCTTAGGTTCGGGGTGqPCRBoTCP25GTCCCCTTCAGTCCAGTTACAGTGACCATCGTGCTGCTCCTCTqPCRBoTCP40GAGGTGGTGAATTATCGGTTGGGGTGTCGGACGAAGAGTGTAGCqPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍(lán)TCP基因家族成員鑒定及其在葉片不同部位的qRT-PCR分析

利用生物信息學(xué)方法，最終在芥藍(lán)中鑒定得到40個(gè)具有完整保守結(jié)構(gòu)域的

BoTCP

家族成員，參考擬南芥

TCP

家族成員命名方法，將其依次命名為

BoTCP1

～

BoTCP40

。參考擬南芥同源

TCP

基因注釋及擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)基因的相對(duì)表達(dá)量，初步選取

BoTCP21

和

BoTCP25

基因，采用qRT-PCR分析

BoTCP21

和

BoTCP25

在葉片不同部位(圖1(a))的相對(duì)表達(dá)量(圖1(b))。

BoTCP21

和

BoTCP25

均在葉片中大量表達(dá)，但兩者在真葉不同部位的表達(dá)模式存在差異。

BoTCP21

在真葉葉肉、葉脈和‘菇葉’中高表達(dá)，在葉緣中表達(dá)量較低，而

BoTCP25

則在葉緣中高表達(dá)，在葉肉、葉脈和‘菇葉’中表達(dá)量較低。表明這2個(gè)

BoTCP

成員與葉片發(fā)育密切相關(guān)且在葉片的近軸端和遠(yuǎn)軸端的表達(dá)趨勢(shì)相反，在葉片生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，二者是相互協(xié)同還是拮抗作用，是否還有其他的

BoTCP

家族成員參與葉片生長(zhǎng)發(fā)育過程，有待進(jìn)一步研究。

圖(b)內(nèi)不同小寫字母代表顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters in the graph (b) represent significant differences (P<0.05).圖1 ‘香菇’芥藍(lán)取樣示意圖及相關(guān)BoTCP成員在葉片不同部位的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 ‘Xiang Gu’ Chinese kale sampling diagram and relative expression of relevant BoTCP members in different parts of leaves

2.2 芥藍(lán)TCP基因家族成員蛋白基本理化性質(zhì)分析

通過分析芥藍(lán)

TCP

家族成員蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)(表2)，該家族的氨基酸長(zhǎng)度在188～473 aa之間，其中氨基酸序列最短的是

BoTCP22

，最長(zhǎng)的是

BoTCP18

；分子量介于3 222.52～50 857.24 ku，其中分子量最小的為

BoTCP17

，最大的為

BoTCP18

；等電點(diǎn)在5.24～10.48范圍內(nèi)，其中等電點(diǎn)最低的是

BoTCP6

，最高的是

BoTCP10

，有15個(gè)基因的等電點(diǎn)小于7.00，呈酸性，有1個(gè)等于7.00，呈中性，有24個(gè)大于7.00，呈堿性；

TCP

基因編碼蛋白的氨基端均無信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白；親水性數(shù)值顯示都為負(fù)值，預(yù)測(cè)40個(gè)

BoTCP

基因編碼蛋白均為親水性蛋白；根據(jù)不穩(wěn)定分析結(jié)果顯示，

BoTCP13

、

BoTCP22

和

BoTCP37

這3個(gè)基因編碼蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)低于40，可能為穩(wěn)定蛋白，其余可能是不穩(wěn)定蛋白；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，絕大部分的

BoTCP

家族成員定位在細(xì)胞核，各有1個(gè)成員定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞質(zhì)和液泡；參考擬南芥同源基因注釋，有19個(gè)

BoTCP

成員屬于

PCF

亞家族，13個(gè)成員屬于

CIN

類亞家族，其他8個(gè)成員屬于

CYC

類亞家族。

表2 芥藍(lán)基因家族成員蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)
Table 2 Basic physical and chemical properties of gene family proteins in Chinese kale

基因名稱Genename基因IDGeneID氨基酸數(shù)Numberof aminoacids分子量Molecularweight理論等電點(diǎn)Theoreticalpl平均親水性Gravy不穩(wěn)定指數(shù)Instabilityindex亞細(xì)胞定位Subcellularlocalization擬南芥同源基因Arabidopsishomologousgene類別ClassBoTCP1Bo00998s02028830 999.505.89-0.63451.05NCAtTCP19PCFBoTCP2Bo1g01952035839 146.657.91-0.84941.26NCAtTCP2CINBoTCP3Bo1g11749042648 744.226.88-0.89051.09NCAtTCP18CYCBoTCP4Bo1g12983035838 633.827.00-0.65468.00NCAtTCP3CINBoTCP5Bo2g00904022523 567.399.29-0.38849.71NCAtTCP21PCFBoTCP6Bo2g05564034639 407.665.24-0.86651.59NCAtTCP1CYC/TB1BoTCP7Bo2g06125034539 044.637.71-0.84251.92NCAtTCP12CYC/TB1BoTCP8Bo2g06439031433 286.407.43-0.67759.42NCAtTCP15PCFBoTCP9Bo2g07521037138 832.988.97-0.65444.42NCAtTCP22PCFBoTCP10Bo2g16097023024 924.2110.48-0.50353.01NCAtTCP7PCFBoTCP11Bo2g16124030133 765.066.35-0.80847.50NCAtTCP5CINBoTCP12Bo3g00467024427 292.216.40-0.62055.63NCAtTCP17CINBoTCP13Bo3g00485023524 258.1910.18-0.35838.63NCAtTCP21PCFBoTCP14Bo3g03890029330 942.339.71-0.24855.77NCAtTCP9PCFBoTCP15Bo3g05546032035 752.396.56-0.81854.77NCAtTCP13CINBoTCP16Bo3g06654040444 097.587.49-0.79168.45NCAtTCP4CINBoTCP17Bo3g0715602873 222.527.27-0.70457.12NCAtTCP18CYC/TB1BoTCP18Bo3g13472047350 857.246.66-0.87665.35NCAtTCP14PCFBoTCP19Bo3g14776030734 402.567.80-0.96964.52NCAtTCP24CINBoTCP20Bo4g02486033235 273.949.44-0.27758.57ERAtTCP9PCFBoTCP21Bo4g05368034938 687.396.44-0.87151.32CPAtTCP10CINBoTCP22Bo4g14076018820 205.639.20-0.64528.70NCAtTCP6PCFBoTCP23Bo5g06258031735 046.127.81-0.91550.83NCAtTCP24CINBoTCP24Bo5g11741041147 348.208.90-0.87854.55NCAtTCP18CYC/TB1BoTCP25Bo5g12750040444 277.888.02-0.80764.90NCAtTCP3CINBoTCP26Bo5g15284039043 898.389.12-0.46352.29VCAtTCP13CINBoTCP27Bo6g09527031133 366.407.43-0.73953.95NCAtTCP15PCFBoTCP28Bo6g09904035440 233.905.67-0.79844.91NCAtTCP1CYC/TB1BoTCP29Bo6g10367035940 875.565.41-0.86761.65NCAtTCP1CYC/TB1BoTCP30Bo6g10724032336 445.128.82-0.76360.43NCAtTCP12CYC/TB1BoTCP31Bo6g11029031934 037.097.08-0.77161.49NCAtTCP15PCFBoTCP32Bo6g11453035637 338.296.64-0.62846.90NCAtTCP23PCFBoTCP33Bo7g08412031833 475.996.95-0.66153.31NCAtTCP20PCFBoTCP34Bo7g09779024125 956.989.69-0.58155.64NCAtTCP7PCFBoTCP35Bo7g09826036440 441.986.35-0.89252.72NCAtTCP5CINBoTCP36Bo7g10596038241 987.657.05-0.93142.80NCAtTCP2CINBoTCP37Bo9g00811027429 032.245.64-0.49138.77NCAtTCP20PCFBoTCP38Bo9g01426021623 119.849.38-0.47545.17NCAtTCP7PCFBoTCP39Bo9g05209039241 170.066.05-0.67152.48NCAtTCP8PCFBoTCP40Bo9g17449023624 818.567.99-0.45446.81NCAtTCP21PCF

注：NC，細(xì)胞核；ER，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；CP，細(xì)胞質(zhì)；VC，液泡。
Note: NC, nucleus； ER, endoplasmic reticulum; CP, cytoplasm; VC, vacuole.

2.3 芥藍(lán)TCP基因家族基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白基序組成分析

利用基因組信息和蛋白質(zhì)編碼序列從基因結(jié)構(gòu)角度分析芥藍(lán)

TCP

家族的進(jìn)化過程(圖2(a))。結(jié)果表明40個(gè)家族成員中大部分成員基本不存在內(nèi)含子，僅以1個(gè)外顯子為主，占總數(shù)的82.5%；其中有4個(gè)家族成員(

BoTCP7

、

BoTCP11

、

BoTCP26

和

BoTCP28

)具有2個(gè)外顯子，占總數(shù)的10.0%，僅有1個(gè)家族成員(

BoTCP17

)包含有3個(gè)外顯子，占總數(shù)的2.5%，有2個(gè)

TCP

家族成員(

BoTCP3

和

BoTCP24

)具有4個(gè)外顯子，占總數(shù)的5.0%。有趣的是，在擬南芥中，其

TCP

基因家族只含有1個(gè)外顯子的成員約占總數(shù)的82.0%，占比上趨近于芥藍(lán)，不同

BoTCP

成員外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)數(shù)量分布不同，可能是物種進(jìn)化過程中由于內(nèi)含子的插入或丟失造成的，進(jìn)而很大程度上會(huì)導(dǎo)致其基因功能的分化和表達(dá)調(diào)控方式的多樣性。通過上述結(jié)果，預(yù)測(cè)擬南芥和芥藍(lán)的

TCP

家族成員在基因功能的表達(dá)上具有一定的相似性。為了解芥藍(lán)

TCP

家族成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，利用MEME在線軟件預(yù)測(cè)分析，設(shè)定搜索出20個(gè)motif，結(jié)果顯示40個(gè)芥藍(lán)

TCP

家族成員氨基酸序列中均包含motif1，大部分序列(25條以上)包含motif2～4和motif15這4個(gè)motif，表明這5個(gè)基序在芥藍(lán)TCP蛋白中較為保守。由編碼蛋白保守基序標(biāo)識(shí)和motif基本信息所示(圖2(b))，其中最保守的基序motif1的氨基酸長(zhǎng)度為50，數(shù)量為40，再結(jié)合domain結(jié)構(gòu)域(圖2(c))進(jìn)一步分析可知，motif1即為

TCP

結(jié)構(gòu)域。各成員含有motif的數(shù)量差異較大，最少含有2個(gè)motif，且總是以motif1與motif2、motif1與motif3組合的形式出現(xiàn)在9個(gè)芥藍(lán)

TCP

家族成員蛋白序列中；最多含有7個(gè)motif，其中

BoTCP4

、

BoTCP16

、

BoTCP25

編碼蛋白與

BoTCP28

、

BoTCP29

編碼蛋白具有的motif基序種類和排列順序一致；某些motif保守基序只在特定的成員氨基酸序列中出現(xiàn)，motif10只在

BoTCP8

、

BoTCP27

和

BoTCP31

這3個(gè)成員中出現(xiàn)，motif14也只在

BoTCP4

、

BoTCP16

和

BoTCP25

中出現(xiàn);另外同一個(gè)家族成員編碼的蛋白序列中，只有motif2存在2次重復(fù)出現(xiàn)的情況，體現(xiàn)在

BoTCP14

和

BoTCP39

編碼的蛋白質(zhì)序列中，預(yù)測(cè)二者可能編碼相似的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。本研究還發(fā)現(xiàn)，某些motif的出現(xiàn)呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，如motif2總是與motif1相鄰并在其后出現(xiàn)，motif3也總是與motif1相鄰并在其前出現(xiàn)，推測(cè)可能包含該序列特征的成員屬于同一個(gè)亞家族。

圖2 芥藍(lán)TCP家族基因結(jié)構(gòu)(a)、保守基序(b)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域(c)分布圖Fig.2 The distribution map of the gene structure (a), conserved motif (b) and protein conserved domain (c) of the TCP family of Chinese kale

2.4 芥藍(lán)TCP基因家族染色體定位

利用甘藍(lán)基因組gff3文件，通過TBtools軟件進(jìn)行染色體定位結(jié)果可視化，獲得芥藍(lán)

TCP

家族成員染色體定位信息(圖3)。40個(gè)芥藍(lán)

TCP

家族成員中除了

TCP1

，其他39個(gè)成員均能精準(zhǔn)定位在組裝好的9條染色體上的第1、2、3、4、5、6、7及第9條上且不均勻分布。其中第3條染色體上分布最多，含有8個(gè)成員，占比20.0%；第1條和第4條分布最少，各有3個(gè)成員，各占比7.5%；第5、7和9條染色體各包含4個(gè)成員，各占比10.0%；第6條染色體分布有6個(gè)成員，占比15.0%；第2條染色體含有7個(gè)成員，占比17.5%。除此之外，從圖中可以明顯看出存在小型的基因簇，第2條染色體上的

BoTCP10

和

BoTCP11

、第3條染色體上的

BoTCP12

和

BoTCP13

以及第7條染色體上的

BoTCP34

和

BoTCP35

都相聚在同一位點(diǎn)上，預(yù)測(cè)這3條染色體的2個(gè)成員在功能上具有相似性。

圖3 芥藍(lán)TCP家族成員染色體定位圖Fig.3 Chromosome mapping of TCP family members of Chinese kale

2.5 芥藍(lán)TCP基因家族種內(nèi)和種間共線性分析

在進(jìn)化過程中，染色體通過節(jié)段復(fù)制、串聯(lián)復(fù)制和全基因組復(fù)制在不同基因組中發(fā)生擴(kuò)增有助于擴(kuò)大基因家族。采用MCScanX軟件對(duì)

BoTCPs

進(jìn)行共線性關(guān)系分析(圖4(a))，發(fā)現(xiàn)該家族存在24對(duì)重復(fù)基因，其中在第2、3和7條染色體上各含有1對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，分別為

BoTCP10-BoTCP11

、

BoTCP12-BoTCP13

和

BoTCP34-BoTCP35

，其余21對(duì)基因?yàn)槿旧w片段重復(fù)基因。由于甘藍(lán)類作物基因組存在三倍化復(fù)雜復(fù)制過程，利用擬南芥基因組和水稻基因組與甘藍(lán)基因組進(jìn)一步分析芥藍(lán)與擬南芥同源基因、水稻

TCP

家族的共線關(guān)系。如圖4(b)所示，共有8條染色體上的32個(gè)

BoTCP

基因與5條染色體上的19個(gè)

AtTCP

基因構(gòu)成37對(duì)共線性關(guān)系。對(duì)擬南芥

TCP

基因與芥藍(lán)的共線基因統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，68%的

AtTCP

基因在芥藍(lán)中有2個(gè)以上共線基因，其中

AtTCP4

在芥藍(lán)中有9個(gè)共線基因，表明

BoTCP

基因家族在蕓薹屬多倍化事件中得到顯著的擴(kuò)張。僅有4條染色體上的5個(gè)

BoTCP

基因與4條染色體上的5個(gè)

OsTCP

基因存在6對(duì)共線性關(guān)系，表明芥藍(lán)與雙子葉植物擬南芥的親緣關(guān)系更近，與單子葉植物水稻的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。此外，5個(gè)成員(

BoTCP19

、

BoTCP23

、

BoTCP31

、

BoTCP33

和

BoTCP34

)在芥藍(lán)與擬南芥基因組共線性及芥藍(lán)與水稻基因組共線性中均有發(fā)現(xiàn)，推測(cè)這些成員在單子葉與雙子葉植物祖先分化前已經(jīng)完成進(jìn)化。

圖4 芥藍(lán)TCP家族成員種內(nèi)(a)及與擬南芥和水稻的種間(b)共線性關(guān)系圖Fig.4 Intraspecific (a) and interspecific (b) collinear relationships amongTCP family members in Chinese kale and Arabidopsis and rice

2.6 芥藍(lán)TCP基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建分析

為研究芥藍(lán)與擬南芥和水稻

TCP

之間的進(jìn)化關(guān)系，采用這3個(gè)物種的TCP氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。參考擬南芥中

TCP

基因分類，再結(jié)合進(jìn)化樹中成員聚類情況，可初步將

TCP

基因家族分為3類，即

PCF

亞家族、

CYC

亞家族和

CIN

亞家族。在

PCF

亞家族中，芥藍(lán)、擬南芥和水稻各有成員19、12和14個(gè)；在

CYC

亞家族中，芥藍(lán)、擬南芥和水稻各有成員8、4和2個(gè)；在

CIN

亞家族中，芥藍(lán)、擬南芥和水稻各有成員13、8和6個(gè)。從聚類情況來看，芥藍(lán)

TCP

家族成員將近50%屬于

PCF

亞家族，同一類的

TCP

基因家族成員可能行使相似的功能。

圖5 芥藍(lán)、水稻和擬南芥中TCP家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of TCP family members in Chinese kale, rice and Arabidopsis

2.7 芥藍(lán)TCP基因家族啟動(dòng)子順式作用元件和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分析

分析芥藍(lán)

BoTCP

基因啟動(dòng)子序列(ATG上游2 000 bp)，預(yù)測(cè)存在的核心啟動(dòng)子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。將芥藍(lán)

TCP

家族成員啟動(dòng)子分別命名為：

BoTCP1p

～

BoTCP40p

。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明：40個(gè)芥藍(lán)

TCP

家族成員中除了

BoTCP22p

、

BoTCP24p

和

BoTCP25p

這3個(gè)成員出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始起點(diǎn)缺失外，其余37個(gè)成員均包含轉(zhuǎn)錄起始起點(diǎn)；其中

BoTCP9p

、

BoTCP14p

和

BoTCP30p

僅有1個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，

BoTCP21p

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)最多，達(dá)到6個(gè)，且得分都≥0.88，其余33個(gè)成員均具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。總體而言，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)量和得分存在較大差異。為深入了解

BoTCP

家族成員之間對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)和激素的應(yīng)答調(diào)控功能，對(duì)其基因上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)(圖6)。結(jié)果表明：在預(yù)測(cè)到的15種響應(yīng)元件中，所有家族成員均具有光響應(yīng)元件，且各成員含有的光響應(yīng)元件在種類和數(shù)量上存在較大差異；55%以上的基因成員含有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、脫落酸和茉莉酸甲酯激素應(yīng)答元件；40%的基因成員響應(yīng)生長(zhǎng)素和乙烯的調(diào)控；20%的基因成員含有赤霉素、水楊酸、玉米膠蛋白代謝、低溫、晝夜節(jié)律、防御脅迫和干旱脅迫下

MYB

結(jié)合位點(diǎn)響應(yīng)元件，表明這些基因可能具有響應(yīng)以上元件的作用；只有4個(gè)(

BoTCP1p

、

BoTCP6p

、

BoTCP13p

和

BoTCP27p

)成員包含響應(yīng)分生組織表達(dá)元件，推測(cè)這些成員在芥藍(lán)分生組織表達(dá)方面發(fā)揮重要作用；此外，也只有4個(gè)(

BoTCP1p

、

BoTCP5p

、

BoTCP12p

和

BoTCP40p

)成員包含光脅迫下

MYB

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，暗示了在特定條件下，芥藍(lán)

TCP

家族基因可能受

MYB

結(jié)合因子調(diào)控作用；值的注意的是，只有

BoTCP1p

基因同時(shí)含有分生組織表達(dá)和光脅迫下

MYB

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，猜測(cè)

BoTCP1p

基因在芥藍(lán)中協(xié)同調(diào)控分生組織表達(dá)和

MYB

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

圖6 芥藍(lán)TCP基因家族啟動(dòng)子順式作用元件分布Fig.6 Distribution of cis-acting elements in the promoters of the TCP gene family of Chinese kale

2.8 芥藍(lán)TCP基因家族編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)互作預(yù)測(cè)分析

利用String 11.5在線軟件對(duì)芥藍(lán)

TCP

基因編碼蛋白之間以及與其他蛋白之間進(jìn)行蛋白互作預(yù)測(cè)(圖7)。聚類結(jié)果顯示，除BoTCP25和BoTCP26蛋白外，剩余38個(gè)芥藍(lán)TCP蛋白之間均可以發(fā)生不同程度的相互作用。BoTCP蛋白既可以與自身成員之間發(fā)生互作，也可以和其他蛋白之間發(fā)生互作。BoTCP蛋白與其他蛋白存在互作關(guān)系并形成3個(gè)分支，第1支(紅色區(qū)域)與ARF4和Rab發(fā)生互作，主要與生長(zhǎng)素合成運(yùn)輸和細(xì)胞增殖功能相關(guān)；第2支(綠色區(qū)域)與Cpn60、P450、Methyltyansf和Prenyltrans等存在互作，這些蛋白依次與葉綠體分子伴侶蛋白、植物細(xì)胞色素、甲基化作用和異戊烯酶合成等功能相關(guān)；第3支(青色區(qū)域)與CCT、PDB、PPR-4和DUF1313發(fā)生互作，這些蛋白依次與光周期響應(yīng)、過氧化物酶、胚胎發(fā)育和未知結(jié)構(gòu)域蛋白功能相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)尤其在青色區(qū)域和綠色區(qū)域中，TCP蛋白之間和其他多種蛋白之間發(fā)生互作的關(guān)系最強(qiáng)，預(yù)測(cè)與TCP蛋白互作關(guān)系較強(qiáng)的蛋白可能與TCP具有功能相關(guān)性。

K均值聚類下分為3支：第1支(紅色區(qū)域)、第2支(綠色區(qū)域)和第3支(青色區(qū)域)。K-means clustering is divided into three branches: the first branch (red area)， the second branch (green area) and the third branch (cyan area).圖7 芥藍(lán)TCP基因家族編碼蛋白網(wǎng)絡(luò)互作預(yù)測(cè)Fig.7 Interacting protein prediction of TCP gene family in Chinese kale

2.9 TCP家族基因在芥藍(lán)不同光質(zhì)處理下和不同時(shí)期種子種莢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

結(jié)合芥藍(lán)在紅藍(lán)光質(zhì)處理下以及處于魚雷形胚時(shí)期和子葉形胚早期種子種莢的FPKM值，生成聚類熱圖(圖8(a)和(b))分析

BoTCP

家族基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示其表達(dá)模式可分為六類：第一類在紅藍(lán)光處理下和子葉形胚的種子表達(dá)量較高(

BoTCP4

和

BoTCP16

)；第二類在紅藍(lán)光處理下和子葉形胚的種莢表達(dá)量較高(

BoTCP5

和

BoTCP13

)；第三類在紅光處理下表達(dá)量較高(

BoTCP14

)；第四類在紅藍(lán)光處理下表達(dá)量較高(

BoTCP18

和

BoTCP21

)；第五類除了在魚雷形胚的種子中表達(dá)量較低，其他階段都有較高表達(dá)量(

BoTCP25

和

BoTCP36

)；第六類中

BoTCP40

在每個(gè)階段都有較高的表達(dá)量?？傮w而言，

TCP

家族成員在芥藍(lán)不同表達(dá)模式中存在協(xié)同作用，推測(cè)其可能存在功能冗余和分化。

(a)中B為藍(lán)光處理，R為紅光處理；(b)中PC和SC為魚雷形胚種子種莢，PD和SD為子葉形胚種子種莢。In figure (a), B is blue light processing and R is red light processing; In Figure (b), PC and SC are torpedo-shaped embryo seed pods, PD and SD are cotyledon embryo seed pods.圖8 BoTCP家族成員在芥藍(lán)不同光質(zhì)處理(a)和不同時(shí)期種子種莢(b)下表達(dá)量熱圖Fig.8 BoTCP family members expressed caloric maps under different light quality treatments (a) and seed pods (b) at different times in Chinese kale

2.10 TCP家族基因在芥藍(lán)不同時(shí)期不同組織部位的qRT-PCR分析

為了進(jìn)一步了解

TCP

家族基因在芥藍(lán)不同時(shí)期不同組織部位的表達(dá)模式，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下的熱圖分析，

BoTCP

家族差異基因有6種表達(dá)模式。每種模式下各選擇1個(gè)成員，結(jié)合PCR表達(dá)量驗(yàn)證，最終選取

BoTCP5

、

BoTCP14

、

BoTCP16

、

BoTCP21

、

BoTCP25

和

BoTCP40

基因，以‘香菇’芥藍(lán)在不同時(shí)期不同組織部位(Ⅰ時(shí)期的根、真葉、花莖和薹葉及Ⅱ時(shí)期的根、真葉、花莖、薹葉、種子和種莢)為試驗(yàn)對(duì)象，利用qRT-PCR檢測(cè)以上6個(gè)成員的相對(duì)表達(dá)量(圖9)。結(jié)果顯示，

BoTCP5

、

BoTCP21

、

BoTCP25

和

BoTCP40

在種子中高表達(dá)，尤其是

BoTCP21

，其在種子中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他成員，這和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達(dá)量趨勢(shì)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。其中

BoTCP5

在種莢和花莖也具有較高的表達(dá)量，

BoTCP21

和

BoTCP25

還在真葉和薹葉中具有較高的表達(dá)量，而

BoTCP40

還在薹葉中高表達(dá),

BoTCP14

在開花結(jié)莢的植株根部表達(dá)量較高,而

BoTCP16

則在抽薹植株的根部表達(dá)量最高。以上結(jié)果表明，芥藍(lán)中的

TCP

廣泛參與了植株的形態(tài)建成和器官發(fā)育且不同

BoTCP

家族成員在表達(dá)模式上存在時(shí)空特異性。

圖內(nèi)不同小寫字母代表顯著差異(P≤0.05)。Different lowercase letters in the graph represent significant differences (P≤0.05).圖9 TCP家族成員在‘香菇’芥藍(lán)不同時(shí)期不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression of TCP family members in different tissues of ‘Xiang Gu’ Chinese kale in different periods

3 討論與結(jié)論

TCP

基因家族有重要且廣泛的調(diào)控作用，其蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。目前，

TCP

基因家族已經(jīng)陸續(xù)在馬鈴薯、高粱、菠蘿和玉米中分別被鑒定出43、27、9和43個(gè)成員。本研究通過序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析，從甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出40個(gè)

BoTCP

基因。相比模式作物擬南芥，甘藍(lán)類蕓薹屬作物經(jīng)歷了全基因組三倍化復(fù)制事件，通過種內(nèi)和種間共線性發(fā)現(xiàn)，芥藍(lán)與擬南芥的同源共線性基因?qū)?shù)不太吻合三倍體復(fù)制化進(jìn)程，表明甘藍(lán)蕓薹屬作物在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過程中發(fā)生過基因丟失。然而由于芥藍(lán)

TCP

成員存在串聯(lián)重復(fù)和片段復(fù)制現(xiàn)象，總體上

BoTCP

基因家族發(fā)生了基因擴(kuò)張現(xiàn)象，這也表明

BoTCP

基因家族有著更加精細(xì)的功能。前人研究發(fā)現(xiàn)，在模式植物擬南芥中

TCP

家族成員廣泛調(diào)節(jié)葉片發(fā)育和種子的形態(tài)建成。金魚草

CIN

基因突變導(dǎo)致葉邊緣形態(tài)發(fā)生改變，同時(shí)對(duì)葉子大小也有重要的調(diào)控作用。

AtTCP24

、

AtABAP1

和

AtORC1

通過形成復(fù)合物抑制葉片發(fā)育過程中DNA的復(fù)制；

AtTCP4

直接激活

HD

-

ZIP

轉(zhuǎn)錄因子

HAT2

的表達(dá)，以調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)，使葉片細(xì)胞分裂結(jié)束從而導(dǎo)致葉片減小。除了

CIN

類成員，ClassⅠ基因也參與調(diào)控葉的發(fā)育，

AtTCP9

和

AtTCP20

突變導(dǎo)致葉片發(fā)育早期表面細(xì)胞增大，

AtTCP14

不僅影響葉邊緣細(xì)胞增殖，還參與調(diào)控種子的胚胎發(fā)育。芥藍(lán)與擬南芥同屬十字花科，二者在葉片和種子等部位生長(zhǎng)發(fā)育上存在一定的相似及差異性。生物信息學(xué)分析顯示

BoTCP5

與

AtTCP14

基因同源聚類，本研究通過qRT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

BoTCP

5在種子中高表達(dá)，這與前人的研究一致。

AtTCP23

參與植物開花節(jié)律和植物發(fā)育，但在此次的芥藍(lán)研究中未能充分體現(xiàn)相關(guān)成員具有與之相似的功能，可能是只在其同源基因

BoTCP32

上及芥藍(lán)不同品種間特異性表達(dá)。關(guān)于不同物種間

TCP

成員參與根部位調(diào)控研究的文獻(xiàn)未見報(bào)道，在本研究中，

BoTCP14

在‘香菇’Ⅱ時(shí)期的根中高表達(dá)，

BoTCP16

在‘香菇’Ⅰ時(shí)期的根中特異性表達(dá)且表達(dá)量相對(duì)較高，是否這2個(gè)成員與根部形態(tài)建成密切相關(guān)，有待后期進(jìn)一步研究。除了

TCP

家族外，

NGA

、

SPL

、

GRF

和

ARF

等家族也在不同時(shí)期以直接或者間接的方式調(diào)控葉片的發(fā)育，這可能很大程度上導(dǎo)致其功能的冗余，進(jìn)而導(dǎo)致基因表達(dá)存在時(shí)空特異性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，擬南芥

AtTCP3

能夠結(jié)合

AtNGA3

啟動(dòng)子中的1個(gè)保守區(qū)域，通過激活

NGA3

啟動(dòng)子來調(diào)控其合成表達(dá)，進(jìn)而影響葉片的形態(tài)發(fā)育。本研究生物信息學(xué)分析表明

BoTCP25

與

AtTCP3

基因同源聚類，是否

BoTCP25

與

BoNGA3

存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。葉片發(fā)育來源于莖頂端分生組織(Shoot apical meristem，SAM)，莖尖分生組織外周特定區(qū)域形成細(xì)胞突起，隨后發(fā)育形成葉原基，葉原基經(jīng)生長(zhǎng)和分化發(fā)育最終形成成熟葉片。生長(zhǎng)素(Auxin)促進(jìn)葉原基分化形成小葉，高濃度生長(zhǎng)素在SAM中的積累部位是葉原基起始的位置，與此相似，生長(zhǎng)素高濃度點(diǎn)也是葉緣缺刻和小葉發(fā)生的部位。

ARF

家族是1類與生長(zhǎng)素合成密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族，

AtARF4

通過與

AtARF5

和

IAA12

的協(xié)同作用調(diào)節(jié)不定芽再生，同時(shí)與AtTCP10蛋白也存在一定的協(xié)同作用。本研究進(jìn)化樹聚類分析表明

BoTCP21

與

AtTCP10

基因同源聚類且蛋白網(wǎng)絡(luò)互作預(yù)測(cè)

BoTCP21

與

BoARF4

存在潛在的互作關(guān)系，是否二者間存在互作后期有待試驗(yàn)佐證。綜上，本研究基于生物信息學(xué)、RNA-seq下的FPKM值和qRT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

BoTCP

家族成員在‘香菇’芥藍(lán)不同時(shí)期不同組織部位表達(dá)存在一定的時(shí)空特異性，推測(cè)其在植物生長(zhǎng)的不同階段行使不同的生物學(xué)功能。本研究表明

CIN

類

BoTCP

與葉片發(fā)育密切相關(guān)，而葉片作為十字花科蕓薹屬植物重要的組成部位和食用器官，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及現(xiàn)代化的生產(chǎn)至關(guān)重要，這為后期深入挖掘

BoTCP

相關(guān)基因在芥藍(lán)葉片發(fā)育中的分子功能研究和調(diào)控利用提供理論依據(jù)。