張林,甘金華,何力,張濤,周劍光

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，湖北 武漢 430072)

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖在很大程度上是依靠消耗大量生產(chǎn)要素資源、自然資源來維持的，造成漁業(yè)資源衰退。面對種質(zhì)資源遭受到的威脅，我們對中國大部分魚類的種質(zhì)情況尚不明了。種質(zhì)鑒定能反映魚類種群資源狀況，查明種群的遺傳結(jié)構(gòu)和變異情況，確定原種保護(hù)和開發(fā)利用措施[1]。

江鱈(LotaLota)，又名鲇魚、山鯰魚、山懷子，屬于鱈形目，鱈魚科，江鱈屬(Lota)，鱈科魚類中唯一的淡水魚種。該魚種屬北極淡水復(fù)合體魚種，是典型的冷水性魚類，具有酷寒期于冰下生殖洄游，并在水溫接近 0 ℃時產(chǎn)卵的特殊習(xí)性。該魚種廣泛分布在北美和歐亞的一些內(nèi)陸水域和海灣，屬于高緯度水域珍貴經(jīng)濟(jì)魚類，因具有肥大的肝臟和美味的雄性精巢而著稱[2]。中國僅新疆的額爾齊斯河、東北的黑龍江水系及鴨綠江上游水域有該魚種的分布。該魚種可作為防凍、抗寒及低溫狀態(tài)下生命活動等方面研究的特定物種。

目前關(guān)于該魚種相關(guān)的研究很少，僅見黑龍江水系及鴨綠江上游的江鱈生物學(xué)方面的報道，包括江鱈對環(huán)境的適應(yīng)性、影響江鱈徊游的因素、年齡、生長、食性、繁殖、形態(tài)學(xué)及亞種的分類[3-6]，江鱈作為野生魚種常被用來研究環(huán)境污染狀況的指標(biāo)。對額爾齊斯河水域江鱈的研究非常少，更未對江鱈進(jìn)行系統(tǒng)的種質(zhì)研究和種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的制定。近年隨著江鱈捕獲量的增加，野外水域中該魚種越來越少，因此對該魚種的種質(zhì)資源開展生化遺傳學(xué)、分子生物方面的系統(tǒng)研究，對該魚種的開發(fā)利用以及資源保護(hù)具有非常重要的意義。本研究利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對乳酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶4種同工酶在江鱈的肌肉、肝臟、心臟、脾臟、腎臟和眼睛等6 種組織中的分布、活性及遺傳變異進(jìn)行了比較分析，旨在了解4種同工酶在江鱈6種不同組織中的差異性表達(dá)，解析江鱈額爾齊斯河群體的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)，為該魚種野生種質(zhì)資源保護(hù)及江鱈屬魚類的分類、物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物江鱈30尾(雌雄各15 尾)，由浙江海洋大學(xué)于2017年 7月采自新疆額爾齊斯河水系的布爾津河流域，樣品體長在 20.3～22.5 cm 之間，體重為 230～246 g，江鱈經(jīng)充氧活體送至實驗室養(yǎng)殖，暫養(yǎng)于室內(nèi)2.0×2.0×1.8 m循環(huán)水魚池中一周后開始實驗。

1.2 樣品采集及樣本制備

樣品采集：將魚池中的10尾魚(雌雄各5尾)搬運至實驗室，剪鰓放血處死，將魚體表面水分擦干后解剖，分別取背部肌肉、肝臟、心臟、脾臟、腎臟和眼睛等6種組織，編號后放入相應(yīng)的塑料袋，于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

樣本制備：取0.3～0.5 g冷凍組織樣品，使用生理鹽水將血液清洗干凈，剔除表面的雜質(zhì)，按1∶3的比例(m/v)加入新鮮滅菌蒸餾水，于干凈的勻漿器中充分勻漿后以12 000 r/min低溫離心30 min分離上清，將上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，重復(fù) 2～3次，直至上清液澄清為止，整個操作過程需在低溫下進(jìn)行。

1.3 同工酶的凝膠電泳分析

同工酶采用聚丙烯酰胺(PAGE)梯度凝膠電泳分析。聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳方法參照Nei等[8]的報道，并加以改進(jìn)。聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳所采用4.0%的濃縮膠和7.0%的分離膠，電泳時采用pH 8.3的Tris-甘氨酸電泳緩沖液，加樣前，先用50 mA電流進(jìn)行30 min恒流預(yù)電泳以除去膠中雜質(zhì)，然后向每個加樣孔中加入20 μL制備好的樣品，用280 mV電壓進(jìn)行約10 min電泳，待樣品出凝膠孔后，將電壓調(diào)至220 mV進(jìn)行電泳，待上樣溴酚藍(lán)指示劑電泳至平板底處時，結(jié)束電泳，整個電泳過程均在4 ℃下進(jìn)行。

1.4 凝膠的染色和脫色

電泳結(jié)束后，將膠片從玻璃板中剝離，放入37 ℃恒溫箱中預(yù)熱的染色液進(jìn)行染色，染色至所有條帶清晰時終止。各種同工酶的染色過程參照Shaklee和Nei等[7-8]的報道。染色好的膠片放入2.5%冰乙酸中進(jìn)行脫色，脫色后清晰顯示的膠片，放入保存液中進(jìn)行固定。

1.5 圖譜分析與數(shù)據(jù)處理

固定好的凝膠照片用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD Gel DOCTMXR+)進(jìn)行拍照并分析，并用專用水溶性玻璃紙將膠片固定在玻璃板上，置于陰涼處晾干，以利于長期保存。電泳圖譜中各種同工酶的縮寫、命名、編號、酶譜分析、基因位點、等位基因和基因型的命名參照Nei和Hofmann等的報道[8-9]?；蛭稽c的命名以向陽極遷移的速度快慢，采用數(shù)字依次編號。依據(jù)電泳結(jié)果判斷每種同工酶的基因型，根據(jù)基因型計算每個等位基因的基因頻率。采用多態(tài)位點比例和平均雜合度2個指標(biāo)來衡量遺傳變異的程度。平均雜合度、多態(tài)位點比例、遺傳距離等參數(shù)的計算參照Nei[8]和日本水產(chǎn)資源保護(hù)協(xié)會報道的方法[9-10]，即實測等位基因的出現(xiàn)頻率小于或等于0.99時，可視為多態(tài)。參照楊元吳[11]的方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 江鱈同工酶的組織特異性表達(dá)

2.1.1 乳酸脫氫酶的組織差異性表達(dá)

乳酸脫氫酶為四聚體酶，在江鱈中由 5個基因位點編碼，5個基因位點均為多態(tài)。在眼睛中出現(xiàn)5條酶帶，多態(tài)性明顯。LDH1在脾臟、腎臟中不表達(dá)，在其他組織中微弱表達(dá)，LDH1條帶在肌肉中的顏色最深，活性最強(qiáng)；LDH2在肝臟中不表達(dá)，在其他5個組織中均有分布；LDH3在各組織中均有表達(dá)，條帶清晰，在肝臟中表達(dá)較弱，其余組織中表達(dá)均較強(qiáng)，LDH2、LDH3在心臟中的顏色最深，活性最強(qiáng)；LDH4、LDH5僅在肝臟及眼中有表達(dá)。江鱈LDH 同工酶的電泳結(jié)果見圖1。

圖1 江鱈LDH同工酶的電泳圖譜1-3：肌肉，4-6：肝臟，7-9：心臟，10-12：脾臟，13-15：腎臟，16-18：眼睛。下同。Fig.1 Electrophoretograms for LDH isozyme of Lota lota1-3:muscle, 4-6:liver, 7-9:heart, 10-12:spleen, 13-15:kidney,16-18:eye.The same below.

2.1.2 乙醇脫氫酶的組織差異性表達(dá)

乙醇脫氫酶是一個分子量為80 kDa的二聚體，主要催化乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛。江鱈的 ADH由5個基因位點編碼，ADH1、ADH2、ADH3為多態(tài)，ADH4和ADH5為單態(tài)。ADH1僅在肝臟和腎臟中表達(dá)，ADH2在肌肉、肝臟和腎臟中表達(dá)，ADH3在心臟中表達(dá)最豐富，在肌肉和肝臟中無表達(dá)，在其他組織中有微弱表達(dá)，ADH4除在肝臟中表達(dá)較弱，在其他組織中活性均較強(qiáng)，其中心臟與眼中活性最高，ADH5僅在肝臟、眼中有微弱的表達(dá)。江鱈ADH 同工酶的電泳結(jié)果見圖2。

圖2 江鱈 ADH同工酶的電泳圖譜Fig.2 Electrophoretograms for ADH isozyme of Lota lota

2.1.3 蘋果酸脫氫酶的組織差異性表達(dá)

蘋果酸脫氫酶為二聚體酶，包括上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)兩種形態(tài)，二者不能相互轉(zhuǎn)化形成異二聚體。江鱈的MDH由兩個基因位點編碼，均為多態(tài)，MDH-1在除脾臟外其他組織均可檢測到，MDH2在所檢測的組織中均可檢測到。江鱈MDH同工酶的電泳結(jié)果見圖3。

圖3 江鱈MDH同工酶的電泳圖譜Fig.3 Electrophoretograms for MDH isozyme of Lota lota

2.2 江鱈群體遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)

通過分析江鱈的肌肉、肝臟、心臟、脾臟、腎臟和眼睛等6種不同組織中的LDH、ADH和MDH等3種同工酶代表性條帶，初步了解了江鱈群體遺傳學(xué)參數(shù)(表1)。經(jīng)統(tǒng)計共記錄基因位點12個，10個基因位點有多態(tài)，多態(tài)位點的基因頻率為0.125～0.875，多態(tài)位點比例為83.33%；等位基因數(shù)為22，位點平均有效等位基因數(shù)為1.833 3；平均觀測雜合度為0.423 4，平均期望雜合度為0.310 9，Hardy-Weinberg 遺傳偏離指數(shù) D為0.361 9。

表1 江鱈群體的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)Tab.1 Genetic structure of Lota lota

續(xù)表1,Tab.1 Continued

2.3 江鱈生化遺傳學(xué)標(biāo)記

首先隨機(jī)取5尾魚，進(jìn)行6種組織常見同工酶(LDH、ADH、MDH、EST、IDHP)篩查，然后取10尾健康江鱈對篩選的單態(tài)同工酶進(jìn)行驗證，以初步確定反映江鱈種質(zhì)的生化遺傳特性。結(jié)果表明：江鱈肌肉組織異檸檬酸脫氫酶(IDHP)是單態(tài)，且穩(wěn)定表達(dá)，可作為江鱈生化遺傳學(xué)標(biāo)記。江鱈肌肉組織IDHP電泳結(jié)果見圖4。

圖4 江鱈肌肉組織IDHP電泳圖譜1-10泳道分別表示不同個體的酶譜。Fig.4 Electrophoretogram of IDHP isozyme expressed in muscle of Lota lota1-10 showed the zymograms of different individuals.

3 討論

3.1 江鱈同工酶表達(dá)的組織特異性分析

通過對江鱈的肌肉、肝臟、心臟、脾臟、腎臟和眼睛6種組織的LDH、ADH、MDH、EST、IDHP 5種同工酶進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)同工酶表達(dá)具有顯著的組織特異性。因江鱈許多組織及個體酯酶多次未能檢出，因此本研究僅選擇LDH、ADH和MDH 3種經(jīng)典的同工酶酶譜初步分析江鱈的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)LDH、ADH、MDH 3種同工酶在心臟中均有高水平進(jìn)行表達(dá)，其次是眼睛、肝臟、肌肉，腎臟和脾臟中各同工酶的表達(dá)逐漸減弱，多態(tài)水平高。同時對多種組織進(jìn)行IDHP電泳，發(fā)現(xiàn)只有肌肉組織是單態(tài)，表達(dá)1條酶帶，可以作為江鱈特有的種質(zhì)生化遺傳標(biāo)記。而其他組織IDHP表達(dá)不清晰，拖帶嚴(yán)重。

LDH一般由A和B兩種不同多肽鏈組成的同源或異源四聚體。本研究中LDH1由A基因編碼形成四聚體，基本上在無氧條件下起作用，這說明江鱈肌肉無氧代謝較為旺盛，與其作為冷水底棲兇猛肉食魚類的習(xí)性相適應(yīng)[12-13]。LDH3由B基因編碼形成四聚體，在有氧組織中表現(xiàn)出很高的活性，這與心臟催化乳酸氧化形成丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)相一致。在心臟中的LDH3、ADH3、ADH4 和 MDH2特異性高表達(dá)，進(jìn)一步說明了心臟無可替代的代謝功能。江鱈LDH的組織分布證明了江鱈很可能存在編碼 LDH-C的基因。已有研究表明，LDH-C的四聚體僅在哺乳動物的精子以及高等魚類的肝和眼中檢測到[14-16]。本研究中發(fā)現(xiàn)江鱈眼睛的LDH同工酶有5條特異性多態(tài)條帶，說明由LDH-C基因編碼，與已報道的研究結(jié)論相符，該結(jié)果也表明江鱈在進(jìn)化上處于相對高級的階段。分析原因可能是江鱈在淡水環(huán)境中處于食物鏈頂端，所面臨的選擇壓力較大，因此其進(jìn)化速度相比其他高等魚類更為快捷。

3.2 江鱈群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析

種群的遺傳結(jié)構(gòu)能夠反映物種的進(jìn)化過程，多態(tài)位點比例(P)和平均雜合度(H)指標(biāo)是衡量魚類群體生化遺傳變異和種質(zhì)資源狀況的重要指標(biāo)[15-18]。多態(tài)位點比例會因魚種或同種魚的不同種群而出現(xiàn)差異，本研究中得到的 P 值及 He均較高，表明江鱈額爾齊斯群體在生化遺傳變異上也處于較高水平，當(dāng)然也可能由于本研究所選代表性酶種類較少，其次IDHP、EST各組織中檢測到雜合子的情況較少或未檢出。因此，如果多種酶進(jìn)行綜合考慮，其P值和He值可能較本研究中常見的有代表性的3種酶譜所得出的數(shù)據(jù)小些，但即使這樣，額爾齊斯河江鱈群體的遺傳變異性高于魚類的平均水平。

遺傳偏離指數(shù)(D) 也是全面反映群體的遺傳平衡狀況的重要指標(biāo)。D值接近零則基因的分布就接近平衡狀態(tài)，D值的正負(fù)反映了種群內(nèi)雜合子的過?；蛉笔顟B(tài)，D值為正表明雜合子過剩，為負(fù)表明雜合子缺失[17]。本研究中江鱈群體的D值為0.361 9，表明其雜合子過剩，說明江鱈群體遺傳變異程度較大，遺傳多樣性較高。同時江鱈群體的有效等位基因數(shù)Ne為1.833 3，這比報道的硬骨魚類的多樣性的有效等位基因數(shù)(Ne=1.16～1.58)[18]的上限略高，可能與本研究中同工酶樣本數(shù)量不多有關(guān)。額爾齊斯河江鱈群體的種質(zhì)資源庫具有較大的變異程度，因此額爾齊斯河江鱈可為后續(xù)的人工育種提供良好的親本。

同時本研究通過對江鱈6種主要組織的同工酶凝膠電泳圖譜分析，初步確定了IDHP在肌肉組織中的表達(dá)量高且活性穩(wěn)定，因此異檸檬酸脫氫酶可作為江鱈鑒定的生化遺傳標(biāo)記。

該研究通過對江鱈多種同工酶在不同組織中的差異表達(dá)分析，有利于從生化遺傳的角度判定江鱈與其他屬魚類親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，同時也可為江鱈種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立及良種選育提供理論依據(jù)。