翟少欽，閆志強(qiáng)，陳春林，朱買勛，唐紅梅，付文貴*

柔嫩艾美耳球蟲感染對雞盲腸菌群的影響

翟少欽1,2，閆志強(qiáng)1，陳春林1，朱買勛1，唐紅梅1，付文貴1,2*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

將60只健康羅曼粉雞隨機(jī)分為正常組和模型組，每組30只，模型組灌服1×104個(gè)孢子化卵囊進(jìn)行人工復(fù)制雞球蟲病模型，正常組灌服等體積生理鹽水，感染5 d，剖殺試驗(yàn)雞，無菌采集雞盲腸內(nèi)容物，并通過Illumina PE250型高通量測序儀對肉雞盲腸內(nèi)菌群進(jìn)行16S rDNA基因V3～V4可變區(qū)檢測，對腸道菌群可操作分類單元(OTUs)數(shù)、α多樣性、β多樣性及差異菌門與菌屬進(jìn)行綜合性分析與評價(jià)，探究柔嫩艾美耳球蟲感染對雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。結(jié)果表明：與正常組相比，感染柔嫩艾美耳球蟲后雞腸道菌群的OTUs數(shù)、Chao1指數(shù)極顯著降低，Shannon指數(shù)顯著降低，Simpson指數(shù)顯著升高；門水平上，模型組變形菌門的相對豐度極顯著升高，而厚壁菌門的相對豐度顯著降低，擬桿菌門和柔膜菌門的相對豐度顯著降低；屬水平上，正常組的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬、瘤胃菌屬–UCG014、副擬桿菌屬，而模型組瘤胃球菌屬–uncultured、球藻菌屬、埃希菌–志賀菌屬相對豐度極顯著升高?？梢?，艾美耳球蟲破壞了盲腸菌群的完整性，促進(jìn)潛在致病菌的建立和生長，尤其使埃希菌–志賀菌屬大量繁殖，快速生長。

羅曼粉雞；柔嫩艾美耳球蟲；腸道菌群；16S rDNA；多樣性；相對豐度

雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲感染引起的一種急性腸道寄生蟲病，發(fā)病率高達(dá)80%，死亡率為20%～30%，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。每年支出的抗球蟲藥物成本在6～8億元，占雞病防治總支出近三分之一[1–3]。據(jù)報(bào)道，全球每年因雞球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億英鎊，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失[4–6]。研究[7–9]發(fā)現(xiàn)，寄生蟲的侵染可導(dǎo)致畜禽腸道菌群失調(diào)，腸功能障礙及生化穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生改變，同時(shí)腸道菌群的多樣性和結(jié)構(gòu)的改變與寄生蟲的毒力、定植及侵染有著密切關(guān)系。本研究中，采用16S rDNA高通量測序技術(shù)分析雞感染艾美耳球蟲后盲腸菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性變化，從腸道微生態(tài)學(xué)角度闡釋雞感染艾美耳球蟲的致病機(jī)理，旨在為雞球蟲病的發(fā)病機(jī)制和防控技術(shù)研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　供試動物和蟲株

60只1日齡健康羅曼粉雞購于重慶永川種雞場。試驗(yàn)雞飼喂于特制鋼絲雞籠內(nèi)。雞籠和用具提前進(jìn)行火焰消毒。試驗(yàn)期間試驗(yàn)雞自由采食，飲水，飼喂不含任何藥物添加劑的飼料，飼喂至16日齡備用。柔嫩艾美耳球蟲由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所臨床分離、保存。

1.2　主要試劑與儀器

TransGen AP221–02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase購自北京全式金生物有限公司；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN；細(xì)菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。PE250型共通量測序儀(Illumina)；GeneAmpR 9700型PCR擴(kuò)增儀(ABI)；低溫離心機(jī)(Eppendorf)。

1.3　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將60只16日齡的試驗(yàn)雞隨機(jī)分為正常組(ZC)和模型組(MX)，每組30只。模型組試驗(yàn)雞每只經(jīng)口灌服柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊1×104個(gè)；正常組經(jīng)口灌服等體積的生理鹽水。灌服蟲卵后第5天，每組隨機(jī)解剖4只，無菌采集試驗(yàn)雞盲腸內(nèi)容物，分別記為ZC–1–1、ZC–1–2、ZC–1–3、ZC–1–4、MX–2–1、MX–2–2、MX–2–3、MX–2–4，于液氮中速凍后放入–80 ℃冰箱中保存，備用。

1.4　腸道菌群DNA提取

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取盲腸內(nèi)容物樣本中的微生物基因組DNA，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5　16S rDNA基因PCR擴(kuò)增及測序

根據(jù)細(xì)菌雙高變V3～V4區(qū)基因序列，由Invitrogen公司合成帶有樣本識別標(biāo)記(barcode)的特異性引物：341F(5–ACTCCTACGGGAGGCAGCA–3)和806R(5–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3)。PCR擴(kuò)增體系包括：模板DNA 10 ng，正向和反向引物各0.8 μL，5×FastBuffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，F(xiàn)astPolymerase 0.4 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至總體積20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延長30 s，共25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延長5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、定量和均一化形成測序文庫，送至上海中科新生命生物科技有限公司，在Illumina PE 250平臺上，運(yùn)用雙末端測序的方法進(jìn)行高通量測序。

1.6　測序數(shù)據(jù)分析

原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、質(zhì)控和去除嵌合體序列后得到最終有效序列。在97%的相似度水平下使用OTU進(jìn)行聚類，獲得操作分類單元OTUs；基于Silva(細(xì)菌)和UNITE(真菌)分類學(xué)數(shù)據(jù)庫，通過RDP Classifier OTUs進(jìn)行分類學(xué)注釋。置信度閾值0.7。采用QIIME生成不同分類水平上的物種豐度表；采用Mothur計(jì)算樣本α多樣性指數(shù)(Chao1、Shannon、Simpson)；采用基于Weighted UniFrac算法的主坐標(biāo)分析(PCoA)，比較不同樣本在物種多樣性方面存在的相似程度(β多樣性)。

1.7　統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行組間差異性比較。

2　結(jié)果與分析

2.1　OTU聚類與生物注釋結(jié)果

本研究中，所測樣本通過測序共獲得744 947對reads，通過拼接、質(zhì)控過濾后共產(chǎn)生699 848條有效序列。在97%的相似度水平下對序列進(jìn)行聚類，獲得606個(gè)OTUs，其中正常組543個(gè)，模型組359個(gè)，兩組共有296個(gè)。

2.2　雞盲腸腸道菌群的豐富度和多樣性變化

由表1可知，與正常組相比，模型組OTUs數(shù)和Chao1指數(shù)均極顯著下降，Shannon指數(shù)顯著降低，Simpson指數(shù)極顯著升高。

表1　供試雞腸道菌群的豐富度和α多樣性

“*”“**”分別示兩組間的差異顯著(<0.05)、極顯著(<0.01)。

2.3　雞盲腸腸道菌群β多樣性分析結(jié)果

由圖1可知，PC1和PC2對腸道菌群間差異的貢獻(xiàn)百分?jǐn)?shù)分別為55.23%和33.90%，模型組樣本點(diǎn)與正常組樣本點(diǎn)完全分開，表明感染艾美耳球蟲后雞腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)與組成發(fā)生了較大的變化。

圖1　供試雞腸道菌群的主坐標(biāo)分析結(jié)果

2.4　感染艾美耳球蟲后雞腸道菌群結(jié)構(gòu)及物種差異

由表2可知，在門水平上，所有樣本中共檢測到擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和柔膜菌門(Tenericutes)等4個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌門。正常組以厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌群，所占比例分別為68.24%和28.09%；模型組以厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌群，所占比例分別為59.31%、20.22%和18.29%。在門水平，與正常組相比，模型組變形菌門的相對豐度極顯著升高，擬桿菌門和柔膜菌門的相對豐度極顯著降低，厚壁菌門的相對豐度顯著降低。

表2　供試雞腸道菌群門水平上物種的相對豐度

“*”“**”分別示兩組間的差異顯著(<0.05)、極顯著(<0.01)。

由表3可知，在屬水平上，正常組的優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬()、瘤胃菌屬–UCG014(UCG–014、副擬桿菌屬()和瘤胃菌屬–uncultured (–uncultured)，其中相對豐度超過10%的有擬桿菌、副擬桿菌屬、瘤胃菌屬–UCG014，分別占16.40%、11.45%、12.51%；模型組中的擬桿菌屬()、埃希菌–志賀菌屬()、瘤胃菌屬– uncultured(uncultured)和球藻菌屬()為優(yōu)勢菌屬，分別占20.20%、16.75%、14.95%、4.71%；與正常組相比，模型組瘤胃球菌屬UCG–014的相對豐度極顯著降低，瘤胃球菌屬uncultured、球藻菌屬、埃希菌–志賀菌屬的相對豐度極顯著升高，且在模型組中未檢測到副擬桿菌屬()、瘤胃球菌屬–NK4A214(NK4A214)、嗜膽菌屬()。

表3　供試雞腸道菌群屬水平上物種的相對豐度

“**”示兩組間的差異極顯著(<0.01)。

3　結(jié)論與討論

腸道菌群是長期定植于動物胃腸道、參與宿主的新陳代謝、多酚的生物轉(zhuǎn)化、腸道免疫調(diào)節(jié)及病原體排除的一類共生微生物。腸道菌群可通過促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞因子，如TNF–α、IL–6的生成，進(jìn)而阻止病原微生物在腸道的定植和入侵[10–11]。宿主與腸道菌群的共生構(gòu)成了一個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)，在維持腸道穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)方面起著重要作用。同時(shí)，腸道菌群的改變可直接或間接地影響寄生蟲的定植和感染狀態(tài)等[12–14]。本研究中，供試雞感染柔嫩艾美耳球蟲后，雞盲腸菌群的OTUs數(shù)、Chao1指數(shù)極顯著降低，Shannon指數(shù)顯著降低，表明感染柔嫩艾美耳球蟲后試驗(yàn)雞盲腸菌群的豐富度和多樣性降低。

本研究中，從門、屬水平對感染柔嫩艾美耳球蟲后腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，在門水平，正常組厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌群，模型組厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌群。在屬水平，正常組優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬、瘤胃球菌屬–UCG014、副擬桿菌屬和瘤胃菌屬–uncultured；柔嫩艾美耳球蟲感染后，擬桿菌屬、瘤胃球菌屬–uncultured、埃希菌–志賀菌屬的相對豐度明顯升高，副擬桿菌屬明顯降低，推測可能是柔嫩艾美耳球蟲的侵染造成機(jī)體腸道黏膜損傷，改變了雞盲腸的微生物定植區(qū)域環(huán)境，促進(jìn)潛在致病菌的建立和生長，如變形菌門中埃希菌–志賀菌屬大量繁殖，占比高達(dá)16.75%。

志賀菌屬是引起全球范圍內(nèi)細(xì)菌性痢疾的重要病原菌。雞源志賀菌可引起不同品種、不同日齡的雞發(fā)生腹瀉，并可導(dǎo)致雛雞死亡[15]。本研究結(jié)果表明，感染艾美耳球蟲后，變形菌門的相對豐度極顯著升高，尤其是埃希菌–志賀菌屬極顯著升高，由正常組的0.13%升高到模型組的16.75%，這可能是試驗(yàn)雞腹瀉便血的原因之一。同時(shí)，從模型組盲腸內(nèi)容物微生物菌群中未檢出嗜膽菌屬和副擬桿菌屬，而這2個(gè)菌屬主要產(chǎn)生短鏈脂肪酸(如乙酸、乳酸、琥珀酸等)，抵御炎癥反應(yīng)，降低炎癥水平。短鏈脂肪酸是腸上皮細(xì)胞的能量來源，產(chǎn)酸微生物減少，會導(dǎo)致腸道pH值升高，有害微生物大量繁殖，腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定紊亂，盲腸菌群的豐富度和多樣性發(fā)生變化[16–17]，這可能是引起腸道組織結(jié)構(gòu)發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞胞內(nèi)可見大量蟲體、上皮細(xì)胞壞死脫落、上皮層充血或出血等病變的主要原因，雛雞臨床表現(xiàn)為采食量下降、腹瀉，甚至出現(xiàn)血便[18–19]。

綜上可知，柔嫩艾美耳球蟲破壞了雞盲腸菌群的完整性，改變了雞盲腸的微生物組成和結(jié)構(gòu)，促進(jìn)潛在致病菌的建立和生長，尤其使變形菌門中埃希菌–志賀菌屬大量繁殖，快速生長。

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Effect ofinfection on the caecal flora of chickens

ZHAI Shaoqin1,2，YAN Zhiqiang1，CHEN Chunlin1，ZHU Maixun1，TANG Hongmei1，F(xiàn)U Wengui1,2*

(1.Chongqing Academy of Animal Sciences, Chongqing 402460, China; 2.Chongqing Pig-Raising Engineering Technology Research Center, Chongqing 402460, China)

60 healthy Roman powder chickens were randomly divided into normal group and model group, 30 in each group with 30 chickens in each group. The model group was fed with 1×104sporulated oocysts to artificially replicate the chicken coccidiosis model. The normal group was treated with normal saline. Five days after infection, the test chickens were sacrificed, the contents of the chicken cecum were collected aseptically, and the 16S rDNA gene V3-V4 variable region of the intestinal flora of the cecal contents of broilers was detected by Illumina PE250 high-throughput sequencer. Comprehensive analysis and evaluation of the number of operable taxonomic units(OTUs) of the intestinal flora, α and β diversity, as well as differences in phylum and genus, to study the effect of Eimeria tenella infection on the structure and diversity of chicken cecal flora. The results showed as follows: after infection with Eimeria tenella, the number of OTUs and the Chao1 index in the model group decreased extremely significantly, and Shannon index in the model group decreased significantly, the Simpson index increased significantly. The composition of the bacteria group: at the phylum level, the abundance of Proteobacteria in the model group was increased extremely significantly, while that of Firmicutes was reduced extremely significantly. At the genus level, the predominant bacteria in the normal group were,-UCG014, and; in the model group, the relative abundance of_,andincreased extremely significantly.disrupted the integrity of the cecal microbiota and promotes the establishment and growth of potentially pathogenic bacteria, especially the growth of.

Roman powder chicken;; intestinal flora; 16S rDNA; diversity; relative abundance

S858.312.72+3

A

1007-1032(2022)03-0342-05

10.13331/j.cnki.jhau.2022.03.014

2020–05–21

2022–03–28

重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(cstc2019jcyj–msxmX0061)；重慶市現(xiàn)代山地特色高效農(nóng)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(2018[5]號)

翟少欽(1973—)，女，四川綿竹人，碩士，副研究員，主要從事中獸藥研究，zhaishaoqin@126.com；*通信作者，付文貴，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防控研究，437695698@qq.com

翟少欽，閆志強(qiáng)，陳春林，朱買勛，唐紅梅，付文貴．柔嫩艾美耳球蟲感染對雞盲腸菌群的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2022，48(3)：342–346．

ZHAI S Q，YAN Z Q，CHEN C L，ZHU M X，TANG H M，F(xiàn)U W G．Effect ofinfection on the caecal flora of chickens[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(3)：342–346．

http://xb.hunau.edu.cn

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正