李 晶，曾 玉，黃佳斯，程 翔，王剛強(qiáng)，黃德斌

(1.長沙市第三醫(yī)院a.檢驗(yàn)科；b.內(nèi)分泌科,長沙 410015；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科,西安 710000)

糖尿病視網(wǎng)膜病(DR)被認(rèn)為是獲得性視力障礙的最常見原因，占所有嚴(yán)重視力障礙病例的1.9%和所有失明病例的2.6%[1]。在血管改變之前，DR的臨床特征包括免疫細(xì)胞的數(shù)量增加，產(chǎn)生活性氧和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)死亡；這些特征與視神經(jīng)中巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)，導(dǎo)致髓鞘紊亂和神經(jīng)纖維數(shù)量減少[2]。P2X2嘌呤受體是陽離子選擇通道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，并在不同過程中起重要作用，包括肌肉收縮、心血管和呼吸系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及遞質(zhì)釋放[3]。最近的研究[3-5]證實(shí)P2X2嘌呤受體在視網(wǎng)膜疾病中的作用，包括視網(wǎng)膜脫離、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變和DR。嘌呤受體參與慢性炎癥，并且在糖尿病并發(fā)癥中也觀察到它們的上調(diào)[6]。然而，目前對于P2X2嘌呤受體在DR炎癥機(jī)制中的作用知之甚少。因此，本研究探討缺乏P2X2嘌呤受體對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)和視神經(jīng)炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

30只野生型(WT)和30只P2X2基因敲除(P2X2-/-)C57/Bl6小鼠(雄性，8周齡)購自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，將所有小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體、12 h明暗循環(huán)的環(huán)境中，隨意進(jìn)食和飲水。按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為正常WT組、正常P2X2-/-組、糖尿病WT組和糖尿病P2X2-/-組，每組各15只。

1.2 糖尿病誘導(dǎo)

糖尿病WT組和糖尿病P2X2-/-組建立糖尿病模型：通過單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma Aldrich公司，160 mg·kg-1體重)誘發(fā)。分別在血糖誘導(dǎo)前、STZ注射后1和8周，使用無糖Optium Neo(美國Abbott公司)評估血糖。血糖>16.7 mmol·L-1的動物被視為糖尿病。正常WT組、正常P2X2-/-組未接受STZ注射。分別在誘導(dǎo)糖尿病當(dāng)天、STZ注射后1和8周對每只動物稱重。

1.3 定量RT-PCR檢測視網(wǎng)膜P2X2 mRNA

分別在血糖誘導(dǎo)前、STZ注射后1和8周處死小鼠，解剖眼睛。將分離的視網(wǎng)膜浸入RNAlater穩(wěn)定劑(美國QIAGEN公司)中。使用QuantiTect Rev轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國QIAGEN公司)將RNA與隨機(jī)六聚體引物合成的第一鏈cDNA用作每個反應(yīng)的模板。使用MX3000p裝置(美國Stratagene公司)和SYBR Green Master mix(QIAGEN)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。為了標(biāo)準(zhǔn)化和定量，同時(shí)擴(kuò)增小鼠18S mRNA。PCR條件如下：95 ℃持續(xù)15 min，然后在94 ℃持續(xù)15 s，60 ℃持續(xù)30 s和72 ℃持續(xù)30 s，進(jìn)行46個循環(huán)。使用常規(guī)2-△△Ct方法計(jì)算目的基因的表達(dá)變化。每個樣品一式兩份運(yùn)行，以確保單個值的可靠性。引物采用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程股份有限公司合成：P2X2，F(xiàn)orward 5′-GCAGCGCTTAAC CATAGCGGAAAT-3′，Reverse 5′-CCAGTTGAAACGGTTCCCGATG-TT-3′；18S，F(xiàn)orward 5′-T CAACTTTCGATGGTAGTCGCCGT-3′，Reverse 5′-TCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCT-3′。

1.4 組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)分析

在STZ注射后8周，處死小鼠，取下眼睛，在4%多聚甲醛(美國Sigma Aldrich公司)中固定48 h。然后將其依次浸入5.0%、7.5%、10.0%和20.0%的葡萄糖溶液中，再用樹脂包埋。取10 μm切片并固定在經(jīng)多聚-L-賴氨酸包被載玻片上，分別進(jìn)行組織學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)分析。組織學(xué)檢查用蘇木精和伊紅(HE)染色，將染色部分通過分級的醇脫水，在二甲苯中澄清，并用中性脂覆蓋。用光學(xué)顯微鏡(德國Zeiss Axioplan公司)檢查切片。免疫組織化學(xué)分析方法：先用1 μg·μL-1生物素化山羊抗鼠IgG孵育切片20 min，然后在親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物工作液孵育30 min，最后在3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液中孵育5 min。用P2X2抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)分析P2X2免疫反應(yīng)性。

1.5 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)

用兔多克隆抗βⅢ微管蛋白(1:500；美國Abcam公司)免疫染色視網(wǎng)膜評估正常和糖尿病WT和P2X2-/-小鼠的RGC存活率。在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)內(nèi)，βⅢ微管蛋白僅在RGC中表達(dá)。在熒光照射(400×)下計(jì)數(shù)8個區(qū)域中的免疫陽性細(xì)胞，以量化每平方毫米RGC存活率。

1.6 視神經(jīng)免疫熒光分析

切片在0.1 mol·L-1PBS中洗滌3次，在室溫下封閉(含0.3%Triton X-100和10%驢血清的PBS)1 h，然后與兔多克隆抗IBA1抗體(1:250，美國Santa Cruz公司)孵育過夜。次日，切片與Alexa-Fluor 488山羊抗鼠次級抗體(1:500，美國Molecular Probes公司)孵育2 h，用DAPI(美國Molecular Probes公司)復(fù)染5 min。在激光掃描顯微鏡(LSM 510 META，德國Zeiss公司)上對染色進(jìn)行分析和記錄。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 糖尿病小鼠的血糖水平和體重變化

糖尿病誘導(dǎo)前2組小鼠的血糖水平均≤16.7 mmol·L-1，STZ注射后1和8周，糖尿病WT組和糖尿病P2X2-/-組小鼠的非空腹血糖水平均明顯升高且>16.7 mmol·L-1(P<0.001)。與誘導(dǎo)前比較，STZ注射后8周糖尿病WT組小鼠的體重顯著降低(P<0.01)，而糖尿病P2X2-/-組小鼠的體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 糖尿病小鼠的血糖和體重變化

2.2 WT小鼠DR過程中P2X2水平變化

免疫組織化學(xué)方法分析WT小鼠DR過程中P2X2在視網(wǎng)膜的分布顯示，P2X2主要位于視網(wǎng)膜GCL、內(nèi)核層(INL)和外核層(ONL)；與誘導(dǎo)前相比，糖尿病WT組在STZ注射后8周時(shí)視網(wǎng)膜中P2X2表達(dá)變得強(qiáng)烈(圖1)。qRT-PCR定量分析顯示，正常WT組小鼠在各觀察時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜中P2X2 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而糖尿病WT組小鼠在STZ注射后1、8周視網(wǎng)膜中P2X2 mRNA表達(dá)顯著高于誘導(dǎo)前和正常WT組(P<0.001)(表2)。

表2 qRT-PCR定量分析WT小鼠DR期間視網(wǎng)膜中P2X2 mRNA的水平變化

A：誘導(dǎo)前；B：STZ注射后8周。比例尺=75 μm。

2.3 P2X2缺乏對糖尿病視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)影響

通過HE評估WT和P2X2-/-小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)見圖2，對視網(wǎng)膜GCL的定性觀察顯示，與糖尿病WT組相比，糖尿病P2X2-/-組小鼠的RGC更多。形態(tài)學(xué)測量分析結(jié)果見表3：糖尿病WT組與糖尿病P2X2-/-組小鼠的視網(wǎng)膜總厚度及外叢狀層(OPL)、ONL、內(nèi)叢狀層(IPL)、INL的厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：糖尿病WT組；B：糖尿病P2X2-/-組。比例尺=50 μm。

表3 P2X2缺乏對小鼠糖尿病視網(wǎng)膜形態(tài)變化的影響

2.4 P2X2缺乏對糖尿病視網(wǎng)膜RGC的保護(hù)作用

用兔多克隆抗βⅢ微管蛋白對全視網(wǎng)膜進(jìn)行免疫染色，結(jié)果顯示，糖尿病顯著降低了WT小鼠視網(wǎng)膜中RGC的總數(shù)(P<0.05)，但不影響P2X2-/-小鼠視網(wǎng)膜中RGC的總數(shù)(圖3)。

A—D：正常WT組(A)、正常P2X2-/-組(B)和糖尿病WT組(C)、糖尿病P2X2-/-組(D)小鼠視網(wǎng)膜的βⅢ微管蛋白免疫染色；E：定量分析各組視網(wǎng)膜中RGC密度。比例尺=20 μm。*P<0.05與正常WT組相比；#P<0.05與糖尿病WT組相比。

2.5 P2X2缺乏對糖尿病視網(wǎng)膜炎癥的影響

與P2X2-/-小鼠相比，糖尿病顯著增加了WT小鼠視網(wǎng)膜中TLR4和IL-1β免疫反應(yīng)性(P<0.05)，并且TLR4和IL-1β表達(dá)集中在GCL和神經(jīng)纖維層(NFL)(圖4)。

A—B:糖尿病WT組和糖尿病P2X2-/-組小鼠視網(wǎng)膜的TLR4蛋白免疫染色(A)及定量分析TLR4熒光強(qiáng)度(B)。C—D：糖尿病WT組、糖尿病P2X2-/-組小鼠視網(wǎng)膜的IL-1β蛋白免疫染色(C)及定量分析IL-1β熒光強(qiáng)度(D)。比例尺=20 μm。*P<0.05與糖尿病WT組相比。藍(lán)色是hoechst33342染色。

2.6 P2X2缺乏對糖尿病小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

Iba1抗體染色檢測視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞含量結(jié)果顯示，與糖尿病WT組小鼠相比，糖尿病P2X2-/-組小鼠視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少(P<0.05)(圖5)。

A：小鼠視神經(jīng)Iba1染色的代表性顯微照片；B：Iba1染色面積百分比定量分析。*P<0.05與糖尿病WT組相比。比例尺：50 μm。

3 討論

P2X2嘌呤受體通過不同的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，分別減輕或增加周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)炎癥，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)結(jié)局[7-12]。然而，目前對于P2X2嘌呤受體在DR神經(jīng)炎癥機(jī)制中的作用知之甚少。本研究探討缺乏P2X2對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)和視神經(jīng)炎癥的影響，結(jié)果顯示糖尿病WT組與糖尿病P2X2-/-組小鼠的視網(wǎng)膜總厚度及OPL、ONL、IPL、INL的厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是糖尿病P2X2-/-組小鼠視網(wǎng)膜中顯示出更多的RGC，以及TLR4、IL-1β表達(dá)減少(P<0.05)，表明嘌呤途徑與DR神經(jīng)炎癥之間存在關(guān)聯(lián)，但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。糖尿病是一種常見的視力損害原因。本研究發(fā)現(xiàn)與糖尿病WT組小鼠相比，糖尿病P2X2-/-組小鼠的視神經(jīng)含有較少激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞主要極化為抗炎表型。TLR4的免疫反應(yīng)性增強(qiáng)可能與退化或脆弱的RGC有關(guān)。有研究[13]表明，糖尿病誘導(dǎo)TLR4介導(dǎo)的炎癥小體激活，包括含有NLRP1和NLRP3的pyrin結(jié)構(gòu)域，并激活視網(wǎng)膜中的IL-1β級聯(lián)。此外，TLR4基因缺失或藥物抑制顯著降低DR的RGC死亡和促炎反應(yīng)[14]。因此，筆者認(rèn)為P2X2和TLR4信號的激活對炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的DR中RGC變性至關(guān)重要。本研究在糖尿病P2X2-/-小鼠中觀察到IL-1β蛋白表達(dá)顯著減少也有力地支持了這一觀點(diǎn)。

P2X2受體是陽離子選擇性通道，對Na+和K+的通透性幾乎相等，對Ca2+的通透性顯著[15]。不同的功能研究[16]表明，P2X2受體存在于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰腺細(xì)胞和垂體細(xì)胞中。P2X2嘌呤受體似乎可以促進(jìn)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的星形細(xì)胞凋亡，這種促進(jìn)作用可以通過它們對ATP產(chǎn)生細(xì)胞外陽離子反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)[16]。此外，先前的研究[17]報(bào)道了一種通過抑制P2X2受體來促進(jìn)神經(jīng)元存活的新途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病WT組小鼠在STZ注射后1、8周的視網(wǎng)膜中P2X2 mRNA表達(dá)顯著高于誘導(dǎo)前水平。嘌呤受體可能以ATP依賴的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。糖尿病小鼠有更高的葡萄糖代謝，并增加ATP的生產(chǎn)。ATP還可能激活鄰近視網(wǎng)膜神經(jīng)元的P2受體，如光感受器、無長突細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[18]。另一方面，非糖尿病小鼠的P2X2表達(dá)較低。因此，筆者認(rèn)為糖尿病WT小鼠在STZ注射后出現(xiàn)的這些變化會導(dǎo)致嘌呤信號增強(qiáng)。

DR是糖尿病患者嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，越來越多的證據(jù)[19]表明，諸如氧化損傷和RGC死亡等神經(jīng)變化可能先于血管損傷。本研究結(jié)果表明在糖尿病WT和P2X2-/-小鼠的視網(wǎng)膜組織中沒有發(fā)現(xiàn)主要的組織學(xué)差異。然而，與糖尿病WT小鼠相比，糖尿病P2X2-/-小鼠視網(wǎng)膜中的RGC數(shù)量更高，與FERNANDEZ等[20]報(bào)道的結(jié)果一致：除了RGC會通過細(xì)胞凋亡而死亡，早期糖尿病不會引起視網(wǎng)膜改變。SZAB等[21]研究顯示糖尿病會導(dǎo)致嚙齒動物視網(wǎng)膜中發(fā)生離散變化，例如神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)性增加和小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，以及泌乳細(xì)胞和外部感光細(xì)胞減少。這些離散的變化可能無法通過本研究以及其他研究[20]的視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)分析來識別。RGC凋亡可能是由于糖尿病視網(wǎng)膜中巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞活化增加和氧化應(yīng)激所致[22]。P2X2參與神經(jīng)炎癥的作用已被其他研究者[3]提出。P2X2的上調(diào)抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活，而選擇性拮抗劑增強(qiáng)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的這種作用[16]。這些發(fā)現(xiàn)支持P2X2在神經(jīng)炎性損傷中作用的觀點(diǎn)。因此，研究P2X2缺失是否可以減弱視網(wǎng)膜炎癥引起的RGC凋亡具有重要意義，進(jìn)而將有助于延緩DR的發(fā)展。

總之，本研究結(jié)果證明了P2X2在糖尿病早期視網(wǎng)膜和視神經(jīng)炎性損傷中的作用，表明P2X2可能是一個有吸引力的藥物靶點(diǎn)?？蔀镻2X2抑制劑治療糖尿病視覺并發(fā)癥的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。