程巧珍,陳 春,應(yīng) 婷,伍義行,葉子弘,廖學(xué)俊,胡華軍

(中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量與檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,浙江 杭州 310018)

隨著國內(nèi)外細胞治療技術(shù)的迅速發(fā)展,細胞治療在癌癥、血液病、心血管病、糖尿病等治療上顯現(xiàn)出越來越高的應(yīng)用價值[1]。細胞治療主要包括腫瘤細胞免疫治療和干細胞治療,細胞制劑是細胞治療中的重要制劑,所以在生產(chǎn)管理和質(zhì)量控制上需要嚴格要求。這不僅順應(yīng)了國際上細胞制劑標準化制備和應(yīng)用的主流趨勢,也直接影響到細胞治療的安全性和有效性。另外細胞制劑中內(nèi)外致病因子的污染是影響細胞制劑生產(chǎn)管理和質(zhì)量控制中關(guān)鍵因素之一。其中RNA病毒是影響人類健康的重要病原體,在世界范圍內(nèi)可引起致命性疾病的散發(fā)、流行或大流行。RNA病毒中HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2在世界范圍內(nèi)流行,并具有相似的傳播方式,還存在很多合并感染,已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列入致癌物清單中[2-3]。同時國內(nèi)細胞制劑相關(guān)的標準,如《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則(試行)》(2015國家衛(wèi)生和計劃生育委員會辦公廳和國家食品藥品監(jiān)督管理總局)、《免疫細胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》(2016中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會)、《干細胞制劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范》(2016中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會)、《干細胞通用要求》(2017國家標準委)、《CAR-T細胞制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范》(2018中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會)團體標準征求意見稿等都規(guī)定,對細胞制劑中的RNA病毒包括但不限于HIV、HTLV、HCV病毒明確要求檢測。

由于細胞制劑來源于供體的細胞培養(yǎng)物,經(jīng)初檢合格的供體細胞經(jīng)歷了多代的分離、純化和培養(yǎng)過程,同時有些供體細胞可能存在整合前病毒或者漏檢,其細胞內(nèi)的RNA病毒復(fù)制量可能隨宿主細胞的狀態(tài)而改變,導(dǎo)致細胞制劑中RNA病毒的抗原和抗體都很難檢測。而細胞制劑中RNA病毒的核酸檢測方法敏感性高,特異性高,“窗口期”漏檢率低已成為重要的質(zhì)控內(nèi)容。目前針對RNA病毒包括HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2病毒有多種核酸檢測方法,如熒光定量PCR法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增系統(tǒng)(TMA)法和核酸序列依賴擴增系統(tǒng)(NASBA)法,以及bDNA技術(shù)和數(shù)字PCR技術(shù)等[4-8]。為了更準確地評價核酸檢測結(jié)果的可靠性,設(shè)立核酸定性定量檢測的質(zhì)控品成為不可或缺的一部分。一方面,針對這些RNA病毒核酸檢測的陽性質(zhì)控品常使用臨床樣本中的活病毒、滅活病毒及裸露的RNA,它們存在有生物安全隱患、滅活不徹底、成本高、提純難、穩(wěn)定性差等缺陷。近年來應(yīng)用的噬菌體裝甲RNA則基本克服了上述缺陷,隨著穩(wěn)定性、安全性和準確性的提高,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于RNA病毒檢測質(zhì)控品[9]。由于目前大多數(shù)質(zhì)控品都基本只針對某一種RNA病毒,很少同時作為多種RNA病毒檢測的核酸標準品。對此，本研究的目的是制備一種裝載HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2這五種RNA病毒核酸片段的假病毒,以作為細胞制劑中上述五種RNA病毒核酸檢測的陽性質(zhì)控品。

1 材料方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

大腸桿菌Trans5α和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,pACY-CDuet-1質(zhì)粒(Trans5α)購自北京華越洋生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(一同購自上海生工),RNA/DNA Extraction Kit試劑盒,和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司),核酸內(nèi)切酶為KpnI和PacI,BamHI和NotI(購于杭州自創(chuàng)試生物科技有限公司),氯霉素(購自北京索萊寶科技有限公司);ZHWY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司),EPS300電泳儀和Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司),16K-R高速冷凍離心機(長沙市鑫奧儀器儀表有限公司),XP基因擴增儀器(杭州博日科技有限公司),H7650透射電子顯微鏡(TEM)(日本日立公司)。

1.3 基因序列合成

參考GenBank中MS2噬菌體(NC_001417.2)、HCV(D11168.1)、HIV-1(MG760423.1)、HIV-2(MH681607.1)、HTLV-1(LC210065)及HTLV-2(AF074965.1)進行MS2噬菌體與五種RNA病毒保守序列串聯(lián)核酸片段的設(shè)計,并分別在五種RNA病毒保守序列串聯(lián)基因5′端加上KpnI酶切位點及MS2的由19個堿基構(gòu)成的包裝位點(C-variant pac sites),3′端加上PacI酶切位點及C-variant pac sites;在MS2基因5′端加上BamHI酶切位點,3′端加上NotI酶切位點,都由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,并提供兩種包含目的片段的PUC-SP質(zhì)粒,命名為PUC-SP-5Virus和PUC-SP-MS2質(zhì)粒。MS2片段(1 660 bp)的通用引物pACYCDuetUP1和DuetDOWN1以及5Virus保守基因串聯(lián)片段(1 458 bp)(序列信息如圖1)的引物DuetUP2和T7t由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 五種病毒保守基因串聯(lián)片段的序列信息

1.4 pACYCDuet-1-MS2-5Virus質(zhì)粒的構(gòu)建

對PUC-SP-MS2質(zhì)粒和pACYCDuet-1載體采用BamHI和NotI雙酶切,常規(guī)電泳,割膠回收后,將MS2目的片段和線性載體pACYCDuet-1進行連接。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Trans5a,涂板挑單菌落培養(yǎng)擴增,提質(zhì)粒并利用引物pACYCDuetUP1和DuetDOWN1進行PCR擴增驗證,鑒定為陽性中間質(zhì)粒命名為pACYCDuet-1-MS2。

然后對pACYCDuet-1-MS2中間質(zhì)粒和PUC-SP-5Virus質(zhì)粒分別同時用KpnI和PacI雙酶切,常規(guī)電泳,割膠回收5Virus目的片段和線性載體pACYCDuet-1-MS2進行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞Trans5a,涂板挑單菌落培養(yǎng)擴增,提質(zhì)粒并進行PCR及測序鑒定。PCR鑒定分別對MS2和5Virus兩個目的片段驗證,最終鑒定為陽性重組質(zhì)粒命名為pACYCDuet-1-MS2-5Virus。

1.5 pACYCDuet-1-MS2-5Virus質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)表達及純化及SDS-PAGE分析

將重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-MS2-5Virus轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中,并涂布含有25 mg/mL氯霉素的瓊脂平板上,挑單菌落過夜活化作為母液。從母液取出1 mL按1∶100的比例接種到100 mL的LB培養(yǎng)基中220 r/min 37 ℃培養(yǎng)至菌液OD600 nm值達到0.6 h,加入物質(zhì)的量濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h,12 000 r/min離心5 min去上清,收集菌體沉淀,細菌裂解液重懸菌體37 ℃水浴30 min,再于4 ℃下超聲波破碎,條件為400 W超聲5 s間歇10 s,總共超聲作用5 min待菌液透明后,10 000 r/min 4 ℃離心10 min收集上清液轉(zhuǎn)移到超濾離心管(Millipore Ultra-15 10 kD)中4 000 r/min離心1 h純化濃縮。

再分別取IPTG誘導(dǎo)后重組菌液和未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液即對照組各1 mL,12 000 r/min離心1 min收集菌體沉淀。加入30 μL PBS緩沖液溶解,加入等體積的蛋白上樣緩沖液混勻,煮沸6 min,離心各取上清液10 μL上樣,進行SDS-PAGE電泳分析。同時,另取純化濃縮好的5V 10 μL在同條件下處理分析。

1.6 電鏡檢測

取濃縮的5V 20 μL在電鏡觀察。

1.7 5V DNase I、RNase A抗性鑒定及保存期試驗

1.7.1 5V的DNase I處理及鑒定

將濃縮后的5V稀釋1 000倍,分為6組,其中3組加入終濃度分別達到100 U/mL脫氧核糖核酸酶,另外3組加入終濃度為50 U/mL脫氧核糖核酸酶(DNase I),37 ℃處理1 h,加入終止液65 ℃作用15 min,之后將每一組分成2份,1份用RNA/DNA提取試劑盒抽提RNA/DNA,再去除DNA之后進行RT-PCR擴增。另一份不經(jīng)反轉(zhuǎn)錄直接PCR擴增。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.7.2 5V的核糖核酸酶抗性試驗

取100倍稀釋度的5V樣本3組,每組兩份,分別加1 mg/mL核糖核酸酶(RNase A)其中1組加10 μL,另一組加20 μL,37 ℃水浴加熱25 min,同時設(shè)立不加RNaseA處理的對照組。將所有樣品進行RNA抽提并進行RT-PCR鑒定。

1.7.3 5V保存期試驗

取稀釋100倍的5V放置在-20 ℃冰箱6個月后,分別取出3管抽提RNA并進行RT-PCR鑒定。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-MS2-5Virus質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

如圖2所示,用引物DuetUP2/T7t和pA-CYCDuetUP1/DuetDOWN1對pACYCDuet-1-MS2-5Virus質(zhì)粒進行PCR擴增,電泳結(jié)果顯示用引物DuetUP2/T7t擴增出條帶片段大小約為1 500 bp;用引物pACYCDuetUP1/DuetDOWN1擴增出條帶片段大小約為1 700 bp,兩種引物都擴增的條帶大小與目的片段相同,進一步測序結(jié)果正確。證明重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-MS2-5Virus質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M—Marker;1—陽性對照(MS2目的片段);2—陽性對照(5Virus目的片段);3、4、5—pACYCDuet-1-MS2-5Virus PCR驗證MS2片段;6、7、8—pACYCDuet-1-MS2-5Virus PCR驗證五種RNA病毒片段;9—陰性對照圖2 pACYCDuet-1-MS2-Virus質(zhì)粒PCR鑒定圖

2.2 pACYCDuet-1-MS2-5Virus/BL21(DE3)重組菌誘導(dǎo)表達及5V純化結(jié)果

如圖3所示,SDS-PAGE電泳顯示重組菌pACYCDuet-1-MS2-5Virus/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達泳道出現(xiàn)了明顯的12 kD的目的蛋白帶,而對照菌體未出現(xiàn)目的條帶,表明重組菌獲得了有效表達;經(jīng)超濾離心管濃縮純化的5V電泳泳道只出現(xiàn)了噬菌體單一衣殼蛋白單體的唯一條帶、大小約為12 kD,表明重組的5V獲得高效純化。電鏡下觀察到直徑約30 nm的5V,證明5V成功制備(圖4)。

M—Marker;1—BL21(DE3)空菌;2—未加誘導(dǎo)劑的PACYC-1-MS2-5Virus重組菌;3—加IPTG誘導(dǎo)的PACYC-1-MS2-5Virus重組菌;4—純化的5V圖3 SDS-PAGE電泳圖

圖4 5V電鏡圖40 000×Figure 4 Circular virus particles 40 000× of 5V

2.3 5V DNase I、RNase A抗性鑒定和保存期試驗結(jié)果

2.3.1 5V DNase I處理后的RT-PCR鑒定結(jié)果

M—Marker;1,9—陽性對照;2、4、6—5V稀釋1 000倍經(jīng)過100 U/mL DNase I處理后進行RT-PCR;3、5、7—5V稀釋1 000倍經(jīng)過100 U/mL DNase I處理后未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄直接進行PCR;8,10—陰性對照

M—Marker; 1—陽性對照;2、4、6—5V稀釋1 000倍經(jīng)過50 U/mL DNase I處理后進行RT-PCR;3、5、7—5V稀釋1 000倍經(jīng)過50 U/mL DNase I處理后未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄直接進行PCR;8—陰性對照圖5 5V 脫氧核糖核酸酶抗性結(jié)果圖

如圖5(a)(b)所示,瓊脂糖電泳檢測,結(jié)果進行RT-PCR的各組在1 500 bp擴增出明顯的目的條帶,而未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄直接PCR的對照組未見條帶。結(jié)果表明5V里確實包裹了五種RNA病毒基因的RNA序列,而且完全去除了5V摻雜的質(zhì)粒DNA雜質(zhì)的殘留。

2.3.2 5V RNase A處理后的RT-PCR鑒定結(jié)果

如圖6,將100倍稀釋的5V用1 mg/mL的RNase A 10 μL/20 μL處理后,提取RNA后進行RT-PCR實驗組和對照組在1 500 bp擴增出明顯的目的條帶。

M—Marker;1—陽性對照;2、3、4—5V稀釋100倍經(jīng)過10 μL RNase A處理后RT-PCR;5、6、7—5V稀釋100倍經(jīng)過20 μL RNase A處理后RT-PCR;8—陰性對照圖6 5V核糖核酸酶抗性結(jié)果圖

2.3.3 5V的保存期試驗

將5V稀釋100倍后分別放置-20 ℃冰箱6個月后進行RT-PCR鑒定,同時未進行反轉(zhuǎn)錄的5V樣品作為對照結(jié)果如圖7。

M—Marker;1—陽性對照;3、5、7—5V稀釋100倍在-20 ℃保存6個月后RT-PCR;2、4、6—5V稀釋100倍在-20 ℃保存6個月后直接PCR;8—陰性對照圖7 5V保存期試驗圖

3 討 論

近年來裝甲RNA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于核酸檢測,該技術(shù)可以通過基因重組技術(shù)將病毒靶基因片段非特異性地包裝到噬菌體病毒衣殼內(nèi)從而構(gòu)建假病毒顆粒。假病毒不能自己復(fù)制,在實驗的過程中沒有致病性,有蛋白質(zhì)外殼包裹具有耐核酸酶作用穩(wěn)定性好,制備高效,可以對核酸檢測的全過程進行質(zhì)控。據(jù)國內(nèi)外研究報道,利用裝甲RNA技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了不同的RNA病毒的裝甲RNA質(zhì)控品,包括丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)、諾如病毒(norovirus)、流感病毒(influenza virus)、寨卡病毒(zika virus)、輪狀病毒(rota virus)、風(fēng)疹病毒(rubella Virus)以及人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)、新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)等[10-16]。

理論上MS2噬菌體裝甲RNA最大的包裝片段為4 kbp[17],到目前為止報道到文獻中MS2裝甲RNA最大的外源RNA包裝長度為3 034 bp[13]。本研究制備的MS2裝甲RNA包裝的靶基因為HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2這五種病毒保守基因序列的串聯(lián)長度約1 500 bp。選擇這些病毒保守序列主要依據(jù)目前通行的國際檢測標準、行業(yè)標準，以及國內(nèi)外相關(guān)病毒檢測的文獻報道、檢測技術(shù)規(guī)范等[11,18-24]。另外根據(jù)這五種RNA病毒各自的不同地區(qū)的毒株基因全序列及多種亞型病毒基因全序列采用MEGA 3.0軟件進行比對分析后確定相應(yīng)的保守基因序列,并在進行全物種BLAST比對驗證。本研究所制備的裝載五種RNA病毒核酸片段的假病毒5V,純度高,能抵抗高濃度的DNase I和RNase A的降解,具有良好的穩(wěn)定性,而且-20 ℃條件下易于保存。假病毒5V不具備病毒的傳染性,具有良好的生物安全性。同時假病毒5V由于攜帶了五種RNA病毒(HCV、HIV-1/2、HTLV-1/2)的遺傳信息,可以同時作為這五種病毒的模擬物應(yīng)用到對病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、擴增以及核酸定量整個過程的質(zhì)量監(jiān)測,滿足在細胞制劑的產(chǎn)品檢測中對核酸陽性質(zhì)控品的基本要求。