劉 斌 王立忠 吳鐵成，2 馬躍軍,3 趙若陽(yáng) 高玉林 閆新剛 李玉榮*

(1．內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，畜牧研究所，呼和浩特 010031；2.肉羊遺傳資源評(píng)價(jià)與繁育技術(shù)內(nèi)蒙古自治區(qū)工程實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010031；3．阿拉善白絨山羊種羊場(chǎng)，內(nèi)蒙古 阿拉善 750336；4.鄂爾多斯市立新實(shí)業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

絨山羊是重要的絨用經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其絨毛生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的季節(jié)性，但不同品種之間有很大的差異，大多數(shù)絨山羊在非長(zhǎng)絨期(5～7月)不長(zhǎng)絨，次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育分為休止期(3～4月)、興盛前期(5～7月)、興盛期(8～12月)和退行期(1～2月)等4個(gè)階段，而有少數(shù)絨山羊可以常年長(zhǎng)絨(6月開(kāi)始長(zhǎng)絨)。內(nèi)蒙古白絨山羊是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選育而形成的絨肉兼用型地方良種，分為巴彥淖爾市的二狼山型、鄂爾多斯市的阿爾巴斯型和阿拉善盟的阿拉善型三個(gè)類群，具有季節(jié)性長(zhǎng)絨，羊絨細(xì)，纖維長(zhǎng)，光澤好，絨毛手感柔軟，綜合品質(zhì)優(yōu)良的特性。鄂爾多斯市伊金霍洛旗蘇布爾嘎培育的敏蓋絨山羊(未經(jīng)品種命名)，全舍飼養(yǎng)殖，具有常年長(zhǎng)絨、產(chǎn)絨量高等特點(diǎn)，成為當(dāng)?shù)啬撩裰饕酿B(yǎng)殖家畜。2016年“敏蓋”商標(biāo)被認(rèn)定為鄂爾多斯市知名商標(biāo)，2019年被國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局認(rèn)定為馳名商標(biāo)，因此暫命名為“敏蓋絨山羊”。絨山羊絨毛生長(zhǎng)受遺傳、營(yíng)養(yǎng)和光照、溫度等環(huán)境因素的影響，但遺傳占主要影響因素，從基因調(diào)控的方向研究皮膚毛囊生長(zhǎng)發(fā)育顯得尤為重要。miRNA是真核生物中存在的小分子非編碼RNA家族，具有抑制靶向mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯或者能夠剪切靶向mRNA并促進(jìn)其降解的功能。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究報(bào)道m(xù)iRNA在毛囊形態(tài)發(fā)生、毛囊干細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的穩(wěn)態(tài)平衡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Yuan等發(fā)現(xiàn)陜北絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊不同時(shí)期的皮膚毛囊miRNA表達(dá)存在特異性。Yuan等發(fā)現(xiàn)miR-22可以促進(jìn)毛囊退化，維持毛囊處于靜止期。馬濤發(fā)現(xiàn)miRNA-203在絨山羊毛囊發(fā)育的生長(zhǎng)期和休止期均有表達(dá)，且在休止期的表達(dá)量顯著高于生長(zhǎng)期，其候選靶基因的表達(dá)則相反。吳志紅通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot研究表明在胎兒皮膚成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中，chi-miR-130b-3p、chi-miR-301a-3p 和 chi-miR-532-3p 在mRNA和蛋白水平上均可不同程度的調(diào)控WNT10A的表達(dá)。chi-miR-107-3p是一類小分子RNA，Wu等通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在薩能奶山羊睪丸組織中發(fā)現(xiàn)。Li等研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用納米載體(TLN)可使chi-miR-107-3p缺失，dicer表達(dá)上調(diào)，從而加速角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)皮膚傷口的愈合。盡管有眾多的miRNA參與絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)過(guò)程，但鮮少有chi-miR-107-3p在不同品系間絨山羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的比較研究。本研究基于課題組前期對(duì)阿爾巴斯型絨山羊光控增絨處理組和對(duì)照組皮膚毛囊樣品進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果(相關(guān)數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，篩選到chi-miR-107-3p及其相關(guān)基因

ADCK5

、

DSBC1

、

ARSA

、

FMAP4

、

RHBDF2

和

ALDH3A2

，可能與絨山羊皮膚毛囊的周期性生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。因此，以絨毛生長(zhǎng)周期差異顯著的阿拉善型白絨山羊和敏蓋絨山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，應(yīng)用組織切片技術(shù)對(duì)不同品系絨山羊處于不同生長(zhǎng)周期毛囊結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，并通過(guò)qPCR方法對(duì)chi-miR-107-3p和相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行探究，旨在為絨毛生長(zhǎng)周期變化分子基礎(chǔ)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取內(nèi)蒙古阿拉善白絨山羊種羊場(chǎng)和鄂爾多斯敏蓋絨山羊羊場(chǎng)體重相近的2歲絨山羊母羊各3只，分別在1、4、7和9月采集體側(cè)部位直徑1 cm的皮膚2份，一份用4%多聚甲醛固定進(jìn)行組織切片制作，另一份快速保存于液氮罐中，用于qRT-PCR檢測(cè)。采樣前在取樣區(qū)域周?chē)は伦⑸?%利多卡因進(jìn)行局部麻醉，采樣過(guò)程符合動(dòng)物福利要求。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

主要試劑：伊紅染液、蘇木素染液等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛、石蠟、TRIZOL、Tris堿、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、AL 2000、瓊脂糖、RNase-Free dd HO、氯仿、75%冰乙醇、2×Phanta Max Master Mix、1×TAE緩沖液；PrimeScript(TM) RT Master Mix (Perfect Real Time)、TB Green(TM) Premix Ex Taq(TM) II (RNaseH Plus)、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis和TB Green qRT-PCR User Manual等反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒等購(gòu)自TaKaRa。

主要儀器設(shè)備：LEICA RM2016切片機(jī)、梯度PCR儀(Eppendorf,德國(guó))、熒光定量PCR儀(CFX 96 Bio-Rad,美國(guó))、正倒置一體熒光顯微鏡。

1.3 試驗(yàn)方法

1

.

3

.

1

皮膚組織HE染色

將皮膚樣品在4%多聚甲醛中固定24 h后取出，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成7 μm的薄片，用常規(guī)HE染色方法染色，中性樹(shù)脂封片，干燥后觀察。由于皮膚在脫水透明過(guò)程中會(huì)發(fā)生收縮現(xiàn)象，因此在研究皮膚毛囊形態(tài)時(shí)需對(duì)皮膚收縮率進(jìn)行校正。

皮膚收縮率=脫水透明后皮膚面積/
活體樣皮膚面積×100%

表皮厚：真皮層到皮膚表面的垂直距離，μm；

真皮厚：皮下脂肪組織到表皮層的垂直距離，μm；

初、次級(jí)毛球?qū)挘河蔑@微鏡微測(cè)尺選擇不同視野10個(gè)完整的初、次級(jí)毛囊，測(cè)量其毛球的寬度，μm；

初、次級(jí)毛囊深：初、次級(jí)毛囊到表皮層的垂直距離，μm；

初、次級(jí)毛囊密度：利用顯微鏡微測(cè)尺選擇視野內(nèi)10個(gè)完整初、次級(jí)毛囊個(gè)數(shù)，再進(jìn)行換算為個(gè)/mm。

1

.

3

.

2

實(shí)時(shí)熒光定量法1.3.2.1 引物設(shè)計(jì) chi-miR-107-3p序列為AGCAGCAUUGUACAGGGCUAU，

U6

作為內(nèi)參基因。使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)

RHBDF2

、

ADCK5

、

ARSA

、

ALDH3A2

、

DSBC1

和

FMAP4

基因熒光定量引物，選取

GAPDH

為內(nèi)參基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd.)合成(表1)。

表1 引物信息
Table 1 Primer information

基因名稱Gene name登錄號(hào)Login number引物序列(5'→3')Primer sequence (5'→3')片段大小/bpProduct length退火溫度/℃Annealingtemperaturechi-miR-107-3pNC_030833.1AGCAGCATTGTACAGGGCTAT10656 ℃RHBDF2XM_018063741.1F: GTCCCAGAGCATCCGCAAGTR: TCCACGCCTCCCACAGAA13158 ℃ADCK5XM_018058741.1F: CGCTCCTCTTCCCTCCTTR: CCACCCATTCTGGCAACT14864 ℃ARSAXM_005701596.3F: AGAGCTTTCCAGGGCACTCAR: CATCGTCTCAGGTCCGTTGT15562 ℃ALDH3A2XM_018064739.1F: ATTTACTCCAGCCTGCCTACR: CAGCCAAGTGTCACCTCA12662 ℃DSBC1XM_005676701.3F: GCAGGCTCTGACCGAATCR: CTGGGCTGGTGACAAGGA8858 ℃FMAP4XM_018064747.1F: TCCACCTTTGACCGAGACCR: GTTGATGCCATTGGCGTAG14758 ℃U6NM_001161346.2F: GGAACGATACAGAGAAGATTAGCR: TGGAACGCTTCACGAATTTGCG6862 ℃GAPDHXM_005680968.3F: CCACGAGAAGTATAACAACACCR: GTCATAAGTCCCTCCACGAT12060 ℃

1.3.2.2 總RNA提取及cDNA合成 用液氮將皮膚樣品研磨后，使用TRIZOL提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)總RNA濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳和A/A檢測(cè)RNA質(zhì)量，保存于-80 ℃冰箱中備用。采用PrimeScript(TM) RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA(mRNA)，采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis and TB Green qRT-PCR User Manual試劑盒合成cDNA(miRNA)，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>1.3.2.3 qRT-PCR檢測(cè) 利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以

GAPDH

基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)mRNA進(jìn)行熒光定量；以

U

6為內(nèi)參，對(duì)chi-miR-107-3p進(jìn)行熒光定量。反應(yīng)體系為T(mén)B Green(TM) Premix Ex Taq(TM) II (RNaseH Plus) 10 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free ddHO 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2 min，(95 ℃ 變性10 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸 20 s)40個(gè)循環(huán)后進(jìn)入溶解曲線，55 ℃到95 ℃，每0.6 s上升0.5 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用2值法對(duì)chi-miR-107-3p及mRNA的表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。運(yùn)用SPSS 20.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，使用雙變量Pearson進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以

P

<0.05為差異顯著，

P

<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品系絨山羊皮膚毛囊組織顯微結(jié)構(gòu)分析

校準(zhǔn)并測(cè)量皮膚收縮率發(fā)現(xiàn)，2個(gè)品系絨山羊皮膚收縮率均約為65%。皮膚毛囊組織顯微結(jié)構(gòu)觀察分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)品系毛囊群結(jié)構(gòu)均以三元型為主(3個(gè)初級(jí)毛囊和若干個(gè)次級(jí)毛囊)，可見(jiàn)少量的二元型和四元型。在退行期，次級(jí)毛囊細(xì)胞核增大，開(kāi)始死亡，同時(shí)有部分細(xì)胞開(kāi)始向外擴(kuò)散，呈現(xiàn)刷狀分布，細(xì)胞破碎，逐漸成為一點(diǎn)甚至消失，毛囊群之間的結(jié)締組織較薄，連接不緊密(圖1(a)和(b)，圖2(a)和(b))；在休止期，次級(jí)毛囊基本退化，極少看到具有紅色內(nèi)跟鞘的毛囊，毛乳頭完全消失，次級(jí)毛囊密度達(dá)到最低，毛囊群結(jié)構(gòu)之間的結(jié)締組織變薄，次級(jí)毛囊排布散亂，大小不一，多成散狀分布(圖1(c)和(d)，圖2(c)和(d))；興盛前期，級(jí)毛囊再次重建，初級(jí)毛囊周?chē)霈F(xiàn)多個(gè)小毛囊，同時(shí)也有幾個(gè)小毛囊緊密相靠，這說(shuō)明有新的毛囊產(chǎn)生。如圖1(e)、圖2(g)、圖2(e)和圖2(g)，具有常年長(zhǎng)絨特點(diǎn)的敏蓋絨山羊次級(jí)毛囊重建均已基本完成，初、次級(jí)毛囊均呈橢圓形，排列緊密、整齊。而阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊正處于重建階段，次級(jí)毛囊分布雜亂，仍有部分新生毛囊出現(xiàn)；在興盛期，次級(jí)毛囊重建完成，此時(shí)次級(jí)毛囊密度最大，具有紅色內(nèi)跟鞘的毛囊也最多，次級(jí)毛囊排布整齊，毛囊群之間的結(jié)締組織連接緊密，結(jié)構(gòu)明顯。如圖1(f)、圖2(h)、圖2(f)和2(h)。結(jié)合表2可見(jiàn)，2個(gè)品系絨山羊初級(jí)毛囊密度在整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)幾乎沒(méi)有變化，而次級(jí)毛囊密度變化顯著。皮膚毛囊興盛前期，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊密度極顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)，次級(jí)毛囊深、初級(jí)毛球?qū)?、次?jí)毛球?qū)捄蚐/P值(次級(jí)毛囊數(shù)/初級(jí)毛囊數(shù))等性狀均顯著小于敏蓋絨山羊(光控增絨)(

P

<0.05)。在皮膚毛囊興盛期，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊密度、次級(jí)毛囊深和次級(jí)毛球?qū)掞@著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)。表明兩種品系的絨山羊初級(jí)、次級(jí)毛囊在形態(tài)特征上基本一致，但在同一時(shí)期的生長(zhǎng)規(guī)律不同。

表2 不同品系內(nèi)蒙古絨山羊皮膚毛囊組織結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析
Table 2 Statistical analysis of transverse skin and hair follicle tissue structure of different strains of Inner Mongolia cashmere goats

性狀Character月份Month阿拉善型絨山羊Alashan cashmere goats敏蓋絨山羊Mingai cashmere goats1月26.29±0.18 a27.13±1.90 a表皮厚度/μmDepth of secondary follicle4月20.24±1.58 a21.31±0.64 a7月27.51±3.48 a34.19±3.72 a9月32.36±1.64 a34.16±1.43 a1月1 015.94±14.34 a1 100.04±9.56 a真皮厚度/μmThickness of dermis4月1 012.42±61.44 a976.52±37.76 a7月1 091.89±19.50 a1 126.77±37.63 a9月1 093.35±10.38 a1 192.60±10.75 a1月2 015.54±20.19 a2 041.60±42.67 a初級(jí)毛囊深度/μmDepth of primary follicle4月1 707.83±24.75 a1 733.48±25.48 a7月2 073.33±7.51 Bc2 281.1±49.29 ABb9月2 394.65±34.89 a2 488.45±65.85 a1月1 162.54±16.75 a1 151.79±5.64 a次級(jí)毛囊深度/μmDepth of secondary follicle4月1 008.70±20.52 a1 070.24±2 977 a7月1 155.50±31.09 b1 276.27±19.01 a9月1290.91±29.86 b1 456.91±76.32 a1月224.44±7.85 a252.48±8.38 a初級(jí)毛球直徑/μmDiameter of primary hair bulb4月157.77±6.40 a181.36±13.77 a7月239.30±19.64 b305.57±7.59 a9月317.54±8.07 a313.70±10.74 a1月96.14±1.40 a101.71±3.37 a次級(jí)毛球直徑/μmDiameter of secondary hair bulb4月84.53±2.93 a91.53±9.70 a7月84.30±0.91 b112.56±5.31 a9月101.92±3.30 b118.73±5.69 a1月2.91±0.79 a2.63±0.76 a初級(jí)毛囊密度/(個(gè)/mm2)Density of primary follicle4月2.45±0.61 a2.54±0.57 a7月2.99±0.71 a2.90±0.54 a9月2.99±0.75 a3.00±0.75 a1月26.27±2.13 a27.18±3.36 a次級(jí)毛囊密度/(個(gè)/mm2)Density of secondary follicle4月22.54±3.11 a23.09±3.59 a7月28.36±2.29 A35.63±2.98 B9月39.09±4.04 a43.91±3.86 b1月9.61±2.40 a10.83±2.14 a初級(jí)毛囊數(shù)/次級(jí)毛囊數(shù)S/P4月9.49±1.67 a9.37±1.95 a7月10.41±2.72 a12.54±1.67 b9月13.85±2.64 a15.20±2.30 a

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(<0.05)；肩標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(>0.05)。
Note: In the same line, values with different small letters superscripts mean significant difference (<0.05); Different capital letters superscripts mean extremely significant difference (<0.01); While the same letter superscripts mean no significant difference (>0.05).

(a)、(c)、(e)、(g)分別是阿拉善型絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；(b)、(d)、(f)、(h)分別是敏蓋絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；▲初級(jí)毛囊；★次級(jí)毛囊。比例尺為100 μm。(a), (c), (e) and (g) were transverse sections of the skin follicles of Alxa cashmere goats in anagen, resting stage， prosperous and regression stage respectively; (b), (d), (f) and (h) were transverse sections of the skin follicles of Mingai cashmere goats in anagen, resting stage, prosperous and regression stage respectively; ▲ Primary hair follicle; ★ Secondary hair follicle. Bar is 100 μm.圖1 不同品系絨山羊皮膚毛囊橫切切片F(xiàn)ig.1 Transverse skin sections of different strains on cashmere goats

(a)、(c)、(e)、(g) 分別是阿拉善型絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；(b)、(d)、(f)、(h) 分別是敏蓋絨山羊皮膚毛囊退行期、休止期、興盛前期、興盛期橫切切片；▲初級(jí)毛囊；★次級(jí)毛囊。比例尺為100 μm。(a), (c), (e) and (g) were localisation sections of the skin follicles of Alxa cashmere goats in anagen, resting stage, prosperous and regression stage respectively; (b), (d), (f) and (h) were localisation sections of the skin follicles of Mingai cashmere goats in anagen, resting stage, prosperous and regression stage respectively; ▲ Primary hair follicle; ★ Secondary hair follicle. Bar is 100 μm.圖2 不同品系絨山羊皮膚毛囊縱切切片F(xiàn)ig.2 Localisation skin sections of different strains on cashmere goat

2.2 不同品系絨山羊皮膚組織chi-miR-107-3p相關(guān)基因在不同毛囊周期的表達(dá)分析

2

.

2

.

1

不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p的表達(dá)分析由圖3(a)可見(jiàn)，阿拉善型絨山羊皮膚毛囊興盛前期chi-miR-107-3p達(dá)量極顯著高于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。對(duì)同一品種不同時(shí)期chi-miR-107-3p的表達(dá)量進(jìn)行分析，由圖3(b)可見(jiàn)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中，chi-miR-107-3p表達(dá)量在興盛前期極顯著大于興盛期(

P

<0.01)，且顯著大于退行期和休止期(

P

<0.05)。敏蓋絨山羊皮膚組織中，chi-miR-107-3p的表達(dá)量在休止期最高，且顯著大于其他3個(gè)時(shí)期(

P

<0.05)。因此說(shuō)明，不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p的表達(dá)規(guī)律不同。

ALS：阿拉善型絨山羊; MG：敏蓋絨山羊; January:絨山羊皮膚毛囊退行期; April:絨山羊皮膚毛囊休止期; July: 絨山羊皮膚毛囊興盛前期；September：絨山羊皮膚毛囊興盛期。圖3a為相同時(shí)期不同品系之間的比較，圖3b為相同品系不同時(shí)期的比較，組間比較肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；下同。ALS: Alxa cashmere goat; MG: Mingai cashmere goat; January: the skin follicles of Alxa cashmere goats in anagen; April: the skin follicles of Alxa cashmere goats in resting stage; July: the skin follicles of Alxa cashmere goats in prosperous; September: the skin follicles of Alxa cashmere goats in regression stage respectively. Different small letters superscripts mean significant difference (P<0.05); Different capital letters superscripts mean extremely significant difference (P<0.01); While the same letter superscripts mean no significant difference (P<0.05); The same as below.圖3 不同品系絨山羊皮膚毛囊不同生長(zhǎng)時(shí)期chi-miR-107-3p相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of chi-miR-107-3p in skin and hair follicles of different strains Cashmere goats

2

.

2

.

2

不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p相關(guān)基因在不同毛囊周期的表達(dá)量分析對(duì)不同品系絨山羊皮膚毛囊不同發(fā)育時(shí)期皮膚組織中

ADCK

、

DSBC1

、

RHBDF2

、

ALDH3A2

、

ARSA

和

FMAP4

基因的表達(dá)量進(jìn)行差異性分析(圖4)。結(jié)果顯示，在休止期(4月)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

ADCK

5基因的表達(dá)量極顯著大于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。興盛前期(7月)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

RHBDF2

基因極顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。興盛期(9月)，阿拉善型絨山羊和敏蓋絨山羊皮膚組織中

ADCK5

、

DSBC1

、

RHBDF2

、

ALDH3A2

、

ARSA

和

FMAP4

基因的表達(dá)量差異不顯著(

P

>0.05)。退行期(1月)，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

DSBC1

基因的表達(dá)量極顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。在整個(gè)皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育周期中，

RHBDF2

基因的表達(dá)量在興盛前期到興盛期的過(guò)程中逐漸升高，在興盛期達(dá)到最高，之后逐漸降低，到達(dá)退行期，其表達(dá)量最低；

ALDH3A2

基因的表達(dá)量在休止期最高，隨著皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)量逐漸降低，到達(dá)興盛期，其表達(dá)量最低，到休止期表達(dá)量逐漸升高。由此可見(jiàn),不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p相關(guān)基因在同一毛囊發(fā)育階段表達(dá)量不一致。

圖4 不同品系絨山羊皮膚毛囊不同生長(zhǎng)時(shí)期mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of mRNA in skin and hair follicles of different breeds(strains) Cashmere goats

2

.

2

.

3

chi-miR-107-3p及其相關(guān)基因和皮膚及毛囊性狀間的相關(guān)性分析對(duì)chi-miR-107-3p以及6個(gè)基因和兩品系絨山羊皮膚毛囊性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析(表3)，chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因與皮膚毛囊初級(jí)毛囊密度和真皮厚顯著相關(guān)(

P

<0.05)，與次級(jí)毛囊密度、S/P、表皮厚、初次級(jí)毛囊深及初次級(jí)毛球?qū)捑鶚O顯著相關(guān)(

P

<0.01)；

ALDH3A2

基因與初級(jí)毛囊密度、真皮厚和次級(jí)毛球?qū)掞@著相關(guān)(

P

<0.05)，與次級(jí)毛囊密度、S/P、表皮厚、初次級(jí)毛囊深及初級(jí)毛球?qū)捑鶚O顯著相關(guān)(

P

<0.01)；

DSBC1

基因僅與初級(jí)毛囊密度顯著相關(guān)(

P

<0.05)，其他基因與皮膚毛囊性狀均未表現(xiàn)相關(guān)性。表明差異表達(dá)的chi-miR-107-3p及其相關(guān)基因并不完全與皮膚毛囊性狀相關(guān)。

表3 chi-miR-107-3p和相關(guān)基因與絨毛性狀的關(guān)聯(lián)分析
Table 3 The association analysis of chi-miR-107-3p and mRNA with fleece traits

性狀Characterchi-miR-107-3pADCK5DSBC1RHBDF2ALDH3A2ARSAFMAP4初級(jí)毛囊密度Density of primary follicle0.0390.9550.0120.0380.0100.0870.606次級(jí)毛囊密度Density of secondary follicle0.0010.7480.0840.0010.0050.2140.848初級(jí)毛囊數(shù)/次級(jí)毛囊數(shù)S/P0.0010.6900.1640.0010.0060.2630.994真皮厚度Thickness of dermis0.0110.7350.5610.0110.0450.1290.891表皮厚度Thickness of epidermis0.0030.5110.1290.0030.0090.1490.930初級(jí)毛囊深度Depth of primary follicle0.0010.5880.2120.0010.0020.046*0.941次級(jí)毛囊深度Depth of secondary follicle0.0010.2560.1080.0010.0030.2260.756初級(jí)毛球直徑Diameter of primary hair bulb0.0010.2680.1900.0010.0040.1690.926次級(jí)毛球直徑Diameter of secondary hair bulb0.0010.2090.4550.0010.0100.1570.581

注：表中數(shù)據(jù)表示相關(guān)性值。
Note: The data in the table represent correlation values.

3 討 論

3.1 不同品系絨山羊皮膚組織不同毛囊發(fā)育時(shí)期的形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

產(chǎn)絨量是絨山羊最主要的經(jīng)濟(jì)性狀，次級(jí)毛囊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和興盛期的長(zhǎng)短很大程度上影響產(chǎn)絨量絨毛品質(zhì)，其中遺傳力較高的3個(gè)性狀分別是毛囊深度、毛囊密度以及S/P值，且均與產(chǎn)絨量相關(guān)。對(duì)絨山羊皮膚組織顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)初級(jí)毛囊密度雖然伴隨著毛囊的退化、更新有一定幅度的變化，但是其毛囊密度在各生長(zhǎng)階段基本不發(fā)生變化。李長(zhǎng)青等在對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊與遼寧絨山羊皮膚毛囊生長(zhǎng)規(guī)律的研究中也得到相同的結(jié)論。由表2可見(jiàn)，阿拉善型絨山羊皮膚毛囊S/P值在興盛前期顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，S/P值越大，說(shuō)明皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育越完善。范一星在不同毛被類型內(nèi)蒙古絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)及相關(guān)分子機(jī)理研究中指出，活性S/P值較大時(shí)，表明次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育更完善，與本研究結(jié)構(gòu)相似。由于敏蓋絨山羊?qū)儆诔Ｄ觊L(zhǎng)絨型絨山羊，次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育較早，皮膚毛囊興盛前期大部分毛干已經(jīng)長(zhǎng)出體表，次級(jí)毛囊毛球結(jié)構(gòu)完整，而阿拉善型絨山羊此時(shí)期次級(jí)毛囊正處于重建過(guò)程當(dāng)中，大部分毛囊發(fā)育仍不完整。在皮膚毛囊興盛期，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊密度顯著低于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊深顯著小于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，且次級(jí)毛球?qū)掞@著小于敏蓋絨山羊(

P

<0.05)，原因是阿拉善型絨山羊?qū)儆诩竟?jié)性長(zhǎng)絨絨山羊，次級(jí)毛囊進(jìn)入興盛期較遲。趙艷麗等對(duì)遼寧絨山羊常年長(zhǎng)絨型和季節(jié)性長(zhǎng)絨型絨山羊皮膚毛囊組織結(jié)構(gòu)研究指出，由興盛前期轉(zhuǎn)入興盛期的過(guò)程中，常年型次級(jí)毛囊深、次級(jí)毛球?qū)捑@著大于季節(jié)型，這與本研究一致。

3.2 不同品系絨山羊皮膚組織中chi-miR-107-3p在不同毛囊發(fā)育時(shí)期的的表達(dá)分析

miRNA是最新發(fā)現(xiàn)在絨山羊皮膚毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用的一類小分子非編碼RNA，何玉龍等對(duì)不同發(fā)育階段小尾寒羊皮膚毛囊特異性miRNA鑒定分析，為從miRNA層面進(jìn)一步挖掘改良羊毛品質(zhì)及產(chǎn)量相關(guān)功能基因方面提供數(shù)據(jù)支撐與研究思路。本研究發(fā)現(xiàn)，皮膚毛囊興盛前期，chi-miR-107-3p在阿拉善型絨山羊皮膚組織中的表達(dá)量極顯著高于敏蓋絨山羊(

P

<0.01)。同時(shí)結(jié)合皮膚組織顯微結(jié)構(gòu)分析，阿拉善型絨山羊次級(jí)毛囊正處于重建階段，而敏蓋絨山羊次級(jí)毛囊已經(jīng)重建完成。這說(shuō)明在皮膚組織中高表達(dá)的chi-miR-107-3p抑制次級(jí)毛囊生長(zhǎng)發(fā)育。在興盛期，chi-miR-107-3p在2個(gè)品系絨山羊皮膚組織中的表達(dá)量均較低，此時(shí)皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育最快。進(jìn)入退行期，chi-miR-107-3p的表達(dá)量逐漸增大，此時(shí)次級(jí)毛囊正處于退化階段。同時(shí)，經(jīng)過(guò)chi-miR-107-3p與皮膚毛囊性狀進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，chi-miR-107-3p與皮膚毛囊各性狀均顯著相關(guān)(

P

<0.05)。Li等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用TLN可使chi-miR-107-3p缺失，dicer表達(dá)上調(diào)，可以加速皮膚傷口的愈合，說(shuō)明chi-miR-107-3p的缺失可以加速角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，從而加速皮膚的生長(zhǎng)。由此推測(cè)chi-miR-107-3p是絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子之一，可能參與次級(jí)毛囊重建。

3.3 不同品系絨山羊皮膚組織RHBDF2和ALDH3A2基因在不同毛囊發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

李曉凱利用毛被類型的名義顯著性候選基因和不同毛被類型不同毛囊周期比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),進(jìn)行WGCNA數(shù)據(jù)的挖掘分析,發(fā)現(xiàn)

RHBDF2

基因可能與不同毛被類型存在潛在一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，阿拉善型絨山羊皮膚組織中

RHBDF2

基因的表達(dá)量在興盛期最高，生長(zhǎng)發(fā)育至退行期，

RHBDF2

基因的表達(dá)量逐漸降低，在休止期和興盛前期的表達(dá)量最低。敏蓋絨山羊皮膚組織中

RHBDF2

基因的表達(dá)量在興盛期最高，且在退行期和興盛前期的表達(dá)量大于休止期休止期。同時(shí)對(duì)

RHBDF2

基因與絨山羊皮膚毛囊性狀進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，

RHBDF2

基因與皮膚毛囊各性狀均顯著相關(guān)(

P

<0.05)。說(shuō)明高表達(dá)的

RHBDF2

基因可以促進(jìn)皮膚毛囊生長(zhǎng)。Hosur等在小鼠皮膚損傷傷口愈合反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，

RHBDF

2基因通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)參與上皮再生，可以通過(guò)增強(qiáng)表皮生長(zhǎng)因子受體來(lái)加速皮膚傷口愈合，這與本研究結(jié)果相同。推測(cè)

RHBDF2

基因是絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子；兩個(gè)品系絨山羊皮膚組織中

ALDH3A2

基因的表達(dá)量均是在休止期最高，且極顯著大于其他3個(gè)時(shí)期(

P

<0.01)，退行期和興盛前期極顯著大于興盛期(

P

<0.01)，興盛前期顯著大于退行期(

P

<0.05)?？梢园l(fā)現(xiàn)，

ALDH3A2

基因的表達(dá)量在皮膚毛囊休止期至興盛期的過(guò)程中逐漸降低，由退行期至休止期的過(guò)程中逐漸增高。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，

ALDH3A2

基因與皮膚毛囊各性狀均顯著相關(guān)(

P

<0.05)。說(shuō)明高表達(dá)的

ALDH3A2

可能抑制皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，是調(diào)控皮膚毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子。研究發(fā)現(xiàn)，Sj?gren-Larsson綜合征(SLS)是一種遺傳性神經(jīng)皮膚疾病，由脂肪醛脫氫酶(FALDH)基因誘導(dǎo)

ALDH3A2

突變引起，導(dǎo)致脂肪醛脫氫酶缺乏，脂肪醛和脂肪醇積聚，會(huì)增加角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)并且延緩皮膚屏障的恢復(fù)，

ALDH3A2

在絨山羊羊絨發(fā)育過(guò)程中的作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 chi-miR-107-3p和RHBDF2基因的表達(dá)差異相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因在絨山羊皮膚毛囊不同發(fā)育周期的表達(dá)量呈相反趨勢(shì)。在次級(jí)毛囊重建初期，chi-miR-107-3p表達(dá)量較高，而

RHBDF2

基因的表達(dá)量極低，隨著次級(jí)毛囊重建逐步完成，chi-miR-107-3p表達(dá)量顯著降低，

RHBDF2

基因的表達(dá)量逐漸增高。直到進(jìn)入退行期，chi-miR-107-3p的表達(dá)量逐漸增高，而

RHBDF2

基因的表達(dá)量逐漸降低，休止期，chi-miR-107-3p的表達(dá)量達(dá)到最大值，此時(shí)

RHBDF2

基因的表達(dá)量最小。同時(shí)，結(jié)合基因表達(dá)與皮膚毛囊性狀的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因均與初級(jí)毛囊密度和真皮厚度顯著相關(guān)(

P

<0.05)，且與次級(jí)毛囊密度、表皮厚度、初級(jí)和次級(jí)毛囊深度和毛球直徑極顯著相關(guān)(

P

<0.01)。同時(shí)，利用miRbase預(yù)測(cè)了

RHBDF2

基因與chi-miR-107-3p可能具有靶向關(guān)系，推測(cè)chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因可能存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，共同調(diào)控絨山羊皮膚毛囊的周期性生長(zhǎng)發(fā)育，但這一關(guān)系仍需通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.5 展望

本研究通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)不同品系的絨山羊皮膚毛囊組織顯微結(jié)構(gòu)相近。結(jié)合chi-miR-107-3p及其相關(guān)基因的表達(dá)情況，皮膚毛囊從興盛前期到興盛期、退行期到休止期，chi-miR-107-3p和

RHBDF2

基因表達(dá)量變化總相反。說(shuō)明chi-miR-107-3p可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控

RHBDF2

基因的表達(dá)來(lái)抑制絨山羊皮膚毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育，但這一關(guān)系需進(jìn)一步證實(shí)；根據(jù)

ALDH3A2

基因在絨山羊皮膚組織中的表達(dá)情況與毛囊形態(tài)密切相關(guān)發(fā)現(xiàn)，

ALDH3A2

基因可能是絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因子。接下來(lái)的研究需進(jìn)一步確定chi-miR-107-3p與其相關(guān)基因的靶向關(guān)系，及其對(duì)絨山羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用，對(duì)深入了解絨山羊皮膚毛囊周期性生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制具有重要的意義。