曹遷永，陳 茜，祝文斌

(南昌大學(xué)化學(xué)系，南昌 330031)

核苷酸是遺傳物質(zhì)重要的組成部分，是一種信使分子。GTP是核苷酸中的一種，參與人體中許多重要的生化反應(yīng)，同時(shí)也是細(xì)胞信息交流的中間媒介[1-2]，廣泛存在于生命體中[3]。例如，GTP能調(diào)節(jié)Ca2+誘導(dǎo)的胰島素分泌，同時(shí)也能刺激神經(jīng)軸突生長(zhǎng)等[4]。同時(shí)，其代謝異常會(huì)導(dǎo)致一系列的生理疾病[5],如高尿血酸癥、乳清酸尿癥等[6]。因此，實(shí)時(shí)、靈敏檢測(cè)GTP顯得尤為重要。

近些年以來，GTP識(shí)別與快速靈敏檢測(cè)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道。其中熒光化學(xué)傳感器由于簡(jiǎn)捷、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)引起人們廣泛關(guān)注[7]。一些小分子熒光受體已經(jīng)被用于GTP識(shí)別[8,9]。由于有機(jī)小分子具有生物相溶性差、穩(wěn)定性不高、熒光量子產(chǎn)率低及信號(hào)弱等缺點(diǎn)，使其在生物學(xué)上的應(yīng)用受到限制。而聚合物傳感器可很好地解決這一缺點(diǎn)[10]。與此同時(shí)，由于GTP與其他核苷酸結(jié)構(gòu)高度相似性，目前已報(bào)道的GTP傳感器選擇性不高[11]，因此該領(lǐng)域需要更深層次的探索。

鑒于其獨(dú)特的開環(huán)易位聚合特性，降冰片烯在能源、醫(yī)藥、生物成像和傳感等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[12]。以降冰片烯為載體的聚合物傳感器用于金屬離子及陰離子識(shí)別也有相關(guān)報(bào)道[13-15]。基于此，本文合成了一種萘功能化的三唑鎓聚降冰片烯熒光化學(xué)傳感器P1，研究了聚合物及其對(duì)應(yīng)單體在水溶液中對(duì)GTP及其他陰離子的熒光識(shí)別能力，并揭示了聚合物客體與GTP分子間識(shí)別原理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品及儀器

本試驗(yàn)所有溶劑均為分析純，2-萘磺酸鈉、降冰片烯二酸酐、溴乙胺氫溴酸鹽、溴丙炔、三甲基氧鎓四氟硼酸鹽、Grubbs催化劑、陰離子鈉鹽均從百靈威化學(xué)試劑公司購買。

使用了恒溫磁力攪拌器(SH-7，常州精儀有限公司)來作為反應(yīng)平臺(tái)；利用核磁共振儀(DD2-400MR，美國Agilent公司)確定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)；HITACHI公司UV 3010儀器測(cè)試物質(zhì)吸收光譜，而物質(zhì)的發(fā)射光譜在HITACHI公司F-4500熒光光譜儀上測(cè)試。

1.2 檢測(cè)限及絡(luò)合常數(shù)的計(jì)算

絡(luò)合常數(shù)的計(jì)算：

根據(jù)Benesi-Hildebrand方法，熒光滴定的數(shù)據(jù)結(jié)合GTP與聚合物P1按照1:1絡(luò)合比計(jì)算得來。

在方程中I0代表聚合物P1沒有加入GTP時(shí)的熒光強(qiáng)度，I代表聚合物P1結(jié)合GTP的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度，I′代表聚合物P1完全結(jié)合GTP時(shí)的熒光熒光強(qiáng)度。

檢測(cè)限(DL)的計(jì)算：

DL=3σ/K

公式中σ空白測(cè)量值的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差值，K是線性擬合的斜率。

1.3 紫外光譜和熒光光譜的測(cè)試

不同陰離子鈉鹽首先用去離子水配成其母液(1.0 mmol)，而聚合物及單體的母液(2.0 mmol)在DMSO中配制。熒光及紫外-可見光譜的測(cè)試濃度10 μmol，用體積為2 mL石英比色皿。在陰離子滴定光譜試驗(yàn)中，陰離子母液滴入到測(cè)試溶液(2 mL)中的體積量很少，可以忽略不計(jì)，整個(gè)體積恒定為2 mL。

1.4 合成

1.4.1 化合物1的合成

化合物1的制備參照文獻(xiàn)[16]。

1.4.2 化合物2的合成

在N2氛圍下，稱取化合物1(314.2mg,1 mmol)和NaN3(162.5 mg,2.5 mmol)加入反應(yīng)瓶中。用CH3CN(5 mL)溶解，于40 ℃下攪拌5小時(shí)。旋干溶劑，粗產(chǎn)物通過柱色譜以二氯甲烷純化的到化合物2(268 mg，97.0%)。

1.4.3 化合物3的合成

化合物3的制備參照文獻(xiàn)[16]。

1.4.4 化合物4的合成

于N2條件下，稱取化合物3(201.2 mg，1 mmol)和2(276.3 mg，1 mmol)溶解在少量DMF溶液中，攪拌均勻后，加入CuSO4·5H2O(50 mg,0.2 mmol)和抗壞血酸鈉(70 mg,0.4 mmol)，于40℃下攪拌2小時(shí)。加水析出沉淀，抽濾、洗滌得粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物通過柱色譜(洗脫劑為CH2Cl2:MeOH=98:2,v/v)純化的化合物4(458.4 mg，96.0%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ8.43(s,1H),8.15(dd,J=12.3,8.2 Hz,2H),8.10～7.97(m,2H),7.86～7.75(m,2H),7.75～7.65(m,2H),5.98(s,2H),4.41(s,4H),3.36(s,2H),3.30～3.17(m,4H),1.53(s,2H)；13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ177.21,142.23,137.40,134.69,132.14,129.89,129.63,129.18,128.25,127.94,124.07,122.55,52.17,49.57,45.74,44.77,42.93,40.66,40.37,40.14,39.83,39.62,39.41,33.46。

1.4.5 化合物5的合成

于N2條件下，稱取三甲基氧鎓四氟硼酸鹽(152 mg，1.0 mmol)和化合物4(239 mg，0.5 mmol)溶于二氯甲烷中，室溫下攪拌48h。旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)多次重結(jié)晶后，得化合物5(275 mg,94.8%)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ8.73(s,1H),8.40(s,1H),8.13(d,J=6.6 Hz,2H),8.04(d,J=8.4 Hz,2H),7.77～7.64(m,3H),6.06(s,2H),4.72(s,2H),4.62(s,2H),4.23(s,3H),3.40(s,2H),3.33(s,2H),3.24(s,2H),1.54(s,2H);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ177.15,135.00,131.04,130.02,129.63,129.37,128.24,127.94,122.44,53.78,52.24,46.01,44.86,40.34,40.03,39.91～39.87,39.71,39.40,39.14～38.68,38.61,30.21。

1.4.6 化合物P1的合成

在N2氛保護(hù)下，稱取化合物5(58 mg,0.1 mmol)、第三代Grubbs化劑(G3)(41.5 mg，0.05 mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，室溫下反應(yīng)5h，隨后加入乙烯基乙醚(1.5 ml)繼續(xù)攪拌，然后加入甲醇析出沉淀，抽濾、洗滌后得聚合物P1(52 mg，90%收率)。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.42(d,J=33.2 Hz,2H),8.04(s,2H),7.76(s,1H),7.66(s,2H),7.30(s,1H),6.36(s,1H),5.46(s,2H),4.79(s,2H),4.60(s,2H),4.28(s,3H),3.37(s,2H),3.32～3.08(m,2H),2.84(s,1H),1.66(s,1H),1.27(s,1H)。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成的結(jié)構(gòu)與表征

圖1為聚合物P1的合成路線。首先，化合物1與NaN3經(jīng)疊氮反應(yīng)得到化合物2，然后化合物2與化合物3在硫酸銅催化下經(jīng)點(diǎn)擊反應(yīng)合成化合物4。在三甲基氧鎓四氟硼酸鹽的作用下，化合物4三唑環(huán)上5-位引入甲基，得到含三唑鎓陰離子識(shí)別位點(diǎn)的單體5。在第三代格拉布催化劑作用下，單體5經(jīng)開環(huán)易位反應(yīng)得到聚合物P1。比較聚合物及單體化合物5的1H NMR譜，可以看到原來單體5中降冰片烯位于6.06×10-6化學(xué)位移上的烯氫消失，聚合物在5.46×10-6出現(xiàn)了1個(gè)新峰，并且降冰片烯的橋接亞甲基的氫峰裂分為2個(gè)新峰。

圖1 聚合物P1的合成路線:a) NaN3,DMF;b) CuSO4·5H2O,NaVc,DMF;c) 三甲基氧鎓四氟硼酸鹽,DCM;d) Grubbs催化劑,DCMFig.1 The synthesis route of polymer probe P1:a) NaN3,DMF;b) CuSO4·5H2O,NaVc,DMF;c) Trimethyloxonium tetrafluoroborate,DCM;d) Grubbs catalyst,DCM

2.2 單體化合物5在水溶液中的陰離子識(shí)別能力研究

λ/nm

λ/nm

2.3 聚合物受體P1在水溶液中陰離子識(shí)別能力研究

同時(shí)筆者研究了聚合物受體P1(10 μmol，基于聚合物單體計(jì))在水相中對(duì)不同陰離子的識(shí)別能力。在水溶液中，聚合物與單體紫外吸收光譜相似，但它們之間的熒光光譜卻有很大的不同。如圖3a所示，在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，聚合物P1在400 nm處出現(xiàn)了發(fā)射峰，較單體350 nm發(fā)射峰的發(fā)生了很大的紅移，這可能歸因于聚合物支鏈萘熒光團(tuán)間發(fā)生π-π堆積作用的結(jié)果。

λ/nm

圖3 a) 聚合物P1(10 μmol)在水溶液(含0.5% DMSO)中滴加50 μmol不同陰離子熒光光譜變化圖;b) 在400 nm處熒光選擇性柱狀圖Fig.3 a) The emission spectra of P1(10 μmol) before and after addition of 50 μmol various anions in aqueous solution containing.b) The relative emission intensity of P1 at 400 nm upon addition various anions

通過聚合物P1對(duì)GTP進(jìn)行了熒光滴定。從圖4a中可看出，隨著GTP逐漸加入，聚合物受體位于400 nm處的聚集態(tài)發(fā)射峰快速下降。當(dāng)?shù)渭?倍摩爾量GTP時(shí)，其熒光強(qiáng)度不再下降。這些滴定數(shù)據(jù)通過Benesi-Hildebrand公式線性擬合表明P1與GTP間為1:1絡(luò)合，絡(luò)合常數(shù)為3.52×104mol·L-1(圖4c)。同時(shí)，當(dāng)GTP濃度在0～10 μmol時(shí)與P1熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系，根據(jù)3σ/K公式可計(jì)算出P1對(duì)GTP的檢測(cè)限低至0.585 μmol(圖4d)。

λ/nm

[GTP]/eq

1/[GTP]

[GTP]/μmol

2.4 聚合物P1水中識(shí)別GTP競(jìng)爭(zhēng)陰離子及不同pH值影響

作為一個(gè)好的探針，對(duì)不同共存離子的抗干擾性也非常重要。因此，筆者進(jìn)一步研究了水溶液中聚合物P1在其他共存離子時(shí)對(duì)GTP的識(shí)別性質(zhì)。如圖5a所示，當(dāng)有其他陰離子存在時(shí)P1識(shí)別GTP較僅存在GTP時(shí)熒光信號(hào)并沒有明顯的變化，表明聚合物P1對(duì)GTP有很好的選擇性，可不受其他核苷核或陰離子干擾。同時(shí)研究了聚合物P1在不同pH值時(shí)對(duì)GTP識(shí)別性能的影響(圖5b)。結(jié)果表明，在pH 6～8范圍內(nèi)，聚合物P1對(duì)GTP的熒光識(shí)別性能基本不受影響，保證其可用于中性水溶液及生理環(huán)境時(shí)識(shí)別GTP。

pH

2.5 聚合物P1與GTP的絡(luò)合機(jī)理

根據(jù)上述熒光光譜數(shù)據(jù)，筆者假定了聚合物P1與GTP的作用機(jī)理。如圖6所示，聚合物P1中存在萘熒光團(tuán)在400 nm聚集體發(fā)光。當(dāng)?shù)渭覩TP時(shí)，三唑鎓/酰胺與GTP帶負(fù)電荷的三磷酸根通過氫鍵/靜電引力作用，而GTP中的鳥苷堿基對(duì)與萘環(huán)通過π-π作用增強(qiáng)了主客體的相互作用。這樣導(dǎo)致G堿基對(duì)與萘生色團(tuán)的PET熒光猝滅，同相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一樣[17]。有意思的是，對(duì)于單體5對(duì)GTP并無熒光識(shí)別能力，表明聚合物鏈對(duì)受體分子的空間受限能很好的增加受體分子的選擇性與靈敏性。

圖6 聚合物P1識(shí)別GTP的機(jī)理圖Fig.6 The proposed binding mechanism between P1 and GTP

3 結(jié)論

本文成功設(shè)計(jì)、合成了一種以萘為熒光團(tuán)，含有三唑鎓和酰胺識(shí)別位點(diǎn)降冰片烯聚合物。在水相溶液中，該聚合物對(duì)GTP有很好的熒光猝滅響應(yīng)，且不受其他核苷酸如ADP、AMP、ATP、UTP的干擾。相比于其單體的識(shí)別性質(zhì)，表明聚合物鏈能增強(qiáng)受體分子的離子識(shí)別選擇性，達(dá)到對(duì)分析物的特異性識(shí)別，同時(shí)該聚合物傳感器對(duì)GTP的絡(luò)合常數(shù)為3.52×104mol·L-1、檢測(cè)限低至0.585 μmol。