林明霞 李寶梅 朱春燕

失眠主要表現(xiàn)為入睡困難、睡后反復(fù)醒來難以再次入睡或睡眠質(zhì)量差，極易影響白天日常生活。根據(jù)電生理參數(shù)，睡眠被分為快速動(dòng)眼睡眠（rapid eye movement sleep,REMS）和非快速動(dòng)眼睡眠，前者表現(xiàn)為腦電圖與肌肉張力不同步和快速眼球運(yùn)動(dòng)，此階段睡眠中大腦活動(dòng)類似清醒狀態(tài)，交感神經(jīng)張力增加，血壓和心率隨之升高但肌肉松弛。人類隨著年齡增加，REMS時(shí)間逐漸縮短，睡眠效率降低，睡后覺醒增多[1]。近半數(shù)老年人存在慢性失眠[2]。研究表明：失眠與許多精神疾病相關(guān)，持續(xù)性失眠的老年患者患抑郁癥、認(rèn)知障礙等的風(fēng)險(xiǎn)增加[3-4]。行為療法和藥物療法是目前治療失眠的主要手段，所用藥物主要藥效學(xué)機(jī)制多與神經(jīng)遞質(zhì)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（hypothalamus-pituitary-adrenal cortex axis,HPA）激素相關(guān)，但多數(shù)藥物存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如苯二氮花罩類受體激動(dòng)劑通過作用于苯二氮花罩受體和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid receptors,GABA）受體打開氯離子通道，對(duì)中樞系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，具有抗焦慮、催眠鎮(zhèn)靜等作用，但可引起嗜睡、頭暈、頭痛、共濟(jì)失調(diào)等不良反應(yīng)[5]，因此需要療效相似但更加安全的藥物。唑吡坦是一種非苯二氮花罩類受體調(diào)節(jié)劑，具有改善睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間，減少短暫性失眠患者覺醒次數(shù)的作用[6]。本研究通過建立慢性睡眠剝奪老年失眠大鼠模型，探究唑吡坦對(duì)其神經(jīng)遞質(zhì)及HPA相關(guān)激素的影響，以期為臨床治療老年性失眠提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)SD大鼠，32周齡，體質(zhì)量350～400 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：ZJDXDWLL20210121L），符合3R原則。

1.1.2 主要藥品與試劑 酒石酸唑吡坦片購(gòu)自賽諾菲（杭州）制藥有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字：J20130015，規(guī)格：10 mg），艾司唑侖片購(gòu)自上海上藥信誼藥廠有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字：H31021534，規(guī)格：1 mg），多巴胺（dopamine,DA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司（批號(hào)分別為FN-EU0392、ER1463、EU2565），大鼠腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone,CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone,ACTH）、皮質(zhì)酮（cortisol,CORT）、ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司（批號(hào)分別為EK-R37071、EK-R37072、EK-R38929），蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司（批號(hào)：AR0146），5-羥色胺1A受體（5-hydroxytryptamine 1Arecrptor,5-HT1AR）、A型γ-氨基丁酸受體（γ-aminobutyric acid receptors type A receptor,GABAAR）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（批號(hào)分別為ab227165、ab92747）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、建模與干預(yù) 60只大鼠隨機(jī)分為環(huán)境對(duì)照組、模型組、唑吡坦低、中、高劑量組和陽性藥組，每組10只，采用花盆法復(fù)制慢性睡眠剝奪失眠老年大鼠模型[7-8]。準(zhǔn)備2種倒置花盆平臺(tái)裝置，中間凸起部分（平臺(tái)）直徑分別為6.5和12.5 cm，平臺(tái)周圍注滿水。除環(huán)境對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)在較大的平臺(tái)上外，其余組大鼠飼養(yǎng)在較小的平臺(tái)上，所有大鼠均可在平臺(tái)上自由活動(dòng)。裝置設(shè)有金屬籠蓋，籠蓋有凹槽可供大鼠自由攝食，大鼠每日在裝置中飼養(yǎng)18 h，剩余6 h轉(zhuǎn)至常規(guī)飼養(yǎng)籠具中正常喂養(yǎng)，持續(xù)21 d。第22天開始藥物干預(yù)，按照人與大鼠等效劑量比計(jì)算劑量，唑吡坦低、中、高劑量組大鼠分別為1/2、1、2倍大鼠等效劑量，即以0.52、1.05、2.10 mg/kg唑吡坦灌胃，陽性藥組大鼠以艾司唑侖0.50 mg/kg[9]灌胃，環(huán)境對(duì)照組和模型組大鼠以10 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，持續(xù)14 d。治療前、后對(duì)大鼠稱體質(zhì)量。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 藥物干預(yù)結(jié)束后通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。（1）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置中央，記錄5 min內(nèi)大鼠的運(yùn)動(dòng)距離和中央運(yùn)動(dòng)時(shí)間。（2）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第1～3天，將大鼠從隨機(jī)位置放入水中，記錄其找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期），若90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)，將時(shí)間記為90 s；第4天撤去平臺(tái)，將大鼠從原先平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)放入水中，記錄其進(jìn)入原先平臺(tái)所在象限的次數(shù)和停留時(shí)間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.3 腦系數(shù)計(jì)算 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血后，迅速取出全腦稱質(zhì)量，計(jì)算腦系數(shù)。腦系數(shù)=腦質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.4 下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)和血清HPA軸相關(guān)激素檢測(cè) 將稱量后的全腦置于冰上分離下丘腦，手動(dòng)勻漿；大鼠腹主動(dòng)脈血靜置2 h后，離心分離血清。采用ELISA法分別檢測(cè)下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT、NE和血清HPA軸相關(guān)激素CRH、ACTH、CORT水平。按照試劑盒方法在酶標(biāo)板中加入50 μl樣本和50 μl生物素化抗體工作液，37℃孵育45 min；洗板3次后加入100 μl工作液，37 ℃孵育30 min；洗板5次，加入90 μl底物溶液，37℃孵育15 min，加入50 μl工作終止液。測(cè)量450 nm下的吸光度，計(jì)算神經(jīng)遞質(zhì)和激素水平。

1.2.5 下丘腦5-HT1AR、GABAAR蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。下丘腦組織加入裂解液充分勻漿、水浴變形后，進(jìn)行蛋白定量，在電泳儀上進(jìn)行電泳和電轉(zhuǎn)。蛋白條帶膜在5%脫脂牛奶封閉1 h后，搖床漂洗條帶3次；4℃一抗孵育過夜，搖床漂洗條帶3次；二抗孵育2 h，搖床漂洗條帶3次。凝膠成像顯色，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠體質(zhì)量、腦系數(shù)比較 比較6組大鼠體質(zhì)量，環(huán)境對(duì)照組大鼠體質(zhì)量呈逐漸升高趨勢(shì)，其余各組呈先降低后升高趨勢(shì)；治療后唑吡坦中、高劑量組和陽性藥組大鼠體質(zhì)量均高于模型組（均P＜0.05）。與環(huán)境對(duì)照組比較，模型組大鼠腦系數(shù)降低（P＜0.05）；與模型組比較，唑吡坦中、高劑量組和陽性藥組大鼠腦系數(shù)均升高（均P＜0.05）。見表1。

表1 6組大鼠體質(zhì)量、腦系數(shù)變化

2.2 6組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)變化比較 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與環(huán)境對(duì)照組比較，模型組大鼠5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)距離和中央運(yùn)動(dòng)時(shí)間均升高（均P＜0.05）；與模型組比較，唑吡坦中、高劑量組和陽性藥組大鼠5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)距離和中央運(yùn)動(dòng)時(shí)間均降低（均P＜0.05）。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與環(huán)境對(duì)照組比較，模型組大鼠90 s內(nèi)逃避潛伏期延長(zhǎng)（P＜0.05），原平臺(tái)象限停留次數(shù)、停留時(shí)間均減少（均P＜0.05），與模型組比較，唑吡坦中、高劑量和陽性藥組大鼠90 s內(nèi)逃避潛伏期均縮短（均P＜0.05），原平臺(tái)象限停留次數(shù)、停留時(shí)間均增加（均P＜0.05）。見表2。

表2 6組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.3 6組大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)變化比較 與環(huán)境對(duì)照組比較，模型組大鼠下丘腦DA、NE質(zhì)量濃度升高（P＜0.05），5-HT質(zhì)量濃度降低（P＜0.05）。與模型組比較，唑吡坦中、高劑量組和陽性藥組大鼠下丘腦DA、NE質(zhì)量濃度降低（P＜0.05），5-HT質(zhì)量濃度升高（P＜0.05）。見表3。

表3 6組大鼠下丘腦DA、5-HT、NE變化比較（μg/L）

2.4 6組大鼠血清HPA相關(guān)激素水平變化比較 與環(huán)境對(duì)照組比較，模型組大鼠血清CRH、ACTH、CORT質(zhì)量濃度升高（P＜0.05）；與模型組比較，唑吡坦中、高劑量和陽性藥組大鼠血清CRH、ACTH、CORT質(zhì)量濃度降低（P＜0.05）。見表4。

表4 6組大鼠血清CRH、ACTH、CORT水平變化比較（μg/L）

2.5 6組大鼠下丘腦GABAAR、5-HT1AR蛋白表達(dá)變化比較 與環(huán)境對(duì)照組比較，模型組大鼠下丘腦GABAAR、5-HT1AR蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，唑吡坦中、高劑量組和陽性藥組大鼠下丘腦GABAAR、5-HT1AR蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 唑吡坦對(duì)大鼠下丘腦GABAAR、5-HT1AR蛋白表達(dá)變化的影響（a：GABAAR、5-HT1AR蛋白電泳圖；1-6依次為環(huán)境對(duì)照組、模型組、唑吡坦低劑量組、唑吡坦低中劑量組、唑吡坦高劑量組和陽性藥組。b：GABAAR、5-HT1AR蛋白相對(duì)表達(dá)量）

3 討論

睡眠受中樞系統(tǒng)主導(dǎo)的晝夜節(jié)律和機(jī)體動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)，在維持正常生理生理活動(dòng)中具有重要作用。自然衰老過程中，睡眠結(jié)構(gòu)和參數(shù)不斷變化，N1、N2睡眠階段占比和夜間清醒時(shí)間不斷增加，而睡眠效率、穩(wěn)態(tài)和慢波睡眠占比不斷降低[10]。研究表明：19～75歲，REMS比例呈線性下降，每10年下降0.6%[11]。實(shí)驗(yàn)性REMS剝奪可影響大腦中酶、代謝物、神經(jīng)遞質(zhì)以及導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白?；ㄅ璺ㄊ悄壳俺Ｓ玫腞EMS剝奪方法[12]。本研究采用花盆法建立老年失眠大鼠模型，21 d建模期后，大鼠體質(zhì)量和腦系數(shù)明顯降低，學(xué)習(xí)和記憶能力降低。表明老年大鼠在經(jīng)過慢性REMS剝奪后表現(xiàn)出異常興奮，動(dòng)物模型建立成功。

唑吡坦是一種非苯二氮花罩類藥物，通過與GABA受體復(fù)合體上的苯二氮花罩類結(jié)合起作用，引起神經(jīng)抑制并誘導(dǎo)睡眠，對(duì)GABAAR的α1亞型具有很高的親和力，半衰期短、起效較快。目前國(guó)外出現(xiàn)了有關(guān)其濫用傾向的報(bào)道[13]，但國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少；在規(guī)定劑量?jī)?nèi)，唑吡坦的濫用和依賴風(fēng)險(xiǎn)較低，相比阿普唑侖，唑吡坦在失眠癥上的治療效果更好，安全性更高[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)中、高劑量唑吡坦干預(yù)后，老年失眠大鼠體質(zhì)量和腦系數(shù)明顯高于模型組，學(xué)習(xí)和記憶能力顯著改善，與謝光璟等[16]研究結(jié)果類似。表明唑吡坦可改善老年慢性失眠大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

中樞神經(jīng)遞質(zhì)紊亂在失眠的復(fù)雜機(jī)制中具有重要作用，包括NE、DA、GABA和5-HT等在內(nèi)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)參與了睡眠調(diào)節(jié)[17]。5-HT主要分布于腦皮質(zhì)和神經(jīng)突觸，可作用于大腦中與睡眠和清醒控制相關(guān)的多個(gè)區(qū)域，抑制覺醒并延長(zhǎng)REMS，5-HT1AR是5-HT的受體[18-19]。DA主要分布于中腦腹側(cè)被蓋區(qū)和黑質(zhì)致密部，在清醒時(shí)逐漸升高[20]。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體GABAAR與睡眠相關(guān)，GABA與GABAAR結(jié)合對(duì)喚醒系統(tǒng)具有抑制作用。GABAAR是苯二氮卓類藥物、巴比妥類藥物等多種神經(jīng)類藥物的靶標(biāo)，參與神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病機(jī)制[21]。本研究中，老年慢性失眠大鼠下丘腦DA、NE質(zhì)量濃度升高，5-HT質(zhì)量濃度降低，GABAAR、5-HT1AR蛋白相對(duì)表達(dá)量降低；經(jīng)中、高劑量唑吡坦干預(yù)后均有所改善，與張利平[22]研究結(jié)果類似。表明唑吡坦可改善老年慢性失眠大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)紊亂。

HPA參與調(diào)節(jié)人體體內(nèi)平衡和應(yīng)激反應(yīng)，其功能障礙與失眠相關(guān)。研究表明：HPA功能障礙與CRH、ACTH和CORT水平提高有關(guān)[23]。HPA激活是一連串復(fù)雜過程，由下丘腦分泌的CRH可直接作用于垂體，促進(jìn)垂體分泌ACTH，ACTH可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素，而糖皮質(zhì)激素可對(duì)垂體和下丘腦產(chǎn)生反饋，進(jìn)而調(diào)整HPA[24]。因此，維持HPA軸穩(wěn)定對(duì)調(diào)節(jié)睡眠具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)：老年慢性失眠大鼠血清CRH、ACTH、CORT質(zhì)量濃度升高，經(jīng)唑吡坦干預(yù)后回落，與Dong等[25]的研究結(jié)果一致。表明唑吡坦可改善老年慢性失眠大鼠血清HPA相關(guān)激素水平。

綜上所述，唑吡坦對(duì)老年慢性睡眠剝奪失眠大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力和睡眠情況具有改善作用，可提升血清HPA相關(guān)激素水平，改善下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，上調(diào)下丘腦GABAAR、5-HT1AR蛋白表達(dá)。