黃宏寶，吳小勤，盧東林，覃莉，韋敬錫，羅小瓊，黃秋艷，陳發(fā)欽

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床病理診斷與研究中心，廣西 百色 533000；4. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，廣西 百色 533000)

宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，對(duì)女性的身心健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。國(guó)際癌癥硏究中心(IARC)最新數(shù)據(jù)顯示，宮頸癌在全球女性腫瘤的發(fā)病率和死亡率中仍然排名第四[1]。宮頸癌的病因目前不十分明確，公認(rèn)的高危風(fēng)險(xiǎn)是高危型人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染，IARC將13種高危HPV亞型認(rèn)定為Ⅰ類致癌物。近年來(lái)，宮頸癌篩查的廣泛普及使宮頸癌的早期診斷率得到明顯提升，但是中晚期或者復(fù)發(fā)的患者死亡率依然居高不下。以分子機(jī)制研究為基礎(chǔ)的靶向治療取得一定的進(jìn)步，目前已有應(yīng)用于臨床的靶向藥物，前景可觀，但同樣顯現(xiàn)了其局限性，尋找高效的分子靶點(diǎn)對(duì)宮頸癌的研究意義重大。αB-晶狀體蛋白(CRYAB)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，染色體定位于11q23.1，長(zhǎng)度約15 177 B，含6個(gè)外顯子，和其他小分子熱休克蛋白一樣，它有一個(gè)保守的中心結(jié)構(gòu)域，而位于兩側(cè)的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域是高度可變的非保守序列，這些序列對(duì)于分子伴侶功能至關(guān)重要[2]。CRYAB分子伴侶功能可以防止因環(huán)境刺激導(dǎo)致的靶蛋白展開(kāi)和聚集，并將易聚集的蛋白保存在其可溶性寡聚體結(jié)構(gòu)中，避免蛋白質(zhì)功能的喪失和有毒中間產(chǎn)物的生成[3]。CRYAB最初在人眼的晶狀體中被發(fā)現(xiàn)，最新的Bgee Gene顯示，它在心臟和243 種其他組織中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，CRYAB在鼻咽癌、膀胱癌、前列腺癌中表達(dá)下調(diào)[4-6]，而在乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤中高表達(dá)[7-8]。目前CRYAB與宮頸癌的關(guān)系尚不明確，本研究利用生物信息學(xué)系統(tǒng)分析CRYAB在宮頸癌中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制，旨在為宮頸癌的分子研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 CRYAB在宮頸癌及泛癌中的表達(dá) 運(yùn)用UALCAN網(wǎng)頁(yè)工具(http://ualcan.path.uab.edu/)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)宮頸癌組織樣本中CRYAB的表達(dá)情況。UALCAN是美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校的癌癥數(shù)據(jù)分析門(mén)戶網(wǎng)站，該網(wǎng)站是一個(gè)內(nèi)容豐富且對(duì)用戶友好的網(wǎng)絡(luò)資源，用于分析各種癌癥分開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA、MET500、CPTAC 和 CBTTC)中的組學(xué)數(shù)據(jù)[9]。利用臨床生信之家(https://www.aclbi.com)網(wǎng)頁(yè)工具分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)宮頸癌組織樣本中CRYAB的表達(dá)情況。該平臺(tái)是國(guó)內(nèi)學(xué)者搭建，原始數(shù)據(jù)來(lái)源自TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，所有分析數(shù)據(jù)均由Rv4.0.3分析完成，用戶可以在不使用R語(yǔ)言的情況下完成對(duì)數(shù)據(jù)的全方位分析，GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析更是其亮點(diǎn)。通過(guò)網(wǎng)站上GEO模塊中的基因表達(dá)比較選項(xiàng)來(lái)探索GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE46857組織樣本中CRYAB的表達(dá)情況[10]。利用仙桃學(xué)術(shù)網(wǎng)站(https://www.xiantao.love)分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比宮頸癌樣本中CRYAB的表達(dá)情況。仙桃學(xué)術(shù)網(wǎng)的生信工具同樣為用戶提供了便捷的生信分析方式，將GTEx的數(shù)據(jù)納入分析，提高結(jié)果的可靠性。

1.2 CRYAB的表達(dá)與宮頸癌生存期及臨床病理特征的關(guān)系分析 通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析CRYAB與宮頸癌患者生存期的關(guān)系；該網(wǎng)站基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)為用戶提供快速且可定制的分析功能[11]。UALCAN用來(lái)分析CRYAB與宮頸癌患者腫瘤分期、人種、體重、年齡、組織學(xué)類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1.3 免疫浸潤(rùn)分析 通過(guò)TIMER 2.0(http://timer.cistrome.org/)分析在宮頸癌組織中CRYAB表達(dá)量與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性；TIMER 的最大特色是免費(fèi)分析不同種類癌癥的免疫浸潤(rùn)。2.0版本的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器通過(guò)多種計(jì)算方法評(píng)估免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，而用戶只需簡(jiǎn)單的操作即可得到高質(zhì)量的圖形，以此來(lái)全方位的探索腫瘤免疫學(xué)、基因組和臨床特征[12-14]。

1.4 共表達(dá)基因分析 LinkedOmics數(shù)據(jù)源來(lái)自TCGA項(xiàng)目的 32 種癌癥類型和總共11 158名患者的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)[15]。通過(guò)LinkedOmics(http://www.linkedomics.org)網(wǎng)站下載并分析CRYAB共表達(dá)的基因，將高表達(dá)前50和低表達(dá)前50的基因制作成熱圖。STRING (https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)從多個(gè)來(lái)源收集證據(jù)，目的是整合蛋白質(zhì)之間所有已知和預(yù)測(cè)的關(guān)聯(lián)，包括物理相互作用和功能關(guān)聯(lián)[16]。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)制作蛋白互作圖，尋找關(guān)鍵基因。

1.5 共表達(dá)基因富集分析 從LinkedOmics網(wǎng)站下載共表達(dá)基因信息，篩選出高表達(dá)前200和低表達(dá)前200的基因制作成列表，再用Metascape網(wǎng)站(https://metascape.org/)進(jìn)行下一步研究，該網(wǎng)站可以為用戶提供全面的基因列表注釋和分析資源[17]，利用此功能對(duì)共表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通過(guò)富集分析，尋找可能的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 CRYAB基因在宮頸癌和癌旁組織或正常宮頸組織的表達(dá)比較 在TCGA中，CRYAB基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織，見(jiàn)圖1A；在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE46857數(shù)據(jù)集中，CRYAB基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織，見(jiàn)圖1B；CRYAB在27種癌癥中存在差異表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1C。

A：CRYAB在TCGA宮頸癌及癌旁樣本中的表達(dá)情況；B：CRYAB在GEO宮頸癌及癌旁樣本中的表達(dá)情況；C：CRYAB在TCGA和GTEx泛癌配對(duì)樣本中的表達(dá)情況。

2.2 CRYAB的表達(dá)與宮頸癌生存期及臨床病理特征的影響 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，CRYAB的表達(dá)與宮頸癌患者的總體生存期無(wú)相關(guān)性(P=0.58)，見(jiàn)圖2A，與患者的無(wú)病生存期無(wú)相關(guān)性(P=0.23)，見(jiàn)圖2B。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，從腫瘤分期來(lái)看，Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的CRYAB表達(dá)低于癌旁組織，Ⅰ期患者CRYAB表達(dá)量與癌旁組織無(wú)差異，4個(gè)期別間的CRYAB表達(dá)量無(wú)差異，見(jiàn)圖3A。從人種來(lái)看，白種人、非裔美國(guó)人和亞洲人宮頸癌患者CRYAB表達(dá)量低于癌旁組織，各人種之間的CRYAB表達(dá)無(wú)差異，見(jiàn)圖3B。從體重來(lái)看，正常體重、超重、肥胖和過(guò)度肥胖患者CRYAB的表達(dá)量低于癌旁組織，但不同體重組之間表達(dá)量無(wú)差異，見(jiàn)圖3C。從年齡層次來(lái)看，21～40歲組和61～80歲組患者CRYAB的表達(dá)量較癌旁組織明顯偏低；41～60歲組較21～40歲組患者CRYAB的表達(dá)量偏高，而81～100歲患者的CRYAB表達(dá)量高于41～60歲組；其余各組的表達(dá)量無(wú)差異，見(jiàn)圖3D。從組織學(xué)類型看，宮頸鱗狀細(xì)胞癌、普通型宮頸管腺癌和宮頸內(nèi)膜樣腺癌組織中CRYAB的表達(dá)量低于癌旁組織；宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CRYAB的表達(dá)量明顯高于宮頸腺鱗癌和普通型宮頸管腺癌；其余各組間表達(dá)無(wú)差異，見(jiàn)圖3E。從淋巴轉(zhuǎn)移的情況來(lái)看，N0期(無(wú)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)和N1期(有1～3枚腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)組織中CRYAB表達(dá)量低于癌旁組織，但N0和N1兩組間表達(dá)量無(wú)差異，見(jiàn)圖3F。

A：CRYAB表達(dá)量與宮頸癌患者總體生存期相關(guān)性；B：CRYAB表達(dá)量與宮頸癌患者無(wú)病生存期相關(guān)性。

A：CRYAB與宮頸癌腫瘤分期的關(guān)系；B：CRYAB與宮頸癌患者人種的關(guān)系；C：CRYAB與宮頸癌患者體重的關(guān)系；D：CRYAB與宮頸癌患者年齡的關(guān)系；E：CRYAB與宮頸癌組織學(xué)類型的關(guān)系；F：CRYAB與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

2.3 CRYAB與宮頸癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性 TIMER 2.0分析顯示，CRYAB在宮頸癌組織中與腫瘤細(xì)胞純度無(wú)相關(guān)性，與造血干細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，與單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞和B細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。如圖4所示。

圖4 CRYAB表達(dá)與宮頸癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平相關(guān)性

2.4 宮頸癌組織中的CRYAB共表達(dá)基因分析 利用LinkedOmics網(wǎng)站，篩選出與CRYAB具有正或負(fù)相關(guān)性的前50個(gè)共表達(dá)基因，并以熱圖的形式展示，正相關(guān)的基因按P值升序排列，前5個(gè)為：NDRG4、IVL、KRT75、SBSN和FABP12，見(jiàn)圖5A；負(fù)相關(guān)的基因按P值升序排列，前5個(gè)為：KIAA0649、TMPRSS3、GOLM1、ALDH3B1和RHOBTB2，見(jiàn)圖5B。STRING蛋白互作分析顯示，SPRR1B、IVL、SPRR1A、SPRR3和SPRR2A相關(guān)聯(lián)，CRYAB與HSPB1和HSPB2相關(guān)聯(lián)，見(jiàn)圖5C。

A：宮頸癌中與CRYAB表達(dá)正相關(guān)的基因；B：宮頸癌中與CRYAB表達(dá)負(fù)相關(guān)的基因；C：共表達(dá)基因互作關(guān)系。

2.5 CRYAB及共表達(dá)基因GO注釋和KEGG通路富集分析 為了預(yù)測(cè)與CRYAB共表達(dá)基因的功能，下載LinkedOmics網(wǎng)站上的共表達(dá)基因，選取上調(diào)和下調(diào)前200個(gè)基因合并成列表，利用Metascape網(wǎng)站進(jìn)行GO注釋和KEGG通路富集。結(jié)果顯示，共表達(dá)基因參與表皮發(fā)育、包膜角化、多肽交叉連接、鈣離子結(jié)合和中間纖維細(xì)胞骨架組織等，見(jiàn)圖6A，通路富集在金黃色葡萄球菌感染、黏蛋白O-聚糖生物合成、核苷酸糖的生物合成、IL-17信號(hào)通路和癌癥的通路等，見(jiàn)圖6B。

A：共表達(dá)基因GO注釋；B：共表達(dá)基因KEGG通路富集。

3 討論

宮頸癌是一種女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，好發(fā)于子宮頸鱗狀、柱狀上皮連接處的細(xì)胞?！案咧掳┬浴比巳轭^瘤病毒(HPV)感染[18]和主要遺傳因素[19](包括基因和染色體的改變、抑癌因子和激活因子水平的改變)是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。中國(guó)2020年宮頸癌的新發(fā)病例為109 741例，死亡病例為59 060例。與2015年相比，新發(fā)病率基本持平，但死亡率卻明顯增加(約從3.4萬(wàn)上升至5.9萬(wàn))[20]。尋找宮頸癌篩查的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)意義重大。隨著政府宮頸癌篩查項(xiàng)目和HPV疫苗的不斷推廣，宮頸癌在一定程度上是可以預(yù)防的。但在中國(guó)，因地域及經(jīng)濟(jì)和文化的差異仍然較大，一些地區(qū)女性接種HPV疫苗或意愿仍然不高[21]，某些地區(qū)女性宮頸癌健康素養(yǎng)較低[22]，提高老年女性、文化程度低、農(nóng)村婦女等人群的宮頸癌預(yù)防知識(shí)仍然任務(wù)艱巨。哺乳動(dòng)物的晶狀體蛋白可分為α、β和γ家族；作為分子伴侶，盡管它們不會(huì)使蛋白質(zhì)再生并釋放它們作為真正的伴侶。但是，它們結(jié)合錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以防止蛋白質(zhì)聚集，除此之外，CRYAB還有另外兩個(gè)特別的功能，自身激酶活性和參與細(xì)胞骨架的穩(wěn)定[23]。CRYAB的這些功能可能與腫瘤的調(diào)控相關(guān)。

本研究顯示，CRYAB在宮頸癌中呈低表達(dá)，這與前人在鼻咽癌、膀胱癌和前列腺癌中的研究一致，CRYAB在這些腫瘤中可能是一種抑癌基因，而在乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤中可能是促癌作用。這顯示了調(diào)控因子功能的多樣性和復(fù)雜性。CRYAB表達(dá)與腫瘤分期、人種、年齡、體重、組織學(xué)類型和淋巴轉(zhuǎn)移存在一定的相關(guān)性，但結(jié)果表明，各腫瘤分期組間、不同人種組間、不同體重組間和淋巴轉(zhuǎn)移數(shù)目組間CRYAB的表達(dá)量無(wú)差異。從年齡來(lái)看，年齡更大的患者，CRYAB的表達(dá)量有升高的趨勢(shì)，在不同組織類型的宮頸癌中，CRYAB的表達(dá)量存在一定差異，但無(wú)明顯規(guī)律。本次研究結(jié)果還顯示，CRYAB的差異表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的改變，正相關(guān)的細(xì)胞群中差異性很大，而負(fù)相關(guān)的細(xì)胞群中差異性相對(duì)較小，這可能提示，宮頸癌中低表達(dá)的CRYAB導(dǎo)致造血干細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞大降減少，單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞增加，兩者共同作用，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。共表達(dá)基因GO注釋發(fā)現(xiàn)，它們參與表皮發(fā)育、包膜角化、多肽交叉連接、鈣離子結(jié)合和中間纖維細(xì)胞骨架組織等細(xì)胞功能，可以推測(cè)，CRYAB可能通過(guò)上述方式調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。蛋白互作發(fā)現(xiàn)的重點(diǎn)分子SPRR1B和IVL已有報(bào)道與宮頸癌的調(diào)控相關(guān)[24-25]，這更提供了CRYAB作為相關(guān)因子參與宮頸癌調(diào)控的依據(jù)。KEGG通路分析顯示共表達(dá)基因富集在金黃色葡萄球菌感染、黏蛋白O-聚糖生物合成、核苷酸糖的生物合成、IL-17信號(hào)通路和癌癥的通路等，這為今后CRYAB在宮頸癌的通路研究提供了理論基礎(chǔ)。

綜合上述，CRYAB在宮頸癌中低表達(dá)，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)系，有望成為宮頸癌的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。