孫 穎，張莉莉，張玉玉，孫寶國(guó)，陳海濤

（北京工商大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100048）

5-羥甲基糠醛是食品在熱處理、發(fā)酵等加工過(guò)程中形成的內(nèi)源性毒素[1]。果汁[2]、咖啡[3]、啤酒[4]、面包[5]、黑蒜[6]、醋[7]等食品中均含有5-羥甲基糠醛。在肉味香精的生產(chǎn)過(guò)程中可通過(guò)焦糖化反應(yīng)和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，進(jìn)而對(duì)肉味香精的外觀品質(zhì)與內(nèi)在質(zhì)量產(chǎn)生一定程度的損害。美拉德反應(yīng)是由還原糖和氨基酸或蛋白質(zhì)中的氨基在一定條件下發(fā)生的一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，是熱加工食品中風(fēng)味和色澤產(chǎn)生的重要途徑[8]。在美拉德反應(yīng)途徑中，游離氨基酸或者蛋白質(zhì)中的氨基與還原糖結(jié)合形成Amadori 產(chǎn)物，再異構(gòu)為烯醇式，然后脫去整個(gè)氨基[9]。5-羥甲基糠醛也是焦糖化反應(yīng)中一類重要的熱解產(chǎn)物，在葡萄糖注射液的高壓滅菌和儲(chǔ)存過(guò)程中，或糖含量高的食品（如蜂蜜、甜酒、甜面醬等）的儲(chǔ)存過(guò)程中，都會(huì)產(chǎn)生糠醛和5-羥甲基糠醛。糖類物質(zhì)發(fā)生焦糖化反應(yīng)產(chǎn)生的糠醛、羥甲基糠醛等中間物質(zhì)，可進(jìn)一步反應(yīng)生成醇類、烴類、呋喃衍生物及羰基化合物，而其中二羰基和三羰基化合物參與的Strecker 降解反應(yīng)及呋喃衍生物與H2S 的反應(yīng)，均會(huì)產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)[10-11]。一般認(rèn)為糠醛反應(yīng)的底物是單糖化合物，然而，陸續(xù)有相關(guān)研究報(bào)道了不同的結(jié)果：在高于250 ℃的條件下烘烤餅干，若將葡萄糖或果糖置換為蔗糖，則會(huì)產(chǎn)生大量的5-羥甲基糠醛，這可能是由于蔗糖在高溫條件下產(chǎn)生了具有較高活性的呋喃果糖基離子[12-13]。5-羥甲基糠醛的形成速度受加熱時(shí)間和溫度的影響，動(dòng)力學(xué)模型能夠反映化學(xué)反應(yīng)速度的快慢和產(chǎn)物形成的規(guī)律，如米酒、蜂蜜和曲奇餅干等[14-16]。Ameur 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，曲奇餅中5-羥甲基糠醛的形成符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。在低于250 ℃時(shí)，添加蔗糖的曲奇餅中5-羥甲基糠醛的形成量遠(yuǎn)低于添加葡萄糖和果糖的曲奇餅。在單糖溶液體系中，葡萄糖、果糖和半乳糖在加熱溫度為80，100，120 ℃時(shí)，為一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型[18]。在雙糖溶液體系中，乳糖、蔗糖和麥芽糖在加熱溫度為80，100，120 ℃時(shí)，為零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型[19]。在蛋糕的烘焙過(guò)程中，隨著烘烤溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，5-羥甲基糠醛的含量與蛋糕的pH 值成反比，為一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型[20]。阮衛(wèi)紅等[21]發(fā)現(xiàn)在熱處理80，90，100 ℃條件下，5-羥甲基糠醛的含量在桃汁中持續(xù)增大，為零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型（R2＞0.905）。卜利偉等[22-23]發(fā)現(xiàn)5-羥甲基糠醛為黑蒜的主要呈色物質(zhì)之一，在70～90 ℃條件下加工，加工時(shí)間和5-羥甲基糠醛含量的函數(shù)關(guān)系為一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。還有研究發(fā)現(xiàn)氨基酸種類會(huì)影響5-羥甲基糠醛形成的速度，天門冬氨酸-葡萄糖體系要比甘氨酸-葡萄糖體系的速率常數(shù)k 值大得多[24]。

谷氨酸是肉類及其酶解液中廣泛存在的一種酸性氨基酸，具有一定的鮮味，可用來(lái)提升肉制品的滋味[25]。含有谷氨酸的鮮味肽呈鮮效果尤為明顯，鮮味肽作為一種可增強(qiáng)食物鮮味和醇厚味的呈味肽，具有良好的加工特性、呈鮮效果以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，符合“天然、營(yíng)養(yǎng)、安全”的食品發(fā)展潮流。其不僅可直接增強(qiáng)食物的鮮美口感，還可作為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體物參與美拉德反應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)食品的特征香味[26]。谷氨酸被廣泛應(yīng)用于各類肉味香精的制備。在反應(yīng)過(guò)程中，谷氨酸對(duì)5-羥甲基糠醛的積累具有明顯的促進(jìn)作用。有研究發(fā)現(xiàn)氨基酸的二肽、三肽形式比其自身具有更高的反應(yīng)活性，小分子肽對(duì)于5-羥甲基糠醛的積累作用顯著[27]。

目前對(duì)肉味香精制備過(guò)程中糖-肽體系中5-羥甲基糠醛形成的動(dòng)力學(xué)研究較少。本試驗(yàn)以葡萄糖-谷氨酸二肽為對(duì)象，對(duì)糖-肽體系中反應(yīng)物（葡萄糖、谷氨酸二肽）及反應(yīng)產(chǎn)物（5-羥甲基糠醛）的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，揭示其形成5-羥甲基糠醛的動(dòng)力學(xué)特征，反映化學(xué)反應(yīng)的速度快慢和產(chǎn)物的形成規(guī)律，旨在為熱加工香精中5-羥甲基糠醛的形成提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷氨酸二肽（純度＞95%，分析純），浙江昂拓萊司生物技術(shù)有限公司；乙腈、三氟乙酸（色譜純），賽默飛世爾科技公司；5-羥甲基糠醛（色譜純），美國(guó)西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制（Milli-Q Integral 5 系統(tǒng)）；0.45 μm 尼龍濾膜，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity 液相色譜儀，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；Venusil XBP-C18 色譜柱（粒徑5 μm、孔徑100 ?、規(guī)格4.6 mm×250 mm），天津博納艾杰爾科技有限公司；Innoval NH2色譜柱（粒徑5 μm、孔徑100 ?、規(guī)格4.6 mm×250 mm）、Venusil XBP-C18（L）色譜柱（粒徑5 μm、孔徑150 ?、規(guī)格4.6 mm×150 mm），天津博納艾杰爾科技有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；T-403 數(shù)字電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型體系的制備 準(zhǔn)確稱取谷氨酸二肽0.4362 g、葡萄糖0.2973 g，溶解（超純水）并定容至50 mL 容量瓶中，配置成0.03 mol/L 溶液。將溶液轉(zhuǎn)移至四口燒瓶中，油浴恒溫加熱，反應(yīng)結(jié)束后迅速冷卻，放置于4 ℃遮光保存，濾膜過(guò)濾后進(jìn)儀器檢測(cè)分析。糖-肽模型體系動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Dynamic test design

1.3.2 葡萄糖含量的測(cè)定 液相色譜條件為：In noval NH2色譜柱（粒徑5 μm、孔徑100 ?、規(guī)格4.6 mm×250 mm）；柱溫30 ℃；RI 檢測(cè)器（40 ℃）；流動(dòng)相為80%乙腈水溶液，等梯度洗脫；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣20 μL。葡萄糖標(biāo)品和樣品的液相色譜圖如圖1、圖2所示。

圖1 標(biāo)品中葡萄糖的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of glucose standard

圖2 樣品中葡萄糖的液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of glucose in the sample

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)品0.7000 g，在燒杯中溶解（超純水）后加入容量瓶中，定容至50 mL 得到14.0 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分別將儲(chǔ)備液用超純水稀釋為14.0，12.0，9.6，7，4.67，1.5556，0.5185，0.1728，0.0576 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，最后用乙腈溶液將9 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋2 倍，得最終標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為7.0，6.0，4.8，3.5，2.3333，0.7778，0.2593，0.0864，0.0288 mg/mL。濾膜過(guò)濾后進(jìn)儀器分析，重復(fù)進(jìn)樣3 次。以葡萄糖的濃度和對(duì)應(yīng)色譜峰面積的數(shù)據(jù)作圖，得葡萄糖濃度與其峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

葡萄糖濃度與其峰面積的線性關(guān)系如圖3所示，線性回歸方程為：y=190500x-8095.4，R2=0.9994。由圖3可得出，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.0288-7.0 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

圖3 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of glucose

樣品的測(cè)定：取1 mL 熱反應(yīng)溶液，加入1 mL乙腈，振蕩混勻后靜置1 min，濾膜過(guò)濾后進(jìn)儀器檢測(cè)分析。

1.3.3 谷氨酸二肽含量的測(cè)定 測(cè)定條件：色譜條件：Venusil XBP-C18（L）色譜柱（粒徑5 μm、孔徑150 ?、規(guī)格4.6 mm×150 mm）；柱溫為30 ℃；DAD 檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流動(dòng)相為0.05%三氟乙酸水溶液，等梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣20 μL；檢測(cè)5 min。標(biāo)品和樣品中谷氨酸二肽的液相色譜圖如圖4、圖5所示。

圖4 標(biāo)品中谷氨酸二肽的液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatogram of glutamate dipeptide in standard

圖5 樣品中谷氨酸二肽的液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of glutamate dipeptide in the sample

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確稱取谷氨酸二肽標(biāo)品0.1500 g，在燒杯中溶解（超純水）后加入容量瓶中，定容至10 mL，得到15 mg/mL 的谷氨酸二肽標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分別將儲(chǔ)備液稀釋為7.5，5.0，3.0，1.5，0.5，0.15，0.015，0.005，0.0015 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用濾膜過(guò)濾后進(jìn)儀器檢測(cè)分析，重復(fù)3 次進(jìn)樣。以谷氨酸二肽濃度和對(duì)應(yīng)色譜峰面積作圖，得谷氨酸二肽濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

谷氨酸二肽濃度與峰面積的線性關(guān)系，如圖6所示，線性回歸方程為：y=6655.4x+755.77，R2=0.9943。由圖6可知，谷氨酸二肽在0.0015～7.50 mg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

圖6 谷氨酸二肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of glutamate dipeptide

樣品的測(cè)定：將熱反應(yīng)制得的樣品放置于4 ℃遮光處，濾膜過(guò)濾后進(jìn)儀器測(cè)定分析。

1.3.4 5-羥甲基糠醛含量的測(cè)定 測(cè)定條件：色譜條件：Venusil XBP-C18 色譜柱（粒徑5 μm、孔徑100 ?、規(guī)格4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：甲醇-水（5 ∶95，V/V），等梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)25 min。葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中5-羥甲基糠醛測(cè)定的液相色譜圖如圖7所示。

圖7 葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中5-羥甲基糠醛液相色譜圖Fig.7 Liquid chromatogram of 5-hydroxymethyl furfural in glucose-glutamate dipeptide sample

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確稱取5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品0.0286 g，在燒杯中溶解（超純水）后，倒入容量瓶中并定容至100 mL，得286 μg/mL 的5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分別將儲(chǔ)備液稀釋為71.5，57.2，28.6，11.44，2.288，0.4576，0.2288，0.0730，0.0365 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。0.45 μm 濾膜過(guò)濾后用高效液相色譜檢測(cè)分析，重復(fù)進(jìn)樣3 次，取平均值。以5-羥甲基糠醛濃度和對(duì)應(yīng)色譜峰面積作圖，得濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測(cè)定：將熱反應(yīng)制得的樣品于4 ℃遮光存放，0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，進(jìn)高效液相色譜檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱過(guò)程中葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)分析

圖8為不同加熱時(shí)間和溫度對(duì)葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中葡萄糖消耗的影響，如表8為葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果。

圖8 不同加熱時(shí)間和溫度對(duì)葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中葡萄糖消耗的影響Fig.8 Effect of different heating time and temperature on glucose consumption in glucose-glutamate dipeptide samples

由圖8可以看出在葡萄糖-谷氨酸二肽模型體系中，初始反應(yīng)物葡萄糖的含量與加熱時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。在未加熱的體系中，葡萄糖的含量為（5.59±0.06）mg/mL，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)條件中5 個(gè)溫度下葡萄糖的含量均出現(xiàn)不同程度的降低趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)條件高于95 ℃，1 h 時(shí)，葡萄糖的消耗速度明顯加快。

在體系溫度為90 ℃時(shí)，體系中葡萄糖含量由（5.60±0.08）mg/mL（1 h）逐漸降低至（5.09±0.03）mg/mL（6 h），當(dāng)加熱由1 h 增加到2 h 時(shí)，樣品中葡萄糖的含量出現(xiàn)明顯的消耗（P＜0.05），隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，樣品中葡萄糖的消耗并不顯著（P＞0.05）。最長(zhǎng)加熱時(shí)間條件（6 h）下，體系中葡萄糖含量消耗了9.15%，對(duì)90 ℃（0～6 h）時(shí)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析（表2）可知，7 個(gè)加熱時(shí)間條件下，對(duì)葡萄糖含量的擬合相關(guān)系數(shù)為0.8734，葡萄糖消耗的速率常數(shù)為0.0170。

在體系溫度為95 ℃時(shí)，體系中葡萄糖含量由（5.50±0.19）mg/mL（1 h）逐漸減少至（4.65±0.05）mg/mL（6 h），隨著溫度由90 ℃升高至95 ℃，體系中葡萄糖含量相比90 ℃（6 h） 時(shí)降低增加了7.85%，對(duì)95 ℃（0～6 h）時(shí)所得葡萄糖數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析（表2），發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)條件下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)葡萄糖的消耗擬合效果較好，消耗的速率常數(shù)為0.0320，對(duì)Af、Bf、SS、RMSE 進(jìn)行計(jì)算發(fā)現(xiàn)模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合效果較好，且數(shù)據(jù)的精確性較好（R2=0.9686）。

在體系溫度為100 ℃時(shí)，體系中葡萄糖的含量由（5.39±0.03）mg/mL（1 h）降低至（4.64 ± 0.05）mg/mL（6 h），當(dāng)加熱時(shí)間由0 h 增加至3 h 時(shí)，樣品中葡萄糖的消耗增多（P＜0.05），當(dāng)加熱溫度為4～5 h 時(shí)，體系中葡萄糖未出現(xiàn)顯著消耗（P＞0.05），當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，樣品中葡萄糖消耗顯著（P＜0.05）。對(duì)100 ℃（0～6 h）時(shí)樣品中的葡萄糖含量進(jìn)行分析（表2），發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)條件下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)葡萄糖的消耗擬合效果較好，消耗的速率常數(shù)為0.0310，且模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合效果及數(shù)據(jù)的精確性均較好（R2=0.9722）。

在體系溫度為105 ℃時(shí)，體系中葡萄糖的含量由（5.35±0.36）mg/mL（1 h）降低至（4.51±0.02）mg/mL（6 h），在該試驗(yàn)條件下，葡萄糖的消耗為19.36%。對(duì)105 ℃（0～6 h）時(shí)所得的葡萄糖數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析（表2），發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)條件下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)葡萄糖的消耗擬合效果較好，消耗的速率常數(shù)為0.0340，模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合效果及數(shù)據(jù)的精確性均較好（R2=0.9700）。

在體系溫度為110 ℃時(shí)，體系中葡萄糖的含量由（5.16±0.30）mg/mL（1 h）降低至（3.58±0.05）mg/mL（6 h），在該試驗(yàn)條件下，葡萄糖的消耗達(dá)到36.08%。對(duì)110 ℃（0～6 h）時(shí)的葡萄糖數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析（表2）可知，一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)葡萄糖含量的的擬合相關(guān)系數(shù)為0.7467，葡萄糖消耗的速率常數(shù)為0.0550，葡萄糖的消耗量最多。

表2 葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)分析Table 2 Kinetic analysis of glucose consumption in glucose-glutamate dipeptide samples

在90～110 ℃時(shí)，葡萄糖的消耗速率常數(shù)整體上呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且溫度越高，速率常數(shù)越大[28]。Kavousi 等[29]對(duì)單一葡萄糖溶液中葡萄糖的消耗動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)時(shí)間和溫度的增加均可促進(jìn)葡萄糖的消耗。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，溫度、時(shí)間均對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化為5-羥甲基糠醛的促進(jìn)作用顯著，且在110 ℃，6 h 時(shí)葡萄糖的消耗量達(dá)到最高值。當(dāng)加熱時(shí)間在2～5 h 時(shí)，葡萄糖的消耗速率較緩，但當(dāng)5～6 h 葡萄糖的消耗量達(dá)到頂峰，因此可以將反應(yīng)時(shí)間控制在5 h 以內(nèi)。

2.2 加熱過(guò)程中谷氨酸二肽消耗的動(dòng)力學(xué)分析

圖9為不同加熱時(shí)間和溫度對(duì)葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中谷氨酸二肽消耗的影響，表3為葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中谷氨酸二肽消耗的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果。

由圖9可以看出在葡萄糖-谷氨酸二肽模型體系中，初始反應(yīng)物谷氨酸二肽的含量與加熱時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。在未加熱的體系中，谷氨酸二肽的含量為（7.92±0.02）mg/mL，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，試驗(yàn)條件中5 個(gè)溫度下谷氨酸二肽均出現(xiàn)不同程度的消耗。

在體系溫度為90 ℃時(shí)，樣品中谷氨酸二肽的含量隨時(shí)間增加由（7.85±0.03）mg/mL（1 h）顯著降低至（4.47±0.01）mg/mL（6 h）（P＜0.05），當(dāng)加熱6 h時(shí)，體系中谷氨酸二肽的消耗率為43.56%。所以在較低溫度（90 ℃）時(shí)，即使延長(zhǎng)加熱時(shí)間，谷氨酸二肽的消耗量也沒(méi)有顯著增加。對(duì)其動(dòng)力學(xué)分析進(jìn)行分析（表3）發(fā)現(xiàn)，90 ℃試驗(yàn)條件下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)谷氨酸二肽的消耗擬合效果較好，速率常數(shù)為0.0960。一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)90 ℃（0～6 h）體系中谷氨酸二肽含量的擬合度較高（RMSE=0.3688，Af=1.1022），且該一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型描述谷氨酸二肽數(shù)據(jù)的精確性較好（R2=0.9364）。

在體系溫度為95 ℃時(shí)，樣品中谷氨酸二肽含量在加熱時(shí)間小于1 h 時(shí)消耗較慢，加熱1 h 時(shí)，谷氨酸二肽的消耗量為0.83%。隨著加熱時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，體系中谷氨酸二肽的消耗逐漸增大，由（7.85±0.03）mg/mL（1 h）顯著降低至（3.43±0.00）mg/mL（6 h）（P＜0.05），6 h 時(shí)，谷氨酸二肽的消耗量達(dá)到最大值，為56.75%，與90 ℃（6 h）相比，谷氨酸二肽的消耗量增長(zhǎng)了13.19%。由表3可得，95 ℃試驗(yàn)條件下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)谷氨酸二肽的消耗擬合效果較好，速率常數(shù)為0.1520，對(duì)擬合模型進(jìn)行評(píng)價(jià)得出，該模型對(duì)95 ℃（0～6 h）體系中谷氨酸二肽含量的擬合度較高（RMSE=0.3373，Af=1.0739），且該一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型描述谷氨酸二肽數(shù)據(jù)的精確性較好（R2=0.9821）。

在100 ℃（1 h）加熱時(shí)，樣品中谷氨酸二肽的含量為（6.73±0.02）mg/mL，隨著加熱時(shí)間的不斷延長(zhǎng)逐漸減少至（2.10±0.00）mg/mL（6 h）（P＜0.05）。在0～6 h 的考察范圍內(nèi)，當(dāng)加熱時(shí)間由1 h增加至2 h 時(shí)，體系中谷氨酸二肽的消耗速率最快，當(dāng)加熱時(shí)間大于2 h 時(shí)，其消耗速率逐漸降低，加熱時(shí)間為6 h 時(shí)，谷氨酸二肽的最終消耗量為73.51%。與95 ℃（6 h）相比，谷氨酸二肽的消耗量增長(zhǎng)了16.76%。由表3可得，100 ℃試驗(yàn)條件下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)谷氨酸二肽的消耗擬合效果較好，速率常數(shù)為0.2270，對(duì)擬合模型進(jìn)行評(píng)價(jià)得出，該模型對(duì)100 ℃（0～6 h）體系中谷氨酸二肽含量的擬合度較高（RMSE=0.2125，Af=1.0703），且該一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型描述谷氨酸二肽數(shù)據(jù)的精確性較好（R2=0.9935）。

在體系溫度為105 ℃（1 h）時(shí)，樣品中谷氨酸二肽的含量為（6.33±0.02）mg/mL，隨著加熱時(shí)間的不斷延長(zhǎng)其含量逐漸降低至（1.63±0.00）mg/mL（6 h）（P＜0.05）。當(dāng)加熱時(shí)間為1～2 h 時(shí)，谷氨酸二肽呈現(xiàn)最大消耗速率，當(dāng)加熱時(shí)間為6 h 時(shí)，體系中谷氨酸二肽的消耗率為79.43%，與100 ℃（6 h）相比，谷氨酸二肽的消耗量增長(zhǎng)了5.92%。由表3可得，105 ℃試驗(yàn)條件下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)谷氨酸二肽的消耗擬合效果較好，速率常數(shù)為0.2700，對(duì)擬合模型進(jìn)行評(píng)價(jià)得出，該模型對(duì)105 ℃（0～6 h）體系中谷氨酸二肽含量的擬合度和精確性均較好（RMSE=0.3440，Af=1.1625，R2=0.9824）。

表3 葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中谷氨酸二肽消耗的動(dòng)力學(xué)分析Table 3 Kinetic analysis of glutamate dipeptide consumption in glucose-glutamate dipeptide samples

在體系溫度為110 ℃時(shí)，隨著加熱時(shí)間的不斷延長(zhǎng)體系中谷氨酸二肽的含量由（6.27±0.00）mg/mL，逐漸降低至（1.59±0.00）mg/mL（6 h）（P＜0.05），當(dāng)加熱時(shí)間為1～2 h 時(shí)，體系中谷氨酸二肽的消耗速率最快，當(dāng)加熱時(shí)間大于2 h 時(shí)，消耗速率明顯降低。當(dāng)加熱時(shí)間為6 h 時(shí)，谷氨酸二肽的消耗量達(dá)到最大值，為79.93%，與105 ℃（6 h）相比，僅增長(zhǎng)了0.50%。由表3可得，110 ℃試驗(yàn)條件下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)谷氨酸二肽的消耗擬合效果較好，速率常數(shù)為0.2750，對(duì)擬合模型進(jìn)行評(píng)價(jià)得出，該模型對(duì)110 ℃（0～6 h）體系中谷氨酸二肽含量的擬合度和精確性均較好。

試驗(yàn)條件下，體系中谷氨酸二肽的消耗量分別 為43.56%（90 ℃，0～6 h），56.75%（95 ℃，0～6 h），73.51%（100 ℃，0～6 h），79.43%（105 ℃，0～6 h）和79.93%（110 ℃，0～6 h），由分析可知，當(dāng)加熱溫度為90～100 ℃時(shí)，谷氨酸二肽的最終消耗量隨溫度變化趨勢(shì)明顯，當(dāng)在高于100 ℃反應(yīng)時(shí)，谷氨酸二肽的最終消耗量逐漸趨于定值，且當(dāng)體系加熱溫度大于90 ℃，谷氨酸二肽均在加熱時(shí)間為1～2 h 時(shí)出現(xiàn)最大消耗速率，此時(shí)成為體系反應(yīng)的關(guān)鍵階段。解怡[30]對(duì)葡萄糖-甘氨酸二肽在420 nm處的吸光度進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)葡萄糖-甘氨酸二肽體系的褐變程度影響較大。

2.3 加熱過(guò)程中5-羥甲基糠醛形成的動(dòng)力學(xué)分析

圖10為不同加熱時(shí)間和溫度對(duì)葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中5-羥甲基糠醛累積的影響，表4為葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中5-羥甲基糠醛積累的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果。

由圖10可以看出在葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中，5 個(gè)試驗(yàn)溫度下，5-羥甲基糠醛的積累量與時(shí)間變化一致。在未加熱的體系中，無(wú)5-羥甲基糠醛，此后樣品中5-羥甲基糠醛隨溫度和時(shí)間的增加均出現(xiàn)不同程度的積累。

圖10 不同加熱時(shí)間和溫度對(duì)葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中5-羥甲基糠醛累積的影響Fig.10 Effect of different heating time and temperature on accumulation of 5-hydroxymethylfurfural in glucose-glutamate dipeptide samples

當(dāng)體系溫度為90 ℃時(shí)，樣品中5-羥甲基糠醛的含量由（0.09±0.00）μg/mL（1 h）增至（3.31±0.01）μg/mL（6 h）。加熱時(shí)間為5～6 h 時(shí)，體系中5-羥甲基糠醛的累積最快，其質(zhì)量濃度增加了0.82 μg/mL。經(jīng)模型擬合（表4）發(fā)現(xiàn)，零級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)擬合曲線的決定系數(shù)較高（R2=0.9819）且RMSE 值較?。?.1591），實(shí)際測(cè)量值與模型的預(yù)測(cè)值的偏離度較大（Af=5.8579，SS=16.9415），總體來(lái)說(shuō)，零級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)其擬合效果良好。

當(dāng)體系溫度為95 ℃時(shí)，體系中5-羥甲基糠醛的含量由（0.18±0.00）μg/mL（1 h）增加至（5.93±0.01）μg/mL（6 h），且增長(zhǎng)明顯（P＜0.05）。當(dāng)加熱時(shí)間為5～6 h 時(shí)，體系中5-羥甲基糠醛出現(xiàn)最快增長(zhǎng)速率，增長(zhǎng)量為1.95 μg/mL。經(jīng)模型擬合（表4）發(fā)現(xiàn)，零級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)的擬合效果較好（R2=0.9716，RMSE=0.3526），實(shí)際測(cè)定值略低于模型預(yù)測(cè)值（Bf=0.8733），整體偏離度較?。⊿S=0.3081）。

當(dāng)體系溫度為100 ℃時(shí)，體系中5-羥甲基糠醛的含量由（0.20±0.01）μg/mL（1 h）增至（34.54±0.16）μg/mL（6 h），且增長(zhǎng)明顯（P＜0.05）。當(dāng)加熱時(shí)間為5～6 h 時(shí)，體系中5-羥甲基糠醛出現(xiàn)最大增長(zhǎng)速率（22.80 μg/mL/h），該累積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體系在90～95 ℃溫度下的最大增長(zhǎng)量。經(jīng)模型擬合（表4）發(fā)現(xiàn)，100 ℃時(shí)一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)的擬合效果較好（R2=0.9617，RMSE=1.2777）。

當(dāng)體系溫度為105 ℃時(shí)，體系中5-羥甲基糠醛的含量由（1.66±0.02）μg/mL（1 h）增加至（64.53±0.03）μg/mL（6 h）。當(dāng)加熱時(shí)間為5～6 h時(shí)，體系中5-羥甲基糠醛出現(xiàn)最大增長(zhǎng)速率，為19.65 μg/mL/h。經(jīng)模型擬合（表4）發(fā)現(xiàn)，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合時(shí)的擬合效果良好。

當(dāng)體系溫度為110 ℃時(shí)，體系中5-羥甲基糠醛的含量由（1.68±0.03）μg/mL（1 h） 增加至（94.69±0.55）μg/mL（6 h）。當(dāng)加熱時(shí)間為5～6 h時(shí)，體系中5-羥甲基糠醛出現(xiàn)最大增長(zhǎng)速率，為39.24 μg/mL/h。經(jīng)模型擬合（表4）發(fā)現(xiàn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行擬合時(shí)效果較好。

表4 葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中5-羥甲基糠醛積累的動(dòng)力學(xué)分析Table 4 Kinetic analysis of 5-hydroxymethyl furfural accumulation in glucose-glutamate dipeptide samples

葡萄糖-谷氨酸二肽樣品在90～110 ℃時(shí)，5-羥甲基糠醛的形成均隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)（P＜0.05），且體系中的5-羥甲基糠醛均在加熱時(shí)間為5～6 h 時(shí)出現(xiàn)最大累積量。當(dāng)加熱溫度為90～95 ℃時(shí)，零級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)樣品中5-羥甲基糠醛的擬合效果較好；隨著溫度的進(jìn)一步提高（100～110 ℃），5-羥甲基糠醛呈指數(shù)累積。葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中5-羥甲基糠醛的含量隨溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)也呈現(xiàn)顯著的增長(zhǎng)趨勢(shì)（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖-谷氨酸二肽體系的速率常數(shù)高于葡萄糖-谷氨酸體系。因?yàn)轸然诖呋肿觾?nèi)反應(yīng)時(shí)具有顯著的效果，谷氨酸二肽側(cè)鏈中的羧酸殘基數(shù)量比谷氨酸中多，體系具有更低pH 值，從而使得葡萄糖-谷氨酸二肽模型體系具有更高的反應(yīng)速率[31]。Kok 等[32]建立了葡萄糖-甘氨酸二肽模型，對(duì)模型的反應(yīng)速率進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，糖-二肽體系的反應(yīng)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于糖-氨基酸體系。因此在葡萄糖-谷氨酸二肽模型體系中，反應(yīng)溫度高于100 ℃，反應(yīng)時(shí)間超過(guò)5 h，反應(yīng)速率明顯增加，5-羥甲基糠醛的生成量增長(zhǎng)較快。肉味香精在制備中采用“味料同源”的生產(chǎn)理念，將肉中的大分子蛋白進(jìn)行酶解，以釋放更多物質(zhì)來(lái)豐富香精產(chǎn)品的滋味輪廓，然而與氨基酸相比，肽段更易與還原糖作用，生成5-羥甲基糠醛，因此有效酶解在肉味香精制備過(guò)程中尤為重要，可以有效降低5-羥甲基糠醛的形成。

3 結(jié)論

對(duì)葡萄糖-谷氨酸二肽模型體系中兩種反應(yīng)物（葡萄糖、谷氨酸二肽）的消耗及反應(yīng)產(chǎn)物5-羥甲基糠醛的形成進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。結(jié)果顯示：在試驗(yàn)條件90～110 ℃（0～6 h）5 個(gè)溫度梯度下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)樣品中反應(yīng)物葡萄糖和谷氨酸二肽的消耗擬合效果較好，且消耗速率不斷增大。在試驗(yàn)條件90，95 ℃（1～6 h）溫度梯度下，零級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)葡萄糖-谷氨酸二肽樣品中5-羥甲基糠醛的擬合效果良好，100，105 和110 ℃（1～6 h）時(shí)，一級(jí)動(dòng)力學(xué)對(duì)其擬合效果較好。加熱時(shí)間和加熱溫度對(duì)葡萄糖、谷氨酸二肽的消耗和5-羥甲基糠醛的生成影響較大。所以，在香精的加工過(guò)程中，熱處理溫度低于100 ℃，熱處理時(shí)間短于5 h，以及用氨基酸代替二肽與糖反應(yīng)，可以有效降低5-羥甲基糠醛的形成。