劉成功，李 壑，韓子超，蘇婷婷，張月洋，張 堯，李忠晴，王愛英，祝建波

（石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832061）

在逆境如干旱、寒冷、高鹽和氧化等這些不利因素下，植物的基因表達(dá)發(fā)生改變，會關(guān)閉一些正常表達(dá)的基因，啟動一些與逆境相適應(yīng)的基因[1]，改變次級代謝產(chǎn)物、誘導(dǎo)新蛋白質(zhì)與酶的形成等，這是植物在不斷進(jìn)化過程中形成的一套應(yīng)對各種環(huán)境刺激的機(jī)制[2]。

植物蛋白激酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用，其中一些是植物所獨(dú)有的。鈣依賴蛋白激酶（CDPK）家族是植物中最大的激酶家族之一，在擬南芥中與CDPK 和SnRK（SNF1 相關(guān)激酶）相關(guān)的激酶組成CDPK-SnRK 超家族，其通過改變蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化狀態(tài)，調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)，啟動相應(yīng)的程序[3]，從而對生物的生長發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。由于編碼這些蛋白質(zhì)家族的基因在逆境中具有積極的調(diào)節(jié)作用，特別是干旱和鹽脅迫[4]，因此，常作為植物抗病育種和遺傳改良的潛在候選基因。其中SnRK（蔗糖非發(fā)酵型蛋白激酶家族）是一類植物內(nèi)特異性的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶[5]，該基因家族在進(jìn)化上高度保守，在植物中廣泛存在，是植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的樞紐[6]。SnRK 根據(jù)核酸和蛋白質(zhì)序列的相似性可以分為SnRK1、SnRK2、SnRK3 三個亞家族[7]。其中SnRK1與哺乳動物AMPK和酵母SNF1基因同源，主要參與碳代謝和能量代謝[8-9]。而SnRK2 和SnRK3是植物特有的蛋白激酶亞家族[10]，其中，SnRK2又可以進(jìn)一步分為SnRK2aⅠ、Ⅱ亞族（富含谷氨酸）和SnRK2b Ⅲ亞族（富含天冬氨酸）[11]，在非生物逆境應(yīng)答、ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)育過程中具有重要功能[12-13]。當(dāng)ABA 受體與ABA 結(jié)合后，增強(qiáng)了ABA 受體與PP2C 結(jié)合，此時SnRK2 基因與PP2C 分離，當(dāng)SnRK2 與PP2C 結(jié)合時，SnRK2 基因處于非磷酸化狀態(tài)，它不能激活下游參與植物抗逆的相關(guān)基因，只有磷酸化狀態(tài)的SnRK2 才能激活下游相關(guān)抗性基因表達(dá)[14-16]。

甜瓜屬葫蘆科甜瓜屬，為雌雄同株1 年生蔓性草本植物，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。我國甜瓜栽培總面積和產(chǎn)量都居世界首位[17]，然而在甜瓜生長周期中經(jīng)常會受到各種逆境脅迫的影響，如病原菌侵染、鹽脅迫、旱脅迫等，這些逆境脅迫都會對甜瓜的品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生不良影響。SnRK2 作為植物逆境信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的樞紐，在甜瓜的抗逆過程中扮演著重要角色。目前為止，多種植物中的SnRK2 基因已被分離鑒定，但是對于甜瓜SnRK2 基因的相關(guān)研究還鮮見報道。因此，以甜瓜基因組為基礎(chǔ)，對甜瓜SnRK2 基因家族進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定和特征分析，為今后探討甜瓜的遺傳進(jìn)化和抗逆提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 甜瓜SnRK2基因家族成員的鑒定與理化分析

使用擬南芥SnRK2 蛋白序列作為查詢序列，在甜瓜數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTP 搜索，以鑒定甜瓜基因組中的SnRK2 成員，并利用在線網(wǎng)站SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）對搜索得到的序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析和進(jìn)一步鑒定。

利用在線軟件ProtParam（https://web.expasy.org）計算SnRK2 蛋白的分子質(zhì)量（MW）和等電點(diǎn)（pI），利用Wolfpsort（https://www.genscript.com）預(yù)測SnRK2 家族成員的亞細(xì)胞定位，利用SOPMA（https：//prabi.ibcp.fr/htm/）在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

1.2 SnRK2基因家族進(jìn)化樹的構(gòu)建

在Phytozome 數(shù)據(jù)庫搜索下載玉米、擬南芥、黃瓜和水稻的SnRK2 基因蛋白質(zhì)序列，利用ClustalW軟件進(jìn)行序列比對，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù)為1 000次重復(fù)，其他值為默認(rèn)。

1.3 甜瓜SnRK2基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件GSDS 2.0（https://gsds.cbi.pku.edu.cn）對玉米、水稻、擬南芥、黃瓜、甜瓜SnRK2 的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用在線軟件MEME（https://meme-suit.org）對其蛋白質(zhì)序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，最大結(jié)構(gòu)域數(shù)目設(shè)置為15。

1.4 甜瓜SnRK2基因家族的染色體定位

從Esemble Plant 數(shù)據(jù)庫中下載甜瓜、黃瓜、擬南芥、水稻、玉米的基因組信息和注釋文件，利用TBtools 軟件對甜瓜SnRK2 基因家族的染色體定位進(jìn)行可視化。

1.5 甜瓜SnRK2基因家族成員啟動子順式作用元件分析

使用TBtools 軟件從甜瓜基因組序列文件中提取甜瓜SnRK2 基因家族成員起始密碼子上游2 000 bp 的DNA 序列，使用在線軟件plantCARE（https:bioinformatics.psb.ugent.be）分析啟動子中的順式作用元件。

1.6 甜瓜SnRK2基因家族成員表達(dá)特性分析

從Melonet DB 數(shù)據(jù)庫（https://melonet-db.dna.affrc.go.jp）中獲取甜瓜SnRK2 基因家族成員在不同組織中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并將所得表達(dá)量數(shù)據(jù)RPKM（Reads per kilobase per million mapped reads）經(jīng)log2（X+1）處理后使用TBtools軟件進(jìn)行熱圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜SnRK2基因家族成員的鑒定與理化性質(zhì)分析

在甜瓜數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTP 比對，將下載獲得的蛋白質(zhì)序列使用NCBI 和在線網(wǎng)站SMART 同時檢查是否含有SnRK2 蛋白特有的保守結(jié)構(gòu)域，最終共獲得9 個SnRK2 家族成員，根據(jù)其染色體分布情況，將其命名為CmSnRK2-1—CmSnRK2-9。SnRK2家族成員的激酶結(jié)構(gòu)域中含有2個特殊的位點(diǎn)。第1 個是含有核苷酸結(jié)合域標(biāo)志I/LG/NXGXFG/AXA/V 和作為ATP 結(jié)合位點(diǎn)的賴氨酸殘基的ATP 結(jié)合區(qū)，第2 個是由具有質(zhì)子受體活性的天冬氨酸殘基（活性位點(diǎn)）的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)標(biāo)志V/ICHRDLKLENTLL 組成[18]。如圖1所示，CmSnRK2-3和CmSnRK2-6無位點(diǎn)1，其他7個成員均具有2個位點(diǎn)。

圖1 甜瓜SnRK2蛋白序列比對的2個特殊位點(diǎn)序列信息Fig.1 Sequence information of two special sites of SnRK2 protein sequence alignment in melon

甜瓜SnRK2 基因家族的理化分析結(jié)果如表1所示。甜瓜SnRK2 蛋白氨基酸長度為281～654 aa，分子質(zhì)量為31.49～75.02 ku，等電點(diǎn)為4.42～6.21，其中CmSnRK2-2的等電點(diǎn)偏中性，其他的均為酸性。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，CmSnRK2-2定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，CmSnRK2-3定位在細(xì)胞質(zhì)，CmSnRK2-5定位在細(xì)胞核，CmSnRK2-7定位在過氧物酶體，其余5 個成員定位在細(xì)胞骨架中。此外，表2 顯示，甜瓜SnRK2基因的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲組成，二者在蛋白質(zhì)中的比例約占氨基酸數(shù)目的79%，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角的比例僅占15%和6%左右。

表1 甜瓜SnRK2基因家族成員的理化性質(zhì)Tab.1 Characteristics information of SnRK2 genes in melon

表2 甜瓜SnRK2基因的二級結(jié)構(gòu)Tab.2 Secondary structure of SnRK2 genes in melon %

2.2 SnRK2系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究植物SnRK2 基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，采用鄰接法對擬南芥（10個）、玉米（11個）、水稻（10 個）、黃瓜（11 個）、甜瓜（9 個）的SnRK2 蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），SnRK2 基因家族的亞家族成員的功能分類與其受逆境的誘導(dǎo)情況有很大的關(guān)系，例如，擬南芥SnRK2 基因家族根據(jù)其受ABA激素誘導(dǎo)的不同可以分為兩大部分，其中5 個基因受ABA 強(qiáng) 烈 誘 導(dǎo)[AT3G50500.2（AtSnRK2.2）、AT5G66880.1（AtSnRK2.3）、AT4G33950（AtSnRK2.6）、AT4G40010（AtSnRK2.7）、AT1G78290（AtSnRK2.8）]，4個基因不受 ABA 激素誘導(dǎo)[AT5G08590（AtSnRK2.1）、AT1G10940（AtSnRK2.4）、AT5G63650（AtSnRK2.5） 、AT1G60940（AtSnRK2.10）]， 而AT2G23030（AtSnRK2.9）不受非生物脅迫誘導(dǎo)[19]。SnRK2基因可分為3個亞族，即GroupⅠ—Ⅲ，其中，甜瓜4 個成員屬于GroupⅠ亞族，2 個成員屬于Group Ⅱ亞族，3 個成員屬于GroupⅢ亞族，且因?yàn)樘鸸虾忘S瓜同屬于葫蘆科，親緣關(guān)系最近。在Group Ⅰ亞 族 中，CmSnRK2-2/4與AT5G08590.1、AT5G63650.1聚為一支，表明其可能無法被ABA 誘導(dǎo) 激 活。 在Group Ⅱ亞 族 中，CmSnRK2-3與AT4G40010.1（AtSnRK2.7）、AT1G78290.2（AtSnRK2.8）的親緣關(guān)系最近，在GroupⅢ亞族中，CmSnRK2-8和AT3G50500.2（AtSnRK2.2）、AT5G66880.1（AtSnRK2.3）聚為一支，CmSnRK2-6和AT4G33950.1（AtSnRK2.6）聚 為 一 支，表 明CmSnRK2-3、CmSnRK2-6和CmSnRK2-8可能在甜瓜ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演著重要角色。

圖2 SnRK2基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of SnRK2 gene family

2.3 甜瓜SnRK2基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

為研究甜瓜SnRK2 基因的外顯子/內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)，使用GSDS 軟件對甜瓜SnRK2 的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。圖3a顯示，甜瓜SnRK2基因的外顯子數(shù)量大多為7～9 個，內(nèi)含子數(shù)量為6～8 個。第Ⅰ亞家族和第Ⅲ亞家族成員之內(nèi)，結(jié)構(gòu)域高度保守。其中CmSnRK2-2擁有較多的外顯子數(shù)目（17 個），CmSnRK2-7擁有較長的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果與大多數(shù)植物中SnRK2 基因的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量基本一致[20]。

利用在線軟件MEME 對甜瓜SnRK2 家族成員的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，甜瓜SnRK2 家族成員的蛋白質(zhì)序列N 端激酶結(jié)構(gòu)域保守性較高，包括有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和具有質(zhì)子受體活性的天冬氨酸殘基的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)，而SnRK2 蛋白的C 端則表現(xiàn)出一定的差異（圖3b）。此外，第Ⅰ亞族成員內(nèi)具有高度相似性的保守基序，同時對于第Ⅱ亞族成員，也具有相對較高的相似性。而第Ⅲ亞族與第Ⅰ、Ⅱ亞族之間的相似性較低，這驗(yàn)證了SHUKLA 等[21]對于SnRK2 基因家族的分類，SnRK2可分為SnRK2aⅠ、Ⅱ亞族和SnRK2bⅢ亞族。

圖3 甜瓜SnRK2家族成員motif和基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Motif and gene structure analysis of SnRK2 family members in melon

2.4 甜瓜SnRK2基因家族的染色體定位

根據(jù)甜瓜的基因組序列文件和注釋文件，甜瓜共含有12 條染色體。對甜瓜SnRK2 基因進(jìn)行染色體定位，如圖4 所示，結(jié)果表明，9 個甜瓜SnRK2 基因分布在4條染色體上，其中chr08分布基因數(shù)量最多，共有4個（CmSnRK2-1、CmSnRK2-2、CmSnRK2-3、CmSnRK2-4），chr01 分 布 成 員 最 少，僅 包 含CmSnRK2-6。此外，無明顯證據(jù)證明染色體長度與包含基因數(shù)目之間呈顯著相關(guān)。經(jīng)共線性分析，甜瓜SnRK2基因家族成員之間無重復(fù)基因?qū)Α?/p>

圖4 甜瓜SnRK2基因家族的染色體定位Fig.4 Chromosome mapping of SnRK2 gene family in melon

2.5 甜瓜SnRK2基因家族的啟動子順式作用元件分析

為了解甜瓜SnRK2 基因家族成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，提取了甜瓜SnRK2 基因上游的2 000 bp 作為啟動子序列進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5 所示。在甜瓜SnRK2 基因的啟動子序列上存在有ABA（脫落酸）、SA（水楊酸）、IAA（生長素）、GA（赤霉素）以及MeJA（茉莉酸）等多種植物激素響應(yīng)元件，表明甜瓜SnRK2 基因參與了甜瓜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。同時，還存在多個與光合作用相關(guān)的光響應(yīng)元件（ACE、GBox、Box 4、GT1-motif、G-box、GATA-motif、I-box、Gap-box），以及多種抗逆響應(yīng)元件（包括無氧誘導(dǎo)所必需的順式作用調(diào)節(jié)元件，參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件等），這也表明了甜瓜SnRK2 基因可能在甜瓜的抗逆過程中扮演著重要角色。

圖5 甜瓜SnRK2基因家族啟動子的順式作用元件分析Fig.5 Cis-acting element analysis of SnRK2 gene family promoter in melon

如圖5 所示，所有成員中都具有較多的光響應(yīng)元件。CmSnRK2-9基因的上游順式作用元件個數(shù)最少，CmSnRK2-5 和CmSnRK2-7中未預(yù)測到ABA響應(yīng)元件，CmSnRK2-2和CmSnRK2-4具有較多的激素響應(yīng)元件。

2.6 甜瓜SnRK2基因家族的組織表達(dá)模式分析

為了解甜瓜SnRK2 基因家族成員的組織表達(dá)模式，從Melonet DB 數(shù)據(jù)庫[22]中獲取了5 個甜瓜SnRK2 基因家族成員的組織表達(dá)信息并對其進(jìn)行分析。如圖6 所示，在干種子中，CmSnRK2-7和CmSnRK2-9不表達(dá)，而CmSnRK2-6和CmSnRK2-1的表達(dá)量較高；在根中，CmSnRK2-1的表達(dá)量最高，CmSnRK2-2和CmSnRK2-6的表達(dá)量次之，CmSnRK2-7的表達(dá)量最低，CmSnRK2-9不表達(dá)。CmSnRK2-1在雌花花瓣中的表達(dá)量最高，CmSnRK2-6在雌花柱頭的表達(dá)量最高；CmSnRK2-9在卷須中的表達(dá)量最高?？傮w來說，CmSnRK2-9在甜瓜的各個組織中均表現(xiàn)出較低的表達(dá)水平，而CmSnRK2-1的表達(dá)量則相對較高，CmSnRK2-7在不同組織中的表達(dá)無顯著差異，為組成型表達(dá)。

圖6 甜瓜SnRK2基因在不同組織的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of SnRK2 genes in different tissues of melon

3 結(jié)論與討論

為了抵抗不利的環(huán)境條件，如干旱、高鹽和極端溫度等，植物會以犧牲生長為代價來提高脅迫耐受性并存活[23]。植物可以通過對轉(zhuǎn)錄因子、分子伴侶、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)生理生化水平的變化[24]。越來越多的證據(jù)表明，SnRK2 蛋白激酶作為一個小型的植物特異性蛋白家族，可通過滲透脅迫被激活，成為調(diào)節(jié)ABA 信號通路的關(guān)鍵組成部分[25-26]，也是觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng)的主要驅(qū)動力。

在模式植物擬南芥逆境脅迫的研究中，SnRK2基因家族常表現(xiàn)出重要的抗逆功能，在水稻、玉米的抗逆過程中，SnRK2 基因家族同樣具有相似的表達(dá)模式[27]。因此，在研究植物非生物逆境脅迫中，對于SnRK2 基因家族成員的鑒定和特性分析尤為重要。本研究以甜瓜的公開基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對甜瓜SnRK2 基因家族成員進(jìn)行了鑒定和系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示，甜瓜基因組中共包含有9個SnRK2基因，與黃瓜（CuSnRK2-1—11）、玉米（ZmSnRK2-1—11）、擬南芥（AtSnRK2-1—10）等物種相比，其SnRK2 基因家族成員數(shù)量基本一致，表明其基因家族成員數(shù)量與基因組大小之間無顯著相關(guān)性。

在SnRK2 基因家族成員的氨基酸序列中存在2個高度保守的基序，位點(diǎn)1：包含核苷酸結(jié)合域I/LG/NXGXFG/AXA/V 和作為ATP 結(jié)合的賴氨酸殘基;位點(diǎn)2：具有質(zhì)子受體活性的天冬氨酸殘基（活性位點(diǎn)）V/ICHRDLKLENTLL。但在甜瓜SnRK2 基因家族成員內(nèi)序列比對結(jié)果顯示，CmSnRK2-3和CmSnRK2-6只存在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的活性位點(diǎn)（天冬氨酸殘基），無ATP 結(jié)合位點(diǎn)（賴氨酸殘基），這表明CmSnRK2-3和CmSnRK2-6在進(jìn)化過程中可能與其他家族成員之間出現(xiàn)了功能上的差異，同時也表明甜瓜SnRK2 基因家族成員之間可能存在著功能上的分工。

參考擬南芥中AtSnRK2基因分類，可將甜瓜SnRK2基因分為3個亞族，其中，第Ⅱ亞族和Ⅲ亞族成員受到ABA 的調(diào)控，在ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到了重要的調(diào)控作用。

片段復(fù)制（Segmental duplication）、串聯(lián)復(fù)制（Tandem duplication）和轉(zhuǎn)位事件（如反轉(zhuǎn)和復(fù)制轉(zhuǎn)位）是3 種主要的進(jìn)化模式[28]。在這些模式中，片段和串聯(lián)復(fù)制被認(rèn)為是植物基因家族擴(kuò)展的2個主要原因。在甜瓜的SnRK2 基因家族中，9 個家族成員分布在4條染色體上，無基因簇出現(xiàn)。此外，在進(jìn)行基因家族共線性分析時，并未檢測到基因之間的串聯(lián)重復(fù)事件和片段重復(fù)事件的發(fā)生，這一現(xiàn)象表明，甜瓜SnRK2 基因家族成員之間可能具有相對獨(dú)立的進(jìn)化關(guān)系。

啟動子分析結(jié)果顯示，除ABA 響應(yīng)元件外，在甜瓜SnRK2 基因的上游調(diào)控序列中還存在SA、MeJA、Auxin 以及GA 等多種植物激素響應(yīng)元件，這一結(jié)果表明，甜瓜SnRK2基因不僅在ABA信號通路中扮演重要角色，而且可能參與了多個植物激素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。此外，多個逆境相關(guān)作用元件的存在也說明了甜瓜SnRK2 基因家族在甜瓜抗逆過程中的重要性。在分析上游啟動子順式作用元件時發(fā)現(xiàn)，CmSnRK2-7和CmSnRK2-9的順式作用元件很少，且結(jié)合組織特異性表達(dá)熱圖發(fā)現(xiàn)，CmSnRK2-7和CmSnRK2-9的表達(dá)量也較低，說明啟動子區(qū)域的特征元件在調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮正相關(guān)作用。

組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，甜瓜SnRK2 基因有著多樣的組織表達(dá)模式，有些基因呈組成型表達(dá)，有些基因則表現(xiàn)出顯著的組織特異性。豐富多樣的表達(dá)組織、表達(dá)模式表明不同的甜瓜SnRK2 基因之間可能存在著明確的分工，各基因之間相互合作，共同調(diào)控甜瓜的生長發(fā)育和各種生理生化過程。

綜上，本試驗(yàn)結(jié)果表明，在甜瓜基因組中共包含有9 個SnRK2 基因，8 個預(yù)測定位于細(xì)胞核，1 個預(yù)測定位于細(xì)胞質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。其可分為3 個亞族，且同一亞族成員之間的motif 和基因結(jié)構(gòu)較為保守，其中第Ⅰ、Ⅱ亞族具有高度保守的N 端結(jié)構(gòu)域。染色體定位結(jié)果顯示，9 個SnRK2 基因集中分布于4 條染色體上，無重復(fù)基因?qū)Α幼臃治鼋Y(jié)果顯示，在SnRK2 基因的調(diào)控序列中有多個植物激素和逆境脅迫相關(guān)響應(yīng)元件。對5 個家族成員的組織表達(dá)分析結(jié)果表明，有些SnRK2 基因在不同組織中呈組成型表達(dá)，有些基因則具有顯著的組織特異性（CmSnRK2-1、CmSnRK2-6）。