孫明雪，鄒純才，鄢海燕，嚴(yán)國(guó)宇

(皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)或雙邊栝樓(T.rosthorniiHarm)的干燥成熟果實(shí)，其種子和果皮分別作為瓜蔞子和瓜蔞皮入藥[1]，黃酮類(lèi)化合物是瓜蔞的主要化學(xué)成分之一[2]。有研究報(bào)道[3-5]黃酮類(lèi)化合物具有保護(hù)胃黏膜、抗實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍等作用。有研究表明瓜蔞提取物(trichosanthes extract，TE)具有抗胃潰瘍的作用[6-8]，而黃酮類(lèi)化合物[9-10]可能是TE抗胃潰瘍的活性成分[11]。課題組前期采用高效液相色譜法對(duì)TE的化學(xué)指紋圖譜及TE中所含的蘆丁(黃酮醇類(lèi))、木犀草素(黃酮醇類(lèi))、芹菜素(黃酮類(lèi))、異槲皮苷(黃酮醇類(lèi))和山奈酚(黃酮醇類(lèi))5種成分進(jìn)行研究，結(jié)果表明TE中蘆丁∶木犀草素∶芹菜素∶異槲皮苷∶山奈酚為1∶2∶1∶2∶3(質(zhì)量比，以下簡(jiǎn)稱(chēng)蘆丁等混合對(duì)照品)，見(jiàn)圖1。并進(jìn)一步考察了TE和蘆丁等混合對(duì)照品的抗氧化活性[12-13]，通過(guò)譜效關(guān)系確定了TE抗氧化藥效成分群。目前，有關(guān)總黃酮的含量測(cè)定，現(xiàn)有方法為選擇某一單一對(duì)照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行定量分析，由于單一對(duì)照品較難反映中藥或中藥提取物的藥效，因此采用單一對(duì)照品測(cè)定總黃酮的含量與實(shí)際藥效間缺少關(guān)聯(lián)。為此，本文基于抗氧化藥效成分群采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定TE總黃酮含量，以期為總黃酮的含量測(cè)定提供一個(gè)新思路。

1.蘆?。?.異槲皮苷；3.木犀草素；4.芹菜素；5.山奈酚。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 UV5100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司)；AUW-220D型電子天平(日本島津公司)；Heidolph-LR4010/4011旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道爾夫公司)；pHS-3C型pH計(jì)(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 瓜蔞皮(批號(hào)：20171202)、瓜蔞子(批號(hào)：20201020)均購(gòu)自河北安國(guó)御顏坊中藥材有限公司；三氯化鋁(批號(hào)：20150604，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；蘆丁(批號(hào)：141208)、異槲皮苷(批號(hào)：140404)、山奈酚(批號(hào)：150929)(純度≥98.0%)均購(gòu)自成都普菲德公司；木犀草素(批號(hào)：MO2-140513)、芹菜素(批號(hào)：QO2-140512)(純度≥98.0%)均購(gòu)自中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心；其余試劑為分析純；水為純化水(自制)。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 0.1 mol/L三氯化鋁溶液 取三氯化鋁1.3335 g，精密稱(chēng)定，用5 mL水溶解并用無(wú)水乙醇定容至100 mL量瓶中，即得。

2.1.2 乙酸鈉-乙酸緩沖液的配制 取乙酸鈉5.0012 g，精密稱(chēng)定，溶于10 mL水中，制得乙酸鈉溶液，備用。精密量取5 mL冰乙酸于50 mL量瓶中，用水定容至刻度，制得10%的冰乙酸，備用。用10%冰乙酸溶液滴定乙酸鈉溶液，分別配制pH=4.50、pH=5.00、pH=5.50、pH=6.00和pH=6.50的緩沖液，即得。

2.1.3 抗氧化藥效成分群溶液 取蘆丁10.5 mg、木犀草素10.4 mg、芹菜素10.4 mg、異槲皮苷10.6 mg、山奈酚10.5 mg，精密稱(chēng)定，分別置于50 mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，分別制成濃度為0.210 mg/mL、0.208 mg/mL、0.208 mg/mL、0.212 mg/mL、0.210 mg/mL的蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷、山奈酚混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；按蘆丁等混合對(duì)照品的質(zhì)量比，分別精密量取蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷、山奈酚對(duì)照品儲(chǔ)備液適量至10 mL量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，制得濃度為36.21 μg/mL的混合對(duì)照品(每mL含蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷、山奈酚對(duì)照品的質(zhì)量合計(jì)為36.21 μg)稀釋液，即抗氧化藥效成分群溶液。

2.1.4 TE的制備[14]參照課題組前期提取工藝，取瓜蔞(瓜蔞皮∶瓜蔞子=2∶3)，精密稱(chēng)定，以70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶10(g/mL)，超聲提取(功率200 W，超聲頻率40 Hz)，提取溫度為40 ℃，提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為60分鐘/次，所得濾液合并后于4 ℃靜置12 h，濾除沉淀并回收溶劑制備浸膏。所得浸膏冷凍干燥48 h，得TE凍干粉。

2.1.5 TE樣品溶液 取TE凍干粉10.0000 g，精密稱(chēng)定，用20 mL蒸餾水溶解，等量乙酸乙酯超聲萃取3次，每次20 min，合并乙酸乙酯層并回收溶劑，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇定容至50 mL量瓶，備用。

2.2 總黃酮含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定和乙酸緩沖液pH值的考察 取適量的“2.1.3”項(xiàng)下抗氧化藥效成分群溶液及“2.1.5”項(xiàng)下TE樣品溶液，分別以無(wú)水乙醇為參比，掃描抗氧化藥效成分群溶液和TE溶液顯色前的光譜圖；取20 μL的抗氧化藥效成分群溶液和2 mL TE溶液，分別加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液和不同pH下(pH=4.50、5.00、5.50、6.00、6.50)的乙酸鈉-乙酸緩沖液(V∶V∶V=1∶2∶1)，室溫顯色30 min，以同法處理的無(wú)水乙醇、0.1 mol/L三氯化鋁溶液和乙酸鈉-乙酸緩沖液為參比，掃描抗氧化藥效成分群溶液和TE溶液顯色后的光譜圖。比較抗氧化藥效成分群溶液和TE溶液顯色前、后的光譜圖及抗氧化藥效成分群溶液和TE溶液在不同pH下顯色30 min和1 h的光譜圖，確定乙酸緩沖液的最佳pH值和樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 精密量取“2.1.3”項(xiàng)下的抗氧化藥效成分群溶液(36.21 μg/mL)0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL各兩份，分別置于10 mL量瓶中。其中一份用無(wú)水乙醇定容至刻度，以無(wú)水乙醇為參比，在420 nm測(cè)定吸光度，記為A1；另一份按“2.2.1”項(xiàng)下顯色方法(pH=5.3，顯色30 min)處理并在420 nm處測(cè)定吸光度A2；計(jì)算相同濃度抗氧化藥效成分群溶液組的ΔA值 (ΔA=A2-A1)。以抗氧化藥效成分群溶液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以ΔA為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。參照抗氧化藥效成分群溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立方法，建立蘆丁等5個(gè)單獨(dú)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，確定其相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍。

2.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.5”項(xiàng)下TE(批號(hào)：20210402)樣品溶液1 mL于10 mL的量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，平行測(cè)定5次，記錄ΔA值。

2.2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取TE(批號(hào)：20210402)，按“2.1.5”項(xiàng)下TE樣品溶液方法制備溶液5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，記錄ΔA值。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.1.5”項(xiàng)下TE(批號(hào)：20210402)樣品溶液1 mL同一樣品溶液于10 mL的量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，分別于0 min、15 min、30 min、45 min、60 min測(cè)定，記錄ΔA值。

2.2.3.4 加樣回收試驗(yàn) 精密吸取1.0 mL的已知總黃酮含量的TE(批號(hào)：20210402)樣品溶液9份，分別精密量取適量的抗氧化藥效成分群溶液置于樣品溶液中(抗氧化藥效成分群質(zhì)量分別為所取樣品溶液中總黃酮質(zhì)量的80%、100%和120%，各3份)，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法處理，平行測(cè)定3次，記錄ΔA值，計(jì)算樣品加樣回收率。

2.3 TE總黃酮的含量測(cè)定[9，15]取TE(批號(hào)：20210402、20210403、20210405)，按“2.1.5”項(xiàng)下方法制備TE樣品溶液。精密量取1.0 mL TE樣品溶液，置于10 mL量瓶中，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法處理，計(jì)算TE樣品溶液ΔA值 (ΔA=A2-A1)，采用抗氧化藥效成分群標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和蘆丁等5個(gè)單獨(dú)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分別測(cè)定TE中總黃酮的含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定及緩沖液pH值的考察結(jié)果分析 按“2.2.1”項(xiàng)下方法，在不同pH值乙酸緩沖液下，通過(guò)掃描抗氧化藥效成分群溶液和TE溶液在300～700 nm處的紫外-可見(jiàn)光譜圖，發(fā)現(xiàn)抗氧化藥效成分群和TE溶液顯色后均在420 nm處存在最大吸收峰，故可確定測(cè)定波長(zhǎng)為420 nm。但TE顯色前在420 nm波長(zhǎng)也有吸收，因此不能采用紫外-可見(jiàn)分光光度法直接測(cè)定TE顯色后的吸光度來(lái)計(jì)算總黃酮的含量[14]?？刹捎貌钍痉止夤舛确ㄓ?20 nm波長(zhǎng)處測(cè)定TE中的總黃酮含量，見(jiàn)圖2。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，TE和抗氧化藥效成分群顯色前后的吸光度差值隨pH值的增大而增大，見(jiàn)圖3。

A：抗氧化藥效成分群顯色前后光譜圖；B：TE顯色前后光譜圖；C：樣品和抗氧化藥效成分群顯色后光譜圖；D：TE差示光譜圖。

A：TE在不同pH值下顯色30 min和1 h的光譜圖；B：抗氧化藥效成分群在不同pH值下顯色30 min和1 h的光譜圖。

由圖3可知，TE顯色后放置30 min和1 h的曲線(xiàn)在pH=5.3處有交點(diǎn)，即ΔA值是相等的，可消除放置時(shí)間波動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響；同時(shí)在pH=5.3±0.2范圍內(nèi)，顯色后放置30 min時(shí)，TE和抗氧化藥效成分群的ΔA值近似為一平行于橫坐標(biāo)的直線(xiàn)，即在pH=5.3±0.2范圍，ΔA值基本不變，可消除因pH波動(dòng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，故選擇pH=5.3的乙酸緩沖液來(lái)控制顯色后溶液的pH。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的確定結(jié)果分析 按“2.2.2”項(xiàng)下方法，以ΔA為縱坐標(biāo)，抗氧化藥效成分群溶液稀釋液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為ΔA=0.2324C-0.0107，r=0.9995，結(jié)果表明抗氧化藥效成分群在0.18～1.45 μg/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

3.3.1 精密度 按“2.2.3.1”項(xiàng)下方法， 5次測(cè)定ΔA值的RSD值為0.3%，表明方法精密度良好。

3.3.2 重復(fù)性 按“2.2.3.2”項(xiàng)下方法，5份溶液測(cè)定ΔA值的RSD值為3.4%，表明方法重復(fù)性良好。

3.3.3 穩(wěn)定性 按“2.2.3.3”項(xiàng)下方法，樣品顯色后分別放置0 min、15 min、30 min、45 min、60 min測(cè)定ΔA值的RSD值為3.5%，表明樣品在顯色后60 min內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.4 回收率 按“2.2.3.4”項(xiàng)下方法，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，加樣回收率試驗(yàn)9次測(cè)定結(jié)果的均值為97.81%， RSD為1.68%，表明方法準(zhǔn)確度較好。

表1 加樣回收率結(jié)果

3.4 TE中總黃酮的含量測(cè)定 按“2.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定TE中總黃酮的含量，并與采用單獨(dú)對(duì)照品(蘆丁、木犀草素、芹菜素、異槲皮苷、山奈酚)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定TE中總黃酮的含量結(jié)果作比較，結(jié)果見(jiàn)表2 。由表2可知，選擇的對(duì)照品不同，計(jì)算出的TE中總黃酮的含量也不同。與抗氧化藥效成分群組相比較，采用單一對(duì)照品如蘆丁、木犀草素等測(cè)得的TE中總黃酮含量均較高且有顯著性差異(P<0.01)。

表2 不同對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定的TE總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

表2(續(xù)) 不同對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定的TE總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

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